生防菌BZ3 對煙草普通花葉病毒的生防效果及全基因組分析

劉 蕾，肖志鵬，周向平，肖艷松，蔡海林，李玲玲，梅斯釔，劉天波*，唐前君*

（1.湖南農業大學植物保護學院，長沙 410128；2.中國煙草總公司湖南省公司，長沙 410004）

煙草普通花葉病毒?。═obacco mosaic virus，TMV）是危害煙草產量和品質的主要病害，每年因TMV 造成的經濟損失高達1 億美元[1]。

目前防治煙草普通花葉病毒病的主要方法是化學防治，但生產中有效的抗植物病毒制劑較少，防治效果不佳，田間防效大多在50%以下[2]。化學農藥的過度使用帶來的抗藥性加劇、農藥殘留和環境污染等一系列問題受到人們普遍關注，生物防治越來越被重視[2]。利用微生物防治煙草普通花葉病毒病的研究越來越多，主要集中在生防細菌，如假單胞菌[3]、芽孢桿菌[4]以及黏質沙雷菌等[5]。TMV能夠在土壤中存活較長時間，土壤中的TMV 是重要侵染源之一，因此，從土壤中分離土著微生物防治TMV 受到研究者們的重視。岳研[6]從土壤中分離篩選到8 株對TMV 枯斑具有抑制效果的芽孢桿菌，劉濤[7]從煙草根際土壤中分離的8 株產鐵載體細菌能顯著抑制TMV 的發生。同時，生防菌能通過分泌次生代謝產物和誘導植物產生抗病性實現生物防治，如貝萊斯芽孢桿菌能產生表面活性素[8]和鐵載體[7]等次生代謝產物來誘導植株產生抗性。

本研究從煙草根際土壤中分離得到菌株BZ3，對其進行鑒定，評價生防效果，并通過全基因組測序及基因功能分析生防菌分泌次生代謝產物的潛力，以期為煙草普通花葉病毒病的防控積累更多的生物資源，為后期的開發應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基 PDA 培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，去離子水定容至1 L，pH 調至7.0；LB 培養基：NaCl 10 g，胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，去離子水定容至1 L，pH 調至7.0（固體培養基則再加入15 g/L 瓊脂粉）。

1.1.2 土壤樣品 采自湖南農業大學煙草基地煙草普通花葉病毒病發病地區中健康植株的根際土壤。

1.1.3 毒源及煙草 供試毒源TMV 保存于湖南農業大學植物保護實習基地溫室內。試驗煙草為栽培煙草云煙87 和心葉煙，在育苗基質中培育至6 片真葉左右，備用。

1.1.4 病原菌 煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、煙草黑脛病菌（Phytophthoranicotianae）、煙草靶斑病菌（Rhizoctoniasolani）、辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsica）、辣椒白絹病菌（Sclerotium rolfsii）和水稻紋枯病菌（Rhizoctoniasolani），保存于湖南農業大學植物病理學實驗室。

1.2 生防菌株的分離純化及活性檢測

1.2.1 菌株分離 采用稀釋分離法[9]從煙草根際土壤分離菌株，并將形態特征差異明顯的單菌落劃線純化3 次后，取單菌落移至5 mL LB 液體培養基中，37 ℃、200 r/min 培養14 h，將50%甘油和菌液以體積比1∶1 混合，-80 ℃保存備用。

1.2.2 菌株抑制活性篩選 分離得到的菌株于LB平板上劃線活化3 次，挑取單菌落接種于20 mL LB培養基中，37 ℃、200 r/min 培養60 h（OD600約為2.0），10 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液經0.22 μm 針孔式無菌過濾器過濾得到無菌發酵液。

稱取1 g TMV 感病葉片，在研缽中加入適量石英砂研磨成勻漿，加0.2 mol/L 磷酸緩沖液定容至100 mL 制得TMV 接種液。參照林中正等[10]半葉枯斑法對菌株進行活性測定，左半邊葉片接種LB 液體培養基與TMV 接種液1∶1 混合液為對照，右半邊葉片接種菌株無菌發酵液與TMV 接種液1∶1 混合液。每個菌株接種3 株煙株，每株接種3 片葉片。接種0.5 h 后，用無菌水將葉片表面的石英砂輕輕沖掉，并在早晚各噴無菌水一次。3 d 后統計枯斑數量，參照趙譽強等[11]方法計算抑制率。

抑制率（%）=（對照組枯斑數-處理組枯斑數）/對照組枯斑數×100%

1.3 生防菌株鑒定

1.3.1 形態學鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》[12]進行形態學鑒定。將篩選到的抑制效果最好的菌株BZ3 用劃線分離法接種到LB 平板，30 ℃培養48 h，觀察單菌落的形態特征，并進行革蘭氏染色，干燥后顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.3.2 生理生化鑒定 參考《伯杰細菌鑒定手冊》[13]進行生理生化鑒定，每個處理重復3 次，并設置空白對照。

1.3.3 分子生物學鑒定 按照細菌基因組DNA 提取試劑盒（購自北京全式金生物公司）方法提取細菌基因組。以基因組DNA 為模板，參考王雯麗[14]和Wang 等[15]菌株鑒定中使用的引物對27F/1492R和BS-F/BS-R 擴增16S rRNA 和DNA 促旋酶B 亞基基因（DNA gyrase B subunit gene,gyrB）片段。擴增程序參考Wang 等[15]的方法，將PCR 產物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。利用Mega X構建系統發育樹，結合16S rRNA 和gyrB序列系統發育樹確定菌株分類地位。

1.4 菌株BZ3 對TMV 的防效試驗

1.4.1 溫室盆栽試驗 設置4 個處理，分別為BZ3菌株發酵液（2.0×109cfu/mL）、20%鹽酸嗎啉胍可濕性粉劑、10%超敏蛋白微顆粒劑，無菌水為對照，農藥的施用量均為商品推薦最佳用量，每個處理3次重復。選擇長勢大小基本一致的6 葉期健康煙苗移栽到花盆，移栽時采用灌根方式處理1 次，每株5 mL。移栽7 d 后噴施處理葉片，每隔7 d 噴施1次，噴施3 次后，采用摩擦接種的方式將TMV 接種于煙草上。接種TMV 30 d 后調查發病率及病情指數，參照趙譽強等[11]方法計算發病率、病情指數和防治效果。

1.4.2 田間試驗 在TMV 發病較重的龍山縣茨巖鎮試驗基地，采用單因素完全隨機區組設計，每個小區30 株煙，重復3 次。處理設置、接種TMV 處理及調查統計方法同1.4.1。

1.5 菌株BZ3 抑菌譜測定

利用實驗室保存的6 種病原菌對菌株BZ3 進行廣譜抑菌能力測定。按照1.2 方法獲得菌株BZ3 的無菌發酵液，在100 mL PDA 培養基中加入20 mL無菌發酵液，混合均勻制成平板。將6 種病原菌分別接種于上述PDA 平板中央，以不加無菌發酵液的PDA 平板為對照，每個處理3 次重復。30 ℃恒溫培養7 d 后，測量菌落直徑，并計算抑菌率。

抑菌率(%)=（對照平板菌落直徑-處理平板菌落直徑）/對照平板菌落直徑×100

1.6 全基因組測序和功能預測

提取菌株BZ3 基因組DNA，送武漢未來組生物科技有限公司進行全基因組測序。利用Nanopore 對菌株BZ3 基因組DNA 進行建庫、測序。測序得到的原始reads 經過質控篩選、去接頭后，利用NextDenovo 進行基因組組裝、環化，得到菌株BZ3 基因組完整序列。

利用Prodigal 2.6.3[16]預測編碼序列，利用blastx算法將基因組數據與NCBI 非冗余（NR）、COG（Clusters of Orthologous Groups）等數據庫比較，并進行基因功能注釋分析。利用tRNAscan-SE[17]、RNAmmer[18]和antiSMASH 2.0 等數據庫對tRNA、rRNA 以及次生代謝產物進行預測。

1.7 數據統計與可視化分析

采用Excel 2016 和SPSS 23.0 軟件進行數據處理和分析，通過GraphPad Prism 9 和ChiPlot 對試驗數據和基因功能注釋結果進行可視化分析；利用Proksee 進行全基因組圖譜的繪制。

2 結 果

2.1 生防菌株的分離及其活性鑒定

從根際土壤中共分離得到菌株61 株，半葉枯斑法篩選獲得對TMV有抑制活性菌株5株（表1），其中抑制效果最好為菌株BZ3（圖1），抑制率達95.12%。

圖1 菌株BZ3 對TMV 的抑制作用Fig. 1 Antagonistic effects of strain BZ3 on TMV

表1 生防菌株對TMV 的抑制作用Table 1 The inhibitory effect of biocontrol strains on TMV

2.2 生防菌株鑒定

2.2.1 形態學鑒定 菌株BZ3 在LB 平板上初期為透明水漬狀、較為粘稠，約培養16 h 后為不規則的白色不透明菌落，表面有凸起褶皺，呈放射狀（圖2a）。革蘭氏染色為陽性，菌體有鞭毛和莢膜，內生芽孢，芽孢長橢圓形，在掃描電鏡下為短桿狀，大小為（0.7～1.2） μm×（1.4～2.50）) μm（圖2b-e）。

圖2 菌株BZ3 的菌落形態(a)、革蘭氏染色(b)、莢膜染色(c)、芽孢染色(d)及電鏡觀察形態(e)Fig. 2 Colony morphology (a), gram staining (b), capsule staining (d), spore staining (e) and electron microscope observation(e)of the BZ3 strain

2.2.2 生理生化鑒定 生理生化特性試驗結果如表2所示。淀粉水解、革蘭氏染色、甲基紅試驗、接觸酶試驗、明膠液化和V.P試驗呈陽性，其他則呈陰性。

表2 菌株BZ3 的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of bacterial strain BZ3

2.2.3 分子生物學鑒定 菌株BZ3 的16S rRNA 和gyrB基因序列提交至國家微生物科學數據中心，分別獲得序列號NMDCN00016NQ和NMDCN00016NR。根據16S rRNA 基因序列構建的系統發育樹（圖3），菌株 BZ3 沒有獨立分支，與枯草芽孢桿菌（OL824905.1）、解淀粉芽孢桿菌(KJ009435.1)和貝萊斯芽孢桿菌(CP026039.1)的親緣關系接近，同源性72%。基于gyrB基因構建的系統發育樹（圖4），菌株BZ3 的gyrB基因序列與貝萊斯芽孢桿菌BY6(NC CP051011.1)和LPL061(NC CP042271.1)在一個分支上，同源性100%。因此，根據形態學、生理生化試驗和系統發育樹，將菌株BZ3 鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）。

圖3 基于16S rDNA 序列的菌株BZ3 系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain BZ3 based on 16S rDNA sequence

圖4 基于gyrB 基因序列的菌株BZ3 系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strain BZ3 based on gyrB gene sequence

2.3 菌株BZ3 對TMV 的防治效果

菌株BZ3 無菌發酵液對TMV 有較好的防治效果，盆栽和田間的防效分別為58.97%和72.07%（表3），該防效明顯高于鹽酸嗎啉胍可濕性粉劑和超敏蛋白微顆粒劑。

表3 菌株BZ3 對TMV 的防治效果Table 3 Effects of strain BZ3 on TMV

2.4 抑菌譜測定

菌株BZ3 具有廣譜抗性，對水稻紋枯病菌、煙草靶斑病菌和煙草黑脛病菌等6 種病原菌均有拮抗作用，抑制率達到38%～100%（圖5）。

圖5 菌株BZ3 對供試病原菌的拮抗作用Fig. 5 Antagonistic effects of strain BZ3 on pathogens

2.5 全基因組測序和功能預測

2.5.1 全基因組測序分析 菌株BZ3 全基因組測序結果顯示基因組含4 條congtig，contig N50 為2 542 938 bp，GC 含量為46.5%，無不確定堿基，拼接結果完整性較好，基因組覆蓋度大于99.62%，包含3975 個蛋白編碼序列（CDSs）、146 個rRNA、39 個tRNA，以及47 個其他非編碼RNA。COG 結果分析顯示，BZ3 基因組中有72.51%的基因功能得到了注釋，豐度最大的是參與氨基酸轉運代謝的基因，有343 個基因被COG 數據庫注釋為未知功能基因（圖6）。

圖6 貝萊斯芽孢桿菌BZ3 的基因組圈圖Fig. 6 Circular genome map of Bacillus velezensis BZ3

2.5.2 次生代謝產物基因簇分析 通過antisSMASH 預測，菌株BZ3 基因組中含有18 個次生代謝產物合成相關的基因簇，其中包括3 種通過非核糖體合成酶（NRPSs）合成的脂肽類活性物質即表面活性素（surfactin）、豐原素（fengycin）和鐵載體（bacillibactin），4 種通過聚酮合成酶（PKS）合成的聚酮類化合物即大環素內酯H（macrolactin H）、桿菌素（bacillaene）、地非西?。╠ifficidin）和丁苷菌素A/B（Butirosin A/B），以及一些未知功能的化合物。

表4 次級代謝產物合成基因簇注釋分析Table 4 Annotation analysis of secondary metabolite synthesis gene clusters

3 討 論

TMV 具有很強的抗逆性，在土壤、病葉殘體和烘烤過的煙草病葉中均能存活數年。TMV 的初侵染主要來源于土壤和田間病殘體的TMV 病毒粒子[19]，從土壤中篩選生防菌株防治TMV 受到越來越多研究者們關注。吳惠惠等[20]和郭叢等[21]從煙田土壤中篩選出對TMV 有顯著拮抗活性的熒光假單胞菌株CZ（Pseudomonasfluorescens）和惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）A3。本研究從煙草根際土壤中篩選得到貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BZ3，可以抑制TMV，具有防治TMV的潛在應用價值。

貝萊斯芽孢桿菌是一種重要的生防菌，對TMV有較好的防效，且具有廣譜抗性。申莉莉等[4]從土壤中分離的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）by33 對TMV 的體外鈍化作用高達85.35%；厲彥芳等[22]篩選的側孢短芽孢桿菌（Brevibacilluslaterosporus）B8 菌株發酵液對TMV的抑制率為87.52%。本研究篩選的貝萊斯芽孢桿菌BZ3 無菌發酵液對TMV 的抑制率高達95.12%，高于解淀粉芽孢桿菌by33[4]和側孢短芽孢桿菌B8[22]。此外，菌株BZ3 發酵液對TMV 的田間防效高達72.07%，高于王盼等[23]研究的YNLP-2 菌株的田間防效，且其防治效果顯著高于生產上的常用藥劑鹽酸嗎啉胍和超敏蛋白。此外，菌株BZ3 具有防治真菌和細菌病害的廣譜生防潛能，其無菌發酵液對水稻紋枯病菌、煙草靶斑病菌、煙草赤星病菌和辣椒白絹病菌等多種病菌具有優良的拮抗效果，抑制率達83%～100%，具有廣闊的應用前景。

貝萊斯芽孢桿菌能夠分泌脂肽類和聚酮類等抗生素，具有殺滅病原菌、提高植物抗性和阻礙植物病原菌對植物的侵染等作用。Long 等[24]研究發現表面活性素在一定濃度下，可以侵入囊泡生物（如病毒、細菌和真菌）的外層脂質結構，并使其結構瓦解，從而達到滅殺病原微生物的目的。劉濤等[7]發現鐵載體對煙草具有促生作用，能夠顯著提高煙株的抗病毒能力。Jin 等[8]和謝菁菁[25]發現純化的表面活性素在煙草細胞懸浮液中可觸發防御反應，誘導植物產生系統抗性來抵抗TMV。厲彥芳等[26]研究表明側孢短芽孢桿菌產生的BLB8 蛋白能破壞TMV 的粒子形態，推測是芽孢桿菌產生了某種類似于BLB8 蛋白的活性物質，使TMV 結構發生改變，從而失去侵染能力。本研究對BZ3 全基因組測序和基因功能分析發現，其基因組中含有18個次生代謝產物合成相關基因簇，其中包括了表面活性素、豐原素、大環素內酯和鐵載體等多種具有抑菌活性的物質，推測菌株BZ3 產生了表面活性素等活性物質，同時觸發了植物防御反應，減弱了TMV 的侵染能力，從而對TMV 有優良的生防效果。貝萊斯芽孢桿菌BZ3 含有多種抑菌活性的次生代謝產物基因簇，但本研究未對活性物質進一步分離純化，下一步將結合代謝組學和核磁共振等技術，進一步分離純化和鑒定，并深入研究其抗病機理，為生防菌的開發提供理論支撐。

4 結 論

本研究從煙草根際土壤篩選獲得對TMV 具有抑制作用的生防菌株貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BZ3，對TMV 的防效較好，抑菌譜較廣，基因組中含有多種抑菌抗病毒活性的次生代謝產物基因簇，具有較好的應用前景。