新疆拜城縣馬鈴薯瘡痂病病原菌的分離鑒定及生物學(xué)特性分析

徐李娟,陳 勇,王則玉,王 博,艾尼江·爾斯?jié)M,郭 瑞,李克梅,宋素琴,4

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091;3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所,烏魯木齊 830091;4.新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】馬鈴薯瘡痂病是由多種鏈霉菌(Streptomycesspp.)引起的一種土傳病害,造成馬鈴薯品質(zhì)下降[1]。致病菌中與致病性相關(guān)的基因分布在染色體中同一區(qū)域,致病島(pathogenicity island,PAI)中,該區(qū)域可以從致病鏈霉菌菌株水平轉(zhuǎn)移到其他不含致病基因的鏈霉菌屬中的其他種中,從而產(chǎn)生新的致病菌株,因此致病鏈霉菌具有多樣性,不同產(chǎn)區(qū)病原菌種類及組成有所不同;其中thaxtomin A(ThxA)毒素是其重要的致病因子,其合成基因位于PAI的第一部分,即“毒素區(qū)”[2-5]。感病馬鈴薯塊莖表面粗糙,形成瘡痂狀病斑,不僅影響馬鈴薯的外觀及品質(zhì),且馬鈴薯表皮組織遭到破壞,導(dǎo)致土壤中其它病原菌更容易侵染薯塊[6-8]。馬鈴薯播種面積不斷擴(kuò)大,瘡痂病的發(fā)生也日益嚴(yán)重,在山西、內(nèi)蒙古等地瘡痂病發(fā)病率達(dá)到30%～60%,嚴(yán)重地塊高達(dá)100%[9,10]。新疆生脫毒馬鈴薯微型薯發(fā)病率最高可達(dá)80%以上[11]。瘡痂病對馬鈴薯的生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失,已成為制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的因素之一。【前人研究進(jìn)展】瘡痂病致病菌由Roland Thaxter分離得到,命名為S.scabies[12]。除了S.scabies,S.acidiscabies和S.turgidiscabies3種常見病原菌外[13],其他國外已經(jīng)報(bào)道病原有27種,包括S.atroolivaceous、S.cinerochromogenes、S.corchorusii、S.diastatochromogenes、S.lydicus、S.malachiticus、S.albogriseolus[14, 15]、S.europaeiscabiei[16]、S.violaceus、S.gnseus、S.exfoliatus、S.rocbei[17]、S.reticuliscabiei、S.aureofaciens、S.albidoflavus[18-20]、S.caviscabies[21]、S.luridiscabiei、S.puniciscabiei、S.niveiscabiei[22]、S.stelliscabies[19]、S.brasiliscabiei[23]、S.alkaliscabies[24]、S.cinereus、S.collinus、S.longisporoflavus[25]、S.flavidofuscus、S.ipomeae[26]。我國馬鈴薯瘡痂病菌的分布也呈現(xiàn)地域氣候的差異,目前已報(bào)道的致病瘡痂鏈霉菌病原共有18種,包括S.caviscabies、S.anulatus、S.scabies、S.turgidiscabies、S.acidiscabies、S.europaeiscabiei、S.luridiscabiei、S.enissocaesilis、S.griseus、S.aureofaciens、S.bobili、S.galilaes、S.bottropensis、S.stelliscabiei、S.luridiscabiei、S.griseoaurantiacus、S.setonii、S.reticuliscabiei,分別在云南省[1]、內(nèi)蒙古[10]、山東[13]、黑龍江[27]、甘肅[28]、貴州[29]等省(區(qū))。【本研究切入點(diǎn)】新疆土質(zhì)多為灰漠土,適宜馬鈴薯生長。2019年拜城縣馬鈴薯種植面積2 666.67 hm2(4萬余畝),單產(chǎn)4 t/667m2,總產(chǎn)量16×104t。但目前僅伊犁有報(bào)道病原菌為S.scabies、S.acidiscabies[30],缺乏對新疆不同地區(qū)馬鈴薯瘡痂病病原菌的組成系統(tǒng)性研究,有關(guān)拜城馬鈴薯產(chǎn)區(qū)未見報(bào)道。需進(jìn)一步探明新疆不同地區(qū)馬鈴薯瘡痂病病原菌的種類。【擬解決的關(guān)鍵問題】采集新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣瘡痂病病薯及薯表土壤進(jìn)行病原菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究,為該地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的防治提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試土樣及馬鈴薯塊莖采集自新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣察爾齊鎮(zhèn)。培養(yǎng)基為高氏1號培養(yǎng)基(可溶性淀粉20 g,硫酸鎂0.5 g,氯化鈉 0.5 g,磷酸氫二鉀 0.5 g,硝酸鉀1.0 g,硫酸亞鐵 0.01 g,瓊脂15～20 g,水1 000 mL)、碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(氯化錳7.9 mg,磷酸氫二鉀5.65 g,硫酸鋅 1.5 g,硫酸鎂1.0 g,硫酸銨1.5 g,硫酸銅6.4 mg,硫酸亞鐵1.1 mg,磷酸二氫鉀2.38 g,瓊脂15～20 g,水1 000 mL)、氮源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(氯化鈉5 g,葡萄糖10 g,磷酸氫二鉀1.0 g,硫酸鎂5.0 g,瓊脂15～20 g,水1 000 mL)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(燕麥30 g,瓊脂瓊脂15～20 g,水1 000 mL)、Tresner 瓊脂培養(yǎng)基(檸檬酸鐵0.5 g,蛋白胨10 g,瓊脂15～20 g,水100 mL)、酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基(酪氨酸1.0 g,NaCl 8.5 g,酵母浸提物 1.0 g,瓊脂 15～20 g,水1 000 mL)、淀粉水解培養(yǎng)基(氯化鈉0.5 g,硝酸鉀1.0 g,硫酸鎂0.5 g,磷酸氫二鉀0.5 g,可溶性淀粉10.0 g,水1 000 mL)。

對照菌株SteptomycesbottropensisAMCC40023,由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離、純化

用流水沖洗病薯,自然晾干,切取病健交界處進(jìn)行消毒,無菌水沖洗3次后,將切取病健交界處的組織置于無菌研缽中研磨呈成勻漿,加入9 mL的無菌水,震蕩10 min,取1 mL研磨的勻漿放入含有9 mL無菌水的試管中,梯度稀釋,取各梯度稀釋液100 μL均勻涂布于燕麥培養(yǎng)基及高氏I號培養(yǎng)基中,置于30℃培養(yǎng)5～7 d后,挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行純化,接入高氏1號斜面,4℃冰箱保存。圖1

圖1 田間感病馬鈴薯塊莖的癥狀

1.2.2 馬鈴薯瘡痂病病原的致病性測定

馬鈴薯瘡痂病毒素產(chǎn)生的致病基因有txtAB、nec1 和tomA。通過PCR 擴(kuò)增技術(shù),以標(biāo)準(zhǔn)菌株SteptomycesbottropensisAMCC40023為對照,對txtAB、nec1、tomA基因檢測。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。表1～3

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 菌株鑒定及相關(guān)引物序列

表3 馬鈴薯瘡痂病致病基因PCR擴(kuò)增條件

1.2.3 致病性測定

1.2.3.1 蘿卜幼苗法

將菌株接種至高氏1號液體培養(yǎng)基中,30℃,150 r/min,培養(yǎng)7 d,用75%無水乙醇對蘿卜種子表面消毒,再用無菌水連續(xù)沖洗3次,晾干,將晾干的種子放置于含有濕潤無菌濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行催芽,選取長勢一致的種子分裝到含有1%水瓊脂的試管中,每試管放入3粒種子,將培養(yǎng)好的菌液200 μL接種至試管中,以接種無菌液體培養(yǎng)基為空白對照,每個(gè)處理重復(fù)3次,將試管放置于光照培養(yǎng)箱間歇培養(yǎng),7 d后觀察。

1.2.3.2 小薯片法

將菌株接種至高氏I號培養(yǎng)基中,30℃,培養(yǎng)7 d,選取健康的馬鈴薯(費(fèi)烏瑞它)塊莖,75%表面消毒,無菌水沖洗,用無菌打孔器在塊莖上打孔,無菌手術(shù)刀切成厚度一致的薯片,放置于含有1%水瓊脂的培養(yǎng)皿中,每皿放入4片,用打孔器在平板中打孔,將菌餅倒置放置在小薯片中央,以未接菌的培養(yǎng)基為對照,30℃恒溫培養(yǎng)10 d,觀察小薯片是否褐變壞死。

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 病原菌形態(tài)特征

用接種針挑取生長7 d的菌落,接種至高氏I號培養(yǎng)基中,用無菌鑷子夾取滅菌后的蓋玻片,45°斜插在培養(yǎng)基中,培養(yǎng)7 d,在電子顯微鏡下觀察病菌孢子鏈和孢子的形態(tài)特征。

1.2.4.2 病原菌生物學(xué)特性

根據(jù)國際鏈霉菌計(jì)劃(ISP),進(jìn)行病原菌的生理生化鑒定。

1.2.4.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

采用鏈霉菌16S rDNA通用擴(kuò)增引物,PCR反應(yīng)體系為20 μL:10 μL Mix;2 μL模板,上下游引物各1 μL,dd H2O 6.4 μL。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。通用引物為PA/PH。由鼎國昌盛有限公司進(jìn)行測定。測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對,利用Mega7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS 17.0軟件)進(jìn)行差異顯著性分析,用Excel軟件分析并作圖;利用生物軟件MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離

研究表明,從新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣察爾齊鎮(zhèn)采集的馬鈴薯塊莖樣品中共分離放線菌72株,其中鏈霉菌28株。

2.2 馬鈴薯瘡痂病病原的致病性測定

2.2.1 病原菌的致病基因 PCR檢測

研究表明,菌株K6在385、700、392 bp大小處有清晰的條帶,分別對應(yīng)txtAB、nec1、tomA3種致病基因,并與標(biāo)準(zhǔn)菌株SteptomycesbottropensisAMCC40023條帶一致,菌株K6同時(shí)具有txtAB、nec1、tomA3種基因。圖2

M:DL 2000 DNA Marker;1:Steptomyces bottropensis AMCC40023;2:K6菌株

2.2.2 蘿卜幼苗法致病性測定

研究表明,K6菌株能夠抑制蘿卜幼苗的生長。圖3

注:A:空白對照;B:接種K6菌株

2.2.3 小薯片法致病性測定

研究表明,接種菌餅的馬鈴薯片和蘿卜片培養(yǎng)10 d 后,小薯片中央部位顏色變深,并產(chǎn)生壞死性病斑,而對照的小薯片和蘿卜片無明顯變化,說明K6菌株具有較強(qiáng)的致病性。圖4

注:A:馬鈴薯片空白對照;B:馬鈴薯片接種K6菌株;C:蘿卜片空白對照;D:蘿卜片接種K6菌株

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)特征觀察

研究表明,菌株K6高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后,菌落為圓形、孢子灰色,基絲紅褐色,無色素產(chǎn)生。圖5

注:A:菌落形態(tài);B:孢子形態(tài);C:菌絲形態(tài)

2.3.2 病原菌的生理生化特征

研究表明,菌株K6能夠以D-葡萄糖、D-甘露醇、棉子糖、α-乳糖、D-果糖、海藻糖、山梨醇、L-阿拉伯糖、肌醇等作為單一碳源。能夠以甲硫氨酸、硫酸銨、酵母粉、組氨酸等作為單一氮源,能夠產(chǎn)生H2S,可以使淀粉水解,對6%NaCl、苯酚(0.1%)、鏈霉素(20 μg/mL))敏感,在pH4的條件下不能正常生長。表4

表4 菌株K6生理生化特征

2.3.3 病原菌16S rDNA序列

研究表明,菌株K6 與S.bobili(NR 112584.1)親緣關(guān)系最近,序列相似度為99.64%,鑒定為S.bobili。圖6

圖6 基于16S rDNA構(gòu)建的菌株K6系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

瘡痂鏈霉菌病原多樣性和種群分布受馬鈴薯品種、種植季節(jié)、海拔高度及土壤pH等多種因素影響,且寄主范圍較廣,除馬鈴薯外,還有蘿卜、甜菜和胡蘿卜等寄主[27,31]。國外已報(bào)道的瘡痂病菌有30多種,其中S.scabies,S.acidiscabies和S.turgidiscabies分布最為廣泛[32]。國內(nèi)對馬鈴薯瘡痂病菌的研究起步較晚,目前國內(nèi)已報(bào)道的瘡痂鏈霉菌病原有18種,杜娟在新疆伊犁地區(qū)分離到S.acidiscabies和S.scabies[30]。研究從新疆拜城縣分離得到1種致病菌S.bobiliK6,在我國河北、內(nèi)蒙古、甘肅、山東等省(區(qū))地均發(fā)現(xiàn)該病原菌[30]。但是試驗(yàn)中并沒有分離得到S.acidiscabies和S.scabies,可能是由于地區(qū)原因所導(dǎo)致。

4 結(jié) 論

引起新疆拜城縣馬鈴薯瘡痂病的病原為S.bobili,致病性較強(qiáng),菌株K6的碳源和氮源廣泛,能夠產(chǎn)生H2S,可使淀粉水解,對6%NaCl、0.1%苯酚和20 μg/mL鏈霉素敏感,在pH4的條件下不能正常生長。