差異過篩法體外分離培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞及其鑒定*

劉海琴， 張帆， 李柏霖， 唐元瑜△

差異過篩法體外分離培養(yǎng)原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞及其鑒定*

劉海琴1， 張帆2， 李柏霖3， 唐元瑜3△

（1海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院上海長征醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200003；2福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122；3福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

采用差異過篩法培養(yǎng)純度高、活性好的原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（BMECs）。取4周齡SD大鼠腦皮質(zhì)，經(jīng)剪碎、細胞篩網(wǎng)過濾、收集網(wǎng)下濾過物、II型膠原酶消化后，置于CO2培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)。通過細胞形態(tài)學(xué)觀察、血管性血友病因子（vWF）免疫細胞化學(xué)染色鑒定所培養(yǎng)的目的細胞。培養(yǎng)24 h后血管段周圍爬出短梭形的細胞；48 h后島嶼狀的細胞集落形成；72 h后細胞鋪滿瓶底，呈典型的單層、鋪路石樣、鑲嵌式貼壁生長；免疫細胞化學(xué)染色顯示，所培養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)呈現(xiàn)棕紅色，vWF表達為陽性。差異過篩法能夠成功分離培養(yǎng)出原代大鼠BMECs。

腦微血管內(nèi)皮細胞；原代培養(yǎng)；差異過篩法；血管性血友病因子；大鼠

腦微血管內(nèi)皮細胞（brain microvascular endothelial cells， BMECs），不僅是構(gòu)成血腦屏障的細胞組份之一，而且還是體內(nèi)重要的內(nèi)分泌和代謝器官［1］。它在維持腦血管的通透性、調(diào)節(jié)腦組織與血液間的物質(zhì)交換、平衡血液凝固纖溶系統(tǒng)、合成和分泌與血管平滑肌舒張/收縮相關(guān)的細胞因子以及調(diào)控免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是開展腦卒中、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)病變和構(gòu)建血腦屏障的重要載體和工具細胞［2-3］。

目前國內(nèi)外尚未報道建株成功的大鼠BMECs，研究者只能從原代培養(yǎng)入手開展相關(guān)實驗研究。自Panula等［4］首次成功分離培養(yǎng)出大鼠BMECs以來，國內(nèi)外學(xué)者多以物理過篩法［5-6］、化學(xué)酶消化法［7-8］和組織塊法［9-10］進行BMECs的培養(yǎng)。其中，化學(xué)酶消化法因操作繁瑣、需要使用昂貴的膠原酶/分散酶，常導(dǎo)致實驗成本偏高，并且化學(xué)酶的作用時間也較難把握；組織塊法則存在組織塊不易貼壁、易受雜細胞污染等弊端；而物理過篩法也常因篩網(wǎng)質(zhì)量、操作手法等不同而導(dǎo)致實驗結(jié)果缺乏穩(wěn)定性，差異性較大，重復(fù)性較差。針對以上不足，本課題組參考國內(nèi)外相關(guān)文獻，結(jié)合有限課題經(jīng)費，積極改良和優(yōu)化BMECs的原代培養(yǎng)方法，采用實驗成本較低的差異過篩法成功培養(yǎng)出了數(shù)量足夠、活性較好、純度較高的大鼠BMECs。現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報道如下。

材料和方法

1　動物

SPF級4周齡的Sprague-Dawley大鼠4只，雌雄不拘，購自上海斯萊克動物有限責任公司，動物質(zhì)量合格證號為SCXK（閩）2022-0004。

2　主要試劑

胎牛血清和M199培養(yǎng)液購自Gibco；肝素購自南京新百藥業(yè)有限公司；II型膠原酶購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司；Trition X-100購自Solarbio；兔抗大鼠血管性血友病因子（von Willebrand factor， vWF）抗體購自北京博奧森生物科技公司；生物素標記的羊抗兔IgG、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（streptavidin-biotin complex， SABC）細胞免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine， DAB）試劑盒均購自武漢博士德生物公司。

3　實驗方法

3.1大鼠BMECs的原代培養(yǎng)選取4周齡SD大鼠4只，予75％酒精浸泡消毒、斷頸處死后，剪開顱骨，用無菌眼科鑷取出大腦皮質(zhì)。在玻璃培養(yǎng)皿中去除腦干、小腦及皮質(zhì)表面的軟腦膜、大血管等。用眼科剪把大腦皮質(zhì)剪碎成大小約1mm×1 mm×1 mm的組織小塊，并將其轉(zhuǎn)移至孔徑為150 μm的細胞篩網(wǎng)上過濾，所得濾液再通過75 μm細胞篩網(wǎng)，收集網(wǎng)下濾液至15 mL錐底離心管內(nèi)；500×離心5 min，棄上清，向沉淀中加入5 mL 0.1％ II型膠原酶，37 ℃水浴震搖消化15～20 min；PBS液漂洗消化后的沉淀物，予M199完全培養(yǎng)液4 mL吹打混勻重懸，接種于50 mL Nunc培養(yǎng)瓶中，并將其靜置于37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中，每隔24 h換液1次。

3.2大鼠BMECs的形態(tài)學(xué)觀察將培養(yǎng)有BMECs的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)、貼壁、出芽及融合等生長狀況，并拍照記錄。

3.3大鼠BMECs中vWF免疫細胞化學(xué)染色接種于培養(yǎng)皿中的BMECs增殖生長接近80%融合度時，用PBS漂洗5 min×3次，繼而滴加預(yù)冷的4％多聚甲醛，常溫固定細胞15 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加0.3% Triton X-100常溫透膜溶脂15 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加5%牛血清白蛋白室溫封閉非特異性抗原20 min；甩棄封閉液，滴加1∶300稀釋的兔抗大鼠vWF多克隆抗體，置于濕盒中4 ℃過夜；PBS漂洗5 min×3次，滴加羊抗兔IgG（Ⅱ抗），37 ℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次，滴加SABC，37 ℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次，DAB室溫顯色2 min；PBS再次漂洗后，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

結(jié)果

1　大鼠BMECs形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察可見，接種于培養(yǎng)瓶中的腦微血管段呈長短不一的單枝短棍狀，或收縮折疊成串珠樣（圖1）。培養(yǎng)24 h后，血管段呈“蜈蚣樣”出芽生長，在其周圍爬出短梭形或多角形的內(nèi)皮樣細胞（圖2A～C）；48 h后可見島嶼狀或團簇樣分布的細胞集落形成（圖2D～F）。72 h后集落逐漸融合（圖3A～C），細胞鋪滿瓶底，呈典型的單層鵝卵石樣鑲嵌式貼壁生長（圖3D～F）。

Figure 1.　Observation of primary rat brain tissues and brain microvascular segments. A： appearance of SD rat brain tissues； B and C： the cerebral microvascular segments appeared as short sticks. Scale bar=50 mm （A）， 200 μm （B） or 100 μm （C）.

Figure 2.　"Budding" and island-like cell clusters of brain microvascular cells. A， B and C： after 24 h， the vascular segment grew， with short spindle-shaped cells crawling out； D， E and F： after 48 h， cell colonies were gradually formed. Scale bar=200 μm （A， B， D， E and F） or 100 μm （C）.

Figure 3.　Fusion and spreading of cell clusters with an island-like shape. A， B and C： cell colonies gradually fused； D， E and F： after 72 h， the cells exhibited a cobblestone-like arrangement， and covered the bottom of the bottle in an inlaid pattern. Scale bar=200 μm （A to E） or 100 μm （F）.

2　大鼠BMECs中vWF免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果

采用免疫細胞化學(xué)染色檢測vWF，鏡下可見胞質(zhì)淡染成棕紅色，陽性細胞率達99%以上（圖4A、B）；蘇木素襯染胞核，顯示為藍色（圖4C）。

Figure 4.　Expression of von Willebrand factor （vWF） detected by immunocytochemical staining. Brownish yellow staining in the cytoplasm indicated positive vWF expression （A to C）， while hematoxylin staining （blue） indicated the nuclei （C）. Scale bar=100 μm （A） or 50 μm （B and C）.

討論

差異過篩法的基本原理是使大腦皮質(zhì)先后通過兩種孔徑大小不同的細胞篩網(wǎng)，以去除大的神經(jīng)組織塊和大血管等，避免后續(xù)原代培養(yǎng)工作中出現(xiàn)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、平滑肌細胞、血細胞等雜細胞污染，并可減少消化時使用的昂貴膠原酶的用量，以縮短消化時間，提高消化效率，最終高效地獲得純度較高、數(shù)量足夠的BMECs。因其操作簡單、污染機率小、實驗成本低，不需要使用高速離心機和昂貴的白蛋白分離液，即可獲得純度較高的BMECs，是近年來深受廣大研究者喜歡的體外分離原代BMECs的常用方法之一。

選擇合適孔徑大小的細胞篩網(wǎng)是實施差異過篩法體外培養(yǎng)大鼠BMECs的關(guān)鍵，因為它涉及原代BMECs培養(yǎng)后期目的細胞的純化問題。而細胞篩網(wǎng)的孔徑大小與其目數(shù)相關(guān)。一般而言，篩網(wǎng)孔徑（μm）=15 000/目數(shù)，如常用的100目篩網(wǎng)，其孔徑為150 μm，200目篩網(wǎng)孔徑則為75 μm。細胞篩網(wǎng)是目前分選管徑大小不同的腦微血管進行體外培養(yǎng)BMECs的簡易工具之一。

微血管是構(gòu)成腦微循環(huán)的基本結(jié)構(gòu)單位之一，包括微動脈、微靜脈和真毛細血管［11］。其中，微動脈管徑較小，僅為7～9 μm，微靜脈管徑較大，為40～150 μm，真毛細血管則為20～30 μm。在進行體外組織細胞培養(yǎng)時，微血管的管徑越趨于粗大，其周圍出現(xiàn)平滑肌細胞的可能性也就越大。實驗研究表明，在149 μm篩網(wǎng)上收集到的較粗大微血管段所培養(yǎng)出的細胞，經(jīng)倒置顯微鏡進行形態(tài)學(xué)觀察、透射電鏡對Weibel-Palade小體和細胞器的觀測，以及vWF免疫細胞化學(xué)染色的檢測，其鑒定結(jié)果多為平滑肌細胞［12-13］。所以，原代BMECs的培養(yǎng)應(yīng)盡量選用孔徑小的細胞篩網(wǎng)以獲得管徑較小的微血管段，這樣可達到減少血管平滑肌細胞污染、提高BMECs純度的目的。

早在上世紀70年代，研究者采用微孔過濾法首次獲得并觀察到大鼠腦微血管的直徑在300 μm以下［14］。而在培養(yǎng)原代大鼠BMECs時，若采用200目和250目兩種孔徑不同的篩網(wǎng)連續(xù)過濾腦組織，可獲得管徑為61～74 μm的微血管段［5］；采用100目和200目雙層篩網(wǎng)，則可獲得75～150 μm的微血管段［15-16］。這種不同孔徑的連續(xù)過篩法比僅使用單層篩網(wǎng)過濾的效果好，它既能除去較大組織塊和大血管段，又能達到收集微血管段的目的［17］。而本課題組所采用的連續(xù)差異過篩法，雖然篩網(wǎng)仍然選用的是孔徑為150和75 μm的雙層篩網(wǎng)，但我們探索出的是完全不同于以往研究者使用的過篩方法，即通過收集75 μm篩網(wǎng)以下的濾液，確保了獲得的是管徑更為細小的微血管段，并且體會到：在濾液通過最后一道75 μm篩網(wǎng)時，可適度左右傾斜、晃動篩網(wǎng)，盡量讓濾液因其重力而自由濾下，宜避免施加外力，過度沖洗，以防止篩網(wǎng)上的大血管順勢流下，進入到75 μm篩網(wǎng)下的濾液中；同時適當增加過篩面積，避免篩網(wǎng)網(wǎng)眼堵塞，以提高微血管的濾過率。最后，細胞形態(tài)學(xué)觀察和vWF免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果提示，所培養(yǎng)的目的細胞形態(tài)勻質(zhì)性較高，雜細胞污染較少，BMECs純度較高，陽性細胞率高達99％以上。

總之，本課題組采用差異過篩法，將剪碎的腦組織先后依次通過150和75 μm篩網(wǎng)，最后收集網(wǎng)下濾液，從而分離出了管徑更為細小的微血管，所培養(yǎng)的目的細胞勻質(zhì)性更高，很好地解決了原代BMECs的細胞純化問題，成功建立了一種操作簡便，重復(fù)性強，可培養(yǎng)出純度高、活力強的原代大鼠BMECs的培養(yǎng)方法，這亦為體外血腦屏障的建立及腦血管疾病的研究奠定了重要的細胞生物學(xué)實驗基礎(chǔ)。

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Utilizing differential sieving method for culturing primary rat brain microvascular endothelial cells

LIU Haiqin1， ZHANG Fan2， Li BoLin3， TANG Yuanyu3△

（1，，，200003，；2，，350122，；3，，350122，）

To establish a method for isolating and culturing primary rat brain microvascular endothelial cells （BMECs） with high purity using the differential sieving technique.Brain tissue from 4-week-old SD rats was minced， passed through a cell strainer， and digested with type II collagenase to obtain brain microvascular segments， which were then placed in a CO2incubator for primary culture. The cells were identified by morphological observation and immunocytochemical staining for von Willebrand factor （vWF）.After 24 h of culture，short spindle-shaped endothelial cells migrated out from the microvascular segments. Forty-eight hours later， the cells formed island-like colonies. After 72 h， the cells covered the bottom of the container and exhibited a typical cobblestone-like pattern. Immunocytochemical staining for vWF showed brownish-red cytoplasm， indicating positive expression.The differential sieving method can successfully isolate and culture primary rat BMECs with exceptional purity.

brain microvascular endothelial cells； primary culture； differential sieving method； von Willebrand factor； rats

R329.21； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.09.024

1000-4718（2023）09-1724-05

2023-05-17

2023-07-02

國家自然科學(xué)基金資助項目（No. 81072714）；福建省自然科學(xué)基金資助項目（No. 2017J01545）

Tel： 0591-22861152； E-mail： 2422198977@qq.com

（責任編輯：盧萍，羅森）