新型牛乳鐵蛋白衍生肽LFcinB-W的抗感染作用

閆永平, 肖桂然, 吳 磊, 李廣瑩

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

抗生素耐藥問題產生的臨床和公共衛生負擔已成為困擾全世界的大問題[1]。基于目前的醫療情況和抗菌藥物的研究進展,文獻[2]對未來30 a全球抗生素耐藥情況作出了預測:至2050年,抗生素耐藥每年將會導致世界上1 000萬人死亡,明顯高于癌癥的致死人數,尋找有效的抗生素替代品迫在眉睫。牛乳鐵蛋白肽(bovine lactoferricin,LFcinB)(WQWRM KKLGA PSITC VRRAF)具備抗菌、抗病毒、抗氧化、抗癌等生物活性,有望替代抗生素成為一種安全、綠色、高效的理想抗菌劑,在醫療、食品、飼料和保鮮等領域展現出廣泛的應用前景,而成為研究和關注的熱點[3-6]。抗菌肽商品化開發中的兩大難點是來源不足和穩定性低。牛體內牛乳鐵蛋白肽的含量很少,天然分離 LFcinB 產量低、工藝復雜、費用較高;人工合成LFcinB 及其衍生物成本更高,不適合工業化生產,無法廣泛普及應用,成為LFcinB廣泛應用的制約因素[7]。因此,利用轉基因技術將LFcinB轉入其他生物,利用生物工程發酵技術實現低成本、產品質量穩定的生產,是解決生產生活中LFcinB來源不足最具潛力的途徑。研究抗菌肽結構功能關系,通過對抗菌肽兩親性參數、凈電荷數、疏水性參數等理化參數的改變獲得具有更高生物活性的衍生肽是解決穩定性低的最佳方案,成為近年來的研究熱點[8]。文獻[9]為確定對抗菌活性重要的特定氨基酸,對牛乳鐵蛋白肽進行了丙氨酸掃描,發現2個Trp殘基(trp6和trp8)被丙氨酸替換后會導致其抗菌活性降低;文獻[10]將牛乳鐵蛋白衍生肽中的Trp含量增加5個殘基后得到的多肽則顯示出顯著的抗菌活性增加,表明其對抗菌活性是絕對必要的;文獻[11]設計并表達了牛乳鐵蛋白肽衍生肽LFcinB-W4,10,且經檢測發現其對金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性。

本研究以牛乳鐵蛋白肽LFcinB為母肽,以提高其高電荷、強疏水性為目標,依據對稱結構設計理念,引入色氨酸(Trp)替換,設計出新型衍生肽LFcinB-W經過生物信息學工具比較分析,LFcinB的第1位、第3 位和第7位氨基酸被色氨酸(Trp)替換后能夠保持與原肽相似的空間結構,其靜電荷數與原肽相同,疏水殘基比例提高到60%,且通過抗菌肽數據庫預測其抗菌活性更高。利用畢赤酵母GS115成功表達出衍生肽LFcinB-W,使用瓊脂板擴散法檢測到衍生肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性比母肽LFcinB高2倍,并利用革蘭氏陰性菌Erwiniacarotovoracarotovora15(Ecc15)刺激果蠅腸道,探究LFcinB-W在果蠅天然免疫中起作用,結果表明,LFcinB-W在體內可以有效緩解病原體感染對果蠅造成的損傷,具有比LFcinB更好的抗感染療效。研究結果表明,第1位、第3位和第7位氨基酸經色氨酸Trp替換后的牛乳鐵蛋白肽衍生肽具有很好的抗感染療效,實驗為進一步探究牛乳鐵蛋白衍生肽生物活性的改進奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質粒與菌株

表達載體pPIC9K(Invitrogen公司),畢赤酵母GS115、金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸桿菌ATCC25922、枯草芽孢桿菌ATCC6051、ECC15(本實驗室保藏),DH5α(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.1.2 衍生肽氨基酸序列與基因序列

氨基酸序列:WKWRR WWWRM KKLGA PSITC VRRAF。

基因序列:TGGAAATGGAGAAGATGGTGGTGGAGATGAAAAAATTGGGTGCTCCAAGTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTT。

引物序列:

F:5’-AATTCTGGAAATGGAGAAGATGGTGGTGGAGATGAAAAAAATTGGGTGCTCCAAGTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTTT AAGC-3’。

R:5’-GGCCGCTTAAAAAGCTCTTCTAACACAAGTAAACTTGGAGCACCCAATTTTTTTCAT CTCCACCACCATCTTCTCCATTTCCAG-3’。

1.1.3 酶與試劑

EcoRⅠ、NotⅠ、T4 DNA 連接酶購于New England Biolabs公司,LB肉湯培養基、LB瓊脂培養基、氨芐青霉素(ampicillin,Amp)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、DNA膠回收試劑盒、質粒DNA小量抽提試劑盒、DNA 分子量標準Marker M (250～10 000 bp)、DNA 分子量標準Marker M (100～2 000 bp)均購于生工生物工程(上海)股份有限公司,GoldView Ⅰ型核酸染料購于上海索萊寶生物科技有限公司,瓊脂糖、瓊脂粉均購于Biofroxx公司,2×PCR Master Mix購于北京博邁德基因技術有限公司。

1.1.4 儀器與設備

微量高速離心機(Thermo Scientific)、超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)、全波長酶標儀(Thermo Scientific)、凝膠成像分析系統(美國伯樂 BIO-RAD 公司)、Western Blot電泳槽(上海天能科技有限公司)、電熱恒溫培養箱(上海博迅醫療生物儀器股份有限公司)、恒溫培養振蕩器(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 衍生肽的設計改造

利用抗菌肽數據庫(antimicrobial peptide database,APD)(http://aps.unmc.edu/AP/main.html)和ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)蛋白分析工具,對比分析LFcinB和LFcinB-W的理化參數;用建模工具SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)對其空間結構進行模擬,并利用APD 和CAMP(http://www.camp.bicnirrh.res.in/)[12]預測衍生肽的抗菌活性。

1.2.2 目的基因的獲取

以SnapGene提供的畢赤酵母密碼子優化表為參考,設計LFcinB-W氨基酸序列對應的堿基序列。將設計好的衍生肽基因序列交由生物公司以引物的形式合成。

1.2.3 重組質粒表達載體的構建

將用于表達載體構建的質粒pPIC9K通過熱激轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞,挑取陽性轉化子大量培養以擴增質粒,使用Qiagen Plasmid Midi Kit試劑盒提取質粒后用限制性核酸內切酶EcoRⅠ和NotⅠ對質粒進行雙酶切。使用 T4 DNA 連接酶對雙酶切獲得的線性化pPIC9K 與退火形成的目的基因進行連接,構建重組表達載體pPIC9K-LFcinB-W。

1.2.4 抑菌性檢測

利用畢赤酵母GS115分泌性表達衍生肽,并使用瓊脂擴散法檢測上清液的抑菌活性,指示菌為金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(ATCC25922)和枯草芽孢桿菌(ATCC6051)。

1.2.5 果蠅壽命實驗

挑選20只已經饑餓脫水2 h的成蟲果蠅,置于加有ECC15菌液(A600=200)的飼養管或只加5%蔗糖的飼養管,于29 ℃果蠅培養箱中培養。每24 h將果蠅轉移至正常食物的飼養管中,剔除死亡果蠅并計數,至各組果蠅全部死亡,每組10管。

1.2.6 果蠅腸道形態學變化觀察

收集常規培養基中羽化2～3 d的雌蠅,經過24 h染菌處理后,在解剖盤中分離出12～15條完整果蠅腸道,于熒光顯微鏡明場下拍攝腸道形態,并統計分析腸道的長度和單側表面積,重復3次獨立實驗。

1.2.7 數據統計與分析

利用Image J軟件統計腸道長度及表面積,SPSS 19.0 軟件處理實驗數據,實驗結果均為(平均值±標準差),組間統計差異使用One way ANOVA 檢驗,顯著性水平:NS表示無顯著性差異,*表示P< 0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2 結果與分析

2.1 LFcinB-W基因的設計與合成

利用生物信息學工具對比分析LFcinB和LFcinB-W的理化參數結果見表1所列。由表1可知,衍生肽LFcinB-W相較于原肽疏水殘基比由48%提升至60%,其凈電荷數未發生改變,均為+8。利用同源建模工具SWISS-MODEL模擬的牛乳鐵蛋白肽LFcinB和衍生肽LFcinB-W的空間結構如圖1 所示。圖1中:灰色為α-螺旋;黃色為β-折疊;藍色為轉角。

圖1 LFcinB和LFcinB-W空間結構對比

表1 理化參數分析

由圖1可知,衍生肽LFcinB-W與原肽結構相似,因此預測衍生肽LFcinB-W具備與原肽類似的生物學功能。

抗菌活性預測結果見表2所列,由表2可知,衍生肽的各項預測數據都高于原肽,表明衍生肽LFcinB-W的設計在理論上是合理的。

表2 抗菌活性預測結果

根據畢赤酵母密碼子偏好性,優化人工設計的衍生肽的基因序列,用化學合成法合成LFcinB-W基因片段克隆到巴斯德畢赤酵母分泌型表達栽體 pPIC9K中,獲得的重組質粒pPIC9K-LFcinB-W通過限制性內切酶酶切線性化,電擊法轉化畢赤酵母GS115宿主菌,篩選得到高拷貝轉化子,如圖2所示。

圖2 酵母陽性轉化子

2.2 抑菌性檢測

陽性克隆經甲醇誘導表達LFcinB-W,誘導表達3 d,取上清1 mL利用瓊脂擴散法檢測衍生肽的抑菌活性,結果如3所示。圖3中:1～2為LFcinB的抑菌圈;3～4為LFcinB-W的抑菌圈;5為陽性對照50 mg/mL氨芐青霉素。

圖3 抑菌活性檢測

LFcinB和LFcinB-W對不同菌種抑菌圈直徑的影響如圖4所示。由圖4可知,LFcinB-W對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑約為LFcinB的1.52倍,說明衍生肽表現出比原肽更高的抑菌活性,此外LFcinB-W對大腸桿菌及枯草芽孢桿菌表現出優于LFcinB的抗菌活性,說明成功表達出具有更高抑菌活性的衍生肽LFcinB-W,且對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有良好抗菌活性。

圖4 相對抑菌圈直徑

2.3 LFcinB-W對果蠅壽命的影響

為檢測LFcinB-W在果蠅體內的活性,利用致病菌ECC15口腔感染野生型果蠅W1118構建 果蠅結腸炎模型。不同食物組對果蠅壽命的影響如圖5所示,圖5中NF表示正常食物組。由圖5可知,感染后的果蠅在14 d時全部死亡,存活率為50%時感染組的中期壽命為10 d,而添加LFcinB-W后被延長至21 d,添加LFcinB后被延長至15 d,表明食物中添加LFcinB-W可以效緩解腸道感染引起的果蠅壽命降低的現象,且LFcinB-W比LFcinB活性更高。

圖5 不同食物組對果蠅壽命的影響

2.4 衍生肽對果蠅腸道損傷的影響

野生型果蠅W1118感染病原體ECC15后,其腸道會縮短[12]。因此利用ECC15感染野生型果蠅W1118分析不同食物組果蠅的腸道形態變化,如圖6a所示,果蠅在感染后,腸道長度明顯縮短,未感染的果蠅腸道形態完整,長度正常,而LFcinB-W組的果蠅在感染后明顯挽救了腸道縮短的表型。對果蠅腸道長度及單側表面積統計分析結果如圖6b、圖6c所示。由圖6b、圖6c可知,LFcinB-W組比感染組腸道平均長度增加了27.87%(P<0.001),腸道平均單側表面積增加了31.66%(P<0.001),表明LFcinB-W可以提高果蠅腸道的免疫力,減輕由病原體感染引起的腸道損傷,維持腸道正常形態及緩解由感染引起的腸道縮短的現象,且具有比LFcinB更好的抗感染作用。

圖6 果蠅腸道形態、長度及表面積統計

3 討 論

抗菌肽極有可能成為新一代綠色環保抗菌新藥物,成為國內外動物和人類醫學、營養學、飼料(食品)學和免疫學等領域研究和開發的熱點。利用轉基因技術將LFcinB及其衍生肽轉入其他生物表達,是解決LFcinB來源不足極具潛力的途徑。許多研究揭示了LFcinB活性中心和重要殘基與其抗菌活性之間的重要關系。

本文利用生物信息學工具,以LFcinB為模板改造設計出對其原有的氨基酸進行突變的衍生肽LFcinB-W,旨在獲得更高活性的抗菌肽。利用酵母表達系統中分泌性表達了衍生肽,初步檢測后發現,其對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有很強的抗菌活性,且其抗菌活性明顯強于原肽,文獻[12]報道果蠅、野生型果蠅W1118感染病原體ECC15后,對腸道造成損傷,并出現腸道縮短現象,本文通過喂食果蠅衍生肽,有效緩解了感染所引起的損傷,證明LFcinB-W在體內仍具有良好的抗感染作用,為衍生肽的改造設計及生產利用提供一定的參考。