CRISPR 基因編輯技術在擔子菌中的研究進展與應用

劉俊杰 李輝平 朱家漘,3 馬 林 徐 平 李翠新 張 良 曲紹軒,3*

（1. 江蘇省農業科學院蔬菜研究所 江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014；2. 西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224；3. 江蘇大學生命科學學院，江蘇 鎮江 212013；4. 江蘇國耳生物科技有限公司，江蘇盱眙 223001）

擔子菌被視為一類菌絲體發達且可產生子實體的真核生物，其主要特征為具有擔子的產孢結構。擔子菌與人類的生產生活息息相關，在自然循環、經濟循環、農業生態循環、大健康產業等方面都發揮重要作用[1]。大多數營養豐富的可栽培食藥用菌都屬于擔子菌，如香菇（Lentinulaedodes）、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）、糙皮側耳（Pleurotusostreatus，俗稱平菇）、靈芝（Ganodermalucidum）、猴頭菇（Hericium erinaceus）等，是人類重要的膳食組成部分。其富含的一些天然活性成分，如菌多糖、靈芝酸，可增強人體免疫力，長期食用可降低患癌癥的風險[2-3]。為充分利用其天然活性成分資源及加大對其生長發育的認識和改造，需要對靶基因進行精準的敲除、干擾或過表達等遺傳操作。自然界中，擔子菌、子囊菌以及不產生子實體的絲狀真菌都是以菌絲體作為營養體進行生長，因此多利用菌絲體進行基因編輯；也有學者利用擔孢子、孢子或子實體進行編輯[4]。但擔子菌異核性、同源重組效率低、基因干擾脫靶率高、轉化子遺傳穩定性差等問題，嚴重阻礙了真菌遺傳學的發展[5]。

核酸酶是裂解核苷酸磷酸二酯鍵的酶，可以是脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶、內切酶或外切酶、拓撲異構酶、重組酶、核酶或RNA 剪接酶[6]。細菌和古核細菌中特異性免疫響應的Cas 核酸酶在成簇規則間隔的短回文重復序列（CRISPR）指導下將入侵核苷酸進行切割沉默，為細菌和古細菌提供針對病毒和質粒的適應性免疫力，這種適應性免疫系統被稱為CRISPR/Cas 系統[6-7]。2012 年，Jinek 等提出細菌的CRISPR/Cas 系統可應用于基因編輯[8]，緊接著麻省理工學院的張鋒團隊在Science 發表論文，首次將CRISPR/Cas9 基因編輯技術改進并應用于哺乳動物和人類細胞，極大地推動了精準基因操作的進程[9]。CRISPR/Cas9 基因編輯技術首次應用于絲狀真菌距今有十年多時間[10-11]，大量的研究在一些子囊菌和擔子菌等絲狀真菌中成功實現基因編輯，然而效率卻高低不一。本文主要回顧基因編輯技術在擔子菌中的應用情況，圍繞近年在基因編輯技術優化方面（啟動子、密碼子、供體形式、轉化過程、受體形式、Cas蛋白等）的優化改進，為今后利用CRISPR/Cas 基因編輯技術滿足人們對菌類作物產量、品質、抗逆性改良等方面的農業生產需求和營養保健的健康需求提供參考。

1 擔子菌基因操作的發展

絲狀真菌的基因操作奠基于1958 年，Emerson 通過采購的纖維素酶和蝸牛酶處理粗糙脈孢菌獲得了形似原生質體的結構[12]；次年，科學家Bachmann 和Bonner 使用相似的方法獲得了高活性的粗糙脈孢菌原生質體[13]，為進一步的基因操作帶來可能。之后陸續發展的電轉法導入質粒、農桿菌轉化法（ATMT）、聚乙二醇介導法（PEG）等都基于此進行操作。Hinnen 等在釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中利用PEG 介導的方式將leu2基因成功導入leu缺陷型酵母中，在此過程中，質粒成功整合到目標酵母的染色體組中，經驗證在多個位點檢測到leu2基因[14]。此后，其在絲狀真菌中開始嘗試，例如Kelly 等利用PEG介導的方式向黑曲霉（Aspergillusniger）中導入多個帶有篩選標記的質粒，每微克獲得大約4～20 個轉化子[15]；Michael 等嘗試采用農桿菌轉化法，成功將帶有潮霉素（Hyg）抗性標記的Ti 質粒利用電激法導入到根癌農桿菌中，使其分別轉染泡盛曲霉（A.awamori）、黑曲霉、鐮孢霉（Fusariumvenenatum）、里氏木霉（Trichodermareesei）、粗糙脈胞菌（Neurosporacrassa）和雙孢蘑菇的原生質體和分生孢子，皆獲得了具有潮霉素抗性的后代[16-17]。

早先的基因操作依賴于細胞自身分裂期的同源重組現象，將外源基因整合到基因組中。該現象在自然狀態下的發生率不到百萬分之一，而在DNA 雙鍵斷裂（DSB）發生時進行基因操作概率可獲得極大提升[18]。現代基因編輯技術主要著眼于向細胞內呈遞人工生產的靶向核酸內切酶、經改造的核酸酶或能夠表達該酶的質粒載體，來定點造成DNA 雙鍵斷裂。基于這一方向，鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）、轉錄活化因子樣效應蛋白（Transcription activator-like effector，TALE）、類轉錄激活因子核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）等技術先后問世，但都被CRISPR/Cas 基因編輯技術取代[6-7]。

2 CRISPR/Cas 系統基因編輯技術在擔子菌中的應用現狀

Cas 相關蛋白是一系列與CRISPR 簇臨近的基因編碼產物，主要參與核酸解聚、剪切、聚合等修飾過程，其中目前應用最為廣泛的Cas9 是Ⅱ型CRISPR/Cas9 系統的特征蛋白，具有核酸內切酶的活性。CRISPR/Cas 的基因編輯系統在絲狀真菌中進行遺傳操作已形成一套基本的思路，即：先根據目的基因設計sgRNA、HDR（Homology direct repair）修復模板鏈、構建Cas 酶表達載體，然后制備真菌原生質體，再通過PEG 介導、電刺激等轉化方式導入編碼Cas 酶和sgRNA 的質粒或在體外制備的Cas 酶 + sgRNA復合體（RNP）。目前，基因編輯仍主要依靠DSB 出現所觸發細胞自身的同源重組現象來引入外源基因，或經非同源末端連接NHEJ（Non-homology ending join）造成移碼突變來敲除基因。而不同的修復途徑將導致截然不同的基因編輯結果，HDR 途徑會精確地敲入一段基因，使目的序列在可控范圍內發生改變，且為分子標記的引入預留了充足的空間[19]。2013 年，Dicarlo 等首先將CRISPR/Cas9 基因編輯系統引入釀酒酵母，隨后在構巢曲霉（A.nidulans）、粗糙脈孢菌、里氏木霉等多種絲狀真菌中實現了基因編輯[20]。在此基礎上，2016 年，賓夕法尼亞大學Yang Yinong 團隊首先報道了通過CRISPR/Cas9 系統成功精準編輯雙孢蘑菇多酚氧化酶（PPO）形成了抗褐變新品種，并獲得商業化應用的許可——美國農業部（USDA）不會對使用CRISPR/Cas9 基因編輯工具進行基因改造的雙孢蘑菇進行監管，這極大鼓舞了人們將CRISPR/Cas 系統應用在擔子菌特別是食藥用菌的新品種選育、定向改良、多基因功能利用、代謝途徑重構等領域的研究[21]。

我國食藥用菌CRISPR/Cas9 系統的建立主要借鑒于模式擔子菌——灰蓋鬼傘（Coprinopsiscinerea）遺傳轉化的成熟體系，最早開展基因編輯技術研究的是金針菇（Flammulinafiliformi）、靈芝和杏鮑菇（P.eryngii）[4]。華南農業大學林俊芳和郭麗瓊教授團隊2016 年最先嘗試建立了金針菇CRISPR/Cas9 基因編輯體系（圖1），該系統包含1 個Cas9 蛋白的表達載體、以金針菇的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因Fvgpd為啟動子驅動Cas9 蛋白，以潮霉素抗性基因（hph）為篩選標記，使用灰蓋鬼傘上應用成熟的Ⅲ型啟動子H1 作為sgRNA 的啟動子構建基因敲除載體，通過PEG 介導的方法成功將靶標基因轉化到金針菇原生質體內[22]。上海農業科學院尚曉冬研究員團隊2017 年同樣以Fvgpd為驅動Cas9 基因啟動子和hph為篩選標記構建Cas9 表達載體，通過ATMT 轉化法將靶基因導入金針菇單核菌株中獲得了繼代培養穩定的Cas9轉化子，實現轉化率6.84%，為金針菇建立高效的CRISPR/Cas9 基因編輯系統奠定了基礎[23]。隨后，華南農業大學林俊芳和郭麗瓊教授團隊在2018 年通過PEG 轉化法獲得了金針菇冷誘導相關的組氨酸激酶基因HK1 和HK2 的突變株，轉化率分別為24.1%和12.5%[24]；該團隊以吲哚-3-甘油磷酸合酶基因（trpC）為驅動Cas9 基因啟動子建立了隸屬子囊菌亞門的蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）的CRISPR/Cas9 基因編輯系統，但未獲得靶標基因ura3的突變株[25]，直到2022 年蛹蟲草的CRISPR/Cas 系統基因編輯技術才得到成熟應用[26]。南京師范大學陸玲教授團隊2019 年對III 型啟動子在杏鮑菇基因組中驅動sgRNA 轉錄的效率進行評估，篩選出4 個有功能的杏鮑菇內源U6 snRNA 啟動子PEU6-1、PEU6-2、PEU6-3 和PEU6-4，其轉錄sgRNA 的活性強于體外T7 啟動子的轉錄效率，最終獲得了杏鮑菇尿嘧啶營養缺陷型突變株[27]。上海交通大學鐘建江和肖晗教授團隊2020 年利用靈芝內源u6啟動子和有自我切割功能的核酶HDV 構建了一個有效的CRISPR/Cas9 系統，成功編輯了靈芝酸生物合成途徑中重要的細胞色素P450 基因cyp5150l8，為抗癌次級代謝物靈芝酸的合成和調控機理的研究提供了重要平臺[28-29]。繼美國2016 年育出第一個基因編輯的抗褐變雙孢蘑菇品種之后，國內在2020 年才報道在雙孢蘑菇原生質體中成功建立了CRISPR/Cas9基因編輯系統，同時也對PPO 酶家族PPO4 基因進行多重位點突變，獲得不同類型突變體組合以期獲得不含有轉基因成分的高效抗褐變雙孢蘑菇新品種，但結果導致菌絲發育不良，證實了PPO4 可能主要參與雙孢蘑菇的生長發育，而非抗褐變的關鍵基因[30]。

圖1 擔子菌門中的食藥用菌CRISPR/Cas9 基因編輯技術的發展

2020 年后，CRISPR/Cas9 系統在擔子菌上成功應用的報道才逐漸增多（圖1），為深入開展擔子菌基因功能研究和精準分子育種提供了無限的可能，尤其是構建出多基因敲除載體實現對基因組中多個靶位點進行編輯，為食藥用菌品種的快速改良提供了新工具。Boontawon 等運用CRISPR/Cas9 構建的敲除體系分析了與平菇雙核菌絲體形成相關的兩個關鍵基因pcc1和clp1，揭示了clp1可能是參與形成鎖狀聯合的關鍵基因[31]；Xu 等選擇平菇木質素降解相關的靶向基因vp1、vp2、vp3和62347，通過多順反子tRNA和CRISPR 引導RNA 技術（PTG）構建一種載體表達多個sgRNA 的方法，開發出了平菇多基因突變的有效遺傳工具[32]。

CRISPR/Cas 系統已作為第三代基因編輯技術在醫療、農業、生命科學基礎研究等領域備受關注，但是與大多數非模式物種一樣，該技術在食藥用菌中的發展仍存在瓶頸，可供借鑒的穩定技術體系并不多[33]。雖然除Cas9 外，近年已有其他Cas 蛋白如Cas12a（cpf1）在絲狀真菌中進行基因編輯應用[34]，但在擔子菌中至今未見報道。

3 擔子菌CRISPR/Cas 系統的優化改進策略

使用CRISPR/Cas 系統進行基因操作需要先對Cas 酶供體方案進行選擇并優化，不同的供體形式、供體類型都會影響基因編輯的效率，而不同的方案組合亦可適用于不同的應用場景。理論上，隸屬于Ⅱ類的spCas9、dCas9、Cas12a、Cas13（用于編輯RNA）等核酸酶，在經人工設計的sgRNA 的引導下，可以應用于任何細胞基因的編輯，且編輯效率遠高于上一代核酸酶。在細菌的基因操作中利用類別Ⅰ類C型Cascade-Cas3 的細菌自身CIRSPR/Cas 系統來進行多基因編輯，在銅綠假單孢菌中幾乎實現100%的編輯效率[35]。因此針對不同細胞進行基因操作時，需根據具體情況進行適應性優化，才能實現快速高效的基因編輯效率。

3.1 Cas 酶的選擇與優化

CRISPR/Cas 系統在實際應用中還是存在諸多限制，其中以脫靶效應和局限的PAM 位點（間隔序列向兩端延伸的幾個堿基都十分保守，通常由NGG 三個堿基構成）兩方面最為突出，最初應用的spCas9就存在PAM 位點必須為“NGG”的限制。隨著對CRISPR/Cas 家族研究的不斷深入，Cas12、Cas13 等蛋白的發掘與應用極大地拓寬了應用范圍[36]。

區別于Cas9，隸屬于Ⅱ類V 型的cpf1（即Cas12a）與sgRNA 形成復合體時無需tracrRNA，僅通過單條42～44 個堿基的crRNA 便可以形成，因此其大小不到Cas9 的一半。更為重要的是，Cpf1 的切割位點位于PAM（T-rich）位點下游ts（target strain）序列23 bp，nts（none-target strain）序列18 bp 處，這就意味著其切割后斷裂的區域天然地形成一個粘性末端，理論上來說這更加有利于帶有同源臂的模版DNA與切口結引發HDR 修復途徑[36]。CRISPR/Cpf1 系統在人類、小鼠細胞中的應用先例非常多，但在絲狀真菌中的報道并不多。最早Vanegas 等在曲霉中構建Cpf1 載體成功敲除yA、albA兩個基因，通過孢子顏色改變作為篩選標記[37]；Kwon 等在嗜熱假絲酵母（Thermothelomycesthermophilus）中分別使用來自弗朗西絲菌（Francisellanovicida）FnCpf1、氨基酸球菌（Acidaminococcussp.）AsCpf1 及釀膿鏈球菌（Streptococcuspyogenes）spCas9 三種Cas 酶通過RNP 導入的方法來編輯alp1、pks4.2、snc1、ptf14 個基因。結果顯示，在pks4.2基因編輯組中，FnCpf1 和AsCpf1 的敲除效率分別是36%和10%，spCas9 可達到97%；在snc1基因編輯組中FnCpf1 與AsCpf1 的敲入效率達到52%和49%，而spCas9 為0；在alp1基因編輯組中FnCpf1和AsCpf1 的敲除效率達到91%～92%，而spCas9 僅有20%；在ptf1基因編輯組中，僅有spCas9 有20%的效率，Fncpf1為6%[38]。該研究揭示了不同的Cas 酶在不同的編輯方案中有著不同的效率，Cas9 高效作用于基因敲除，而在需要HDR 編輯的組別中卻捉襟見肘，而兩種Cpf1 在此時展現出了更高的編輯效率。同時，在編輯不同基因時效率也不盡相同。此外，Cpf1 在核黃菌（Ashbyagossypii）和棘孢曲霉（A.aculeatus）[39]中都有所報道，在多基因編輯和HR 途徑誘導中表現出了更高的效率。因此合適的Cas 酶可以有效提升基因編輯效率，Cas9 系列更適用于基因敲除，而Cas12a 系列則更偏向于有HR 途徑需求的基因編輯中。

以上兩種是最基本的Cas 蛋白，不難發現局限的PAM 位點依然不可能適用于所有的場景。在Cas 蛋白結構中，PAM 序列主要位于NUC 結構域附近的WED、PI 結構域之間，而PAM 序列正是通過與PI 結構域中的氨基酸殘基相互作用而起到特異性識別的作用。因此，通過對WED 與PI 結構域的改變，可以讓Cas 蛋白識別并敲除任意感興趣的位點。目前，數據庫中已發表有超過1 000 種Cas9 蛋白序列[40]，如：可高效編輯水稻基因，且識別位點為NGAN、NGCG 的SpCas9 VQR；用來糾正三倍致病性SNPs，識別位點為NG、NNG、GAA、GAT 和CAA 的xCas9-3.7 等，都結合實際情況采用定制化的Cas 蛋白實現了高效編輯的效果。

3.2 供體Cas 酶形式的選擇優化

依托Cas 酶進行基因編輯依賴于其是否可在目的細胞內發揮作用。通過構建表達載體實現Cas 酶的體內表達是目前采用最為廣泛的供體方案。在真菌細胞借助PEG 介導來進行編輯基因編輯時被廣泛采用（表1）。Liu 等最先通過構建表達載體將CRIPR/Cas9 系統應用于里氏木霉，靶向敲除了其中的ura5基因，使其獲得對5-FOA（氟乳清酸）的抗性，該靶標在多種真菌中被證實有效（野生型菌株中ura5的表達會將5-FOA 轉化為具有細胞毒性的5-氟尿嘧啶）[57]。此后，CRISPR/Cas9 載體轉化的方法相繼被用于產黃青霉（Penicilliumchrysogenum）、煙曲霉（A.fumigatus）、卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）等研究中[58-60]。

表1 擔子菌CRISPR/Cas9表達載體優化策略和編輯效率

通過構建質粒表達載體對擔子菌進行基因編輯時，需考慮以下方面：首先是密碼子優化。異源表達對于靶細胞來說具有細胞毒性，因此在選擇好合適的Cas 蛋白后，應根據靶細胞的密碼子先進行同義替換來適應性地優化密碼子；其次，載體應添加與靶細胞相適應的核定為信號（NLS，在真菌報道中SV40是常見的NLS[61]）并選擇合適的抗性標記，例如Cbx、Hyg、頭孢霉素（Cef）等曾在真菌基因編輯中被報道[41,44]；最后，選擇合適的啟動子來編碼Cas 蛋白的轉錄翻譯，tef1、gpdA、trpC啟動子曾被報道于構巢曲霉中成功表達[62]。

利用表達載體實現Cas 酶的體內表達依然存在一些不可避免的風險：第一，存在同源序列的質粒有一定概率被整合到靶細胞基因組中，持續表達CRISPR/Cas 系統，在多次傳代后，其不穩定遺傳將造成難以預料的大規模脫靶效應；第二，多質粒呈遞過程中，獲得剛剛好的陽性轉化子的概率并不高，因此多個途徑的抗性篩選標記很重要；第三，某些稀有真菌可參考的基因數據有限，無法保證啟動子的有效表達。同時，這一技術路線非常依賴目的細胞內的客觀條件，啟動子選擇、密碼子優化、抗性標記等客觀條件都會影響基因編輯效率，從而大幅拉長試驗周期。以上問題可采用RNP 作為另一條技術路線而有所改善。

Umeyama 等通過呈遞RNP 的方式，在煙曲霉菌（A.fumigatus）中成功敲除了蛋白Cyp51A[63]，Jan Vonk等在試管中合成并預先組裝sgRNA+RNPs 復合體，以及修復模板鏈，通過PEG 介導的方式一起導入裂褶菌（Schizophyllumcommune）中實現了hom2基因的成功敲除[54]；此外RNP 途徑先后在鐮刀菌（F.oxysporum）、灰霉菌（Botrytiscinerea）、里氏木霉（T.reesei）中都有所報道[64-66]。

RNP 策略存在編輯效率不穩定，在前述裂褶菌中甚至不到1%，因而在目前的基礎上同樣有很大優化空間。基于現有研究，推測造成RNP 編輯效率不穩定的原因主要是真菌原生質體的體積過小，限制了RNP 復合體的穿膜效率。Zou 等基于此，在對里氏木霉和蛹蟲草的基因編輯中，于PEG 介導原生質體導入RNP 復合物的階段，使用了0.006%的Triton X-100 孵育25 分鐘增加細胞膜通透性，使用肌醇以大幅增加原生質體中單核細胞的比率，并輔以苯菌靈在加強單核細胞比率的同時使細胞周期同步化，最終在里氏木霉和蛹蟲草中實現100%的編輯效率，其中在里氏木霉中HR 的發生率更是達到56.52%[67]。因此，在合適的優化手段與之匹配的情況下，RNP 可以作為更高效可靠的供體形式。

隨著技術的改進，適用于RNP 的體外非細胞蛋白合成體系已相當成熟，相比傳統的異源細胞表達體系來說，試驗周期更短，獲得的Cas 酶純度更高。這些優勢正將RNP 推向主流的供體形式。然而，擁有強大的工具并不意味著就可實現高效編輯，目的擔子菌細胞的客觀條件也不容忽視。

3.3 宿主受體優化

早先的研究發現，真菌強大的Ku 異源二聚體活性極易引導NHEJ 修復途徑，很難觸發基因斷裂后的HDR 修復，從而造成試驗預設以外的突變。真菌Ku70/Ku80 是一種能夠與DNA 結合的異二聚體，可與DNA 依賴蛋白激酶（DNA-pkcs）、DNA 連接酶IVXRCC4 復合物和核酸外切酶形成多蛋白復合體，在DNA 發生雙鍵斷裂時快速滑向缺口，激活NHEJ 通路[68]。CRISPR/Cas 系統是否能躲避真菌宿主的免疫系統實現靶基因的編輯，是影響真菌高效基因編輯的又一重要因素。

Abdallah 等則通過RNP 的手段，在經ku80基因敲除改造的煙曲霉菌株中進行基因編輯，在同源臂長度為50 bp 的實驗組中HR 發生率高達74%[69]。Ku70/Ku80 的敲除已在20 多個物種（主要為子囊菌）中證實，其被敲低或敲除后HR 的發生率大大提高（50%～100%）。并且一項平菇Ku70/Ku80 的敲除試驗表明，經轉化后的平菇樣本菌絲活力、生長周期及子實體性狀與野生型基本保持一致[70]。故在執行基因操作前先行制備Ku70/Ku80 等參與NHEJ 基因的敲除或沉默的工程菌株，幾乎是高效率HDR 編輯的前提。

4 總結及展望

過去的基因編輯工具因成本高昂往往很少應用于絲狀真菌，尤其是大部分非模式絲狀真菌。CRISPR/Cas 系統相對較低的成本及優化門檻，給絲狀真菌基因功能的研究帶來了更多可能性。擔子菌作為含豐富天然產物的大型真菌資源，其沒有復雜的內含子作為干擾，更容易作為細胞工廠來生產人們所需要的物質。可產生子實體的大型食用真菌，不僅僅是健康膳食的重要組成部分，更有諸多證據證實其對人體健康的益處。此外，其在自然界中分解者的角色和易生長的特性，也不失為未來空間探索的優秀食源。故深入探究其內在分子機制及關鍵物質的代謝途徑非常重要。

目前，在擔子菌中廣泛應用CRISPR/Cas 系統進行品種改良還存在諸多難點，有報道顯示CRISPR/Cas的操作會對菌株生長發育產生負面影響。而擔子菌中神秘基因簇是海量的，因而優化成本更低且可高通量多基因編輯的CRISPRa 和CRISPRi 未來可能更具優勢[71-72]。

目前CRISPR/Cas 系統在擔子菌代謝途徑研究、工程菌優化、病原菌防治、遺傳育種等多個領域顯現出極大的潛力，在各菌種中的成功案例不斷增多，可供借鑒的優化方案也會越來越多，這項技術在擔子菌中廣泛應用也勢必擁有更為廣闊的未來[53,72-73]。