玉溪雪茄煙發(fā)酵霉變病原菌鑒定及生防菌篩選

付克劍，宋學茹，楊 芳，張立猛，崔永和，黃智華，蘇友波*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，昆明 650201；2.云南省煙草公司玉溪市公司，云南 玉溪 653100）

雪茄煙（Cigar）是一種特殊煙草制品，雪茄煙葉經(jīng)過采摘、調制后進行發(fā)酵，通過催化因子作用，原煙葉中的基礎物質經(jīng)一系列生物化學變化，使煙葉內(nèi)的化學成分更加協(xié)調。然而雪茄煙在發(fā)酵過程中易受到霉菌侵染造成經(jīng)濟損失[1]。近年來，雪茄煙葉發(fā)酵霉變正成為我國南方部分煙區(qū)發(fā)酵環(huán)節(jié)煙葉品質下降的重要原因之一[2]。

有研究表明，雪茄煙葉在不同地區(qū)的儲藏期和發(fā)酵期均存在霉變現(xiàn)象，曲霉屬和青霉屬真菌是導致煙葉霉變的主要致霉菌[3-4]。其中，曲霉屬真菌包括黃曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）、煙曲霉（A.fumigatus）、黃柄曲霉（A.flavipes）、米曲霉（A.oryzae）和聚多曲霉（A.sydowii），并有學者發(fā)現(xiàn)被曲霉屬真菌侵染會呈現(xiàn)出生態(tài)毒理學特征。青霉屬包括局青霉（P.restrictum）、擴展青霉（P.expansum）和產(chǎn)黃青霉（P.chrysogenum）[5-7]。這些霉菌的侵染不僅影響雪茄煙品質，還在一定程度上威脅著消費者的健康。

雪茄煙發(fā)酵霉變病的防治方法主要包括發(fā)酵工藝優(yōu)化、化學防治。發(fā)酵工藝優(yōu)化是基于現(xiàn)有發(fā)酵房的改造、發(fā)酵劑的噴施方法改良以及發(fā)酵堆的堆放方式進行的改進，該方法對致霉菌的防治最為方便、快捷，但成本高收效低[8-10]?；瘜W防治則主要體現(xiàn)在發(fā)酵劑中的化學成分，化學藥劑防效雖然較好，但易導致藥劑殘留、煙葉品質安全下降等問題，因此其應用至今未受到推廣。生物防治因具有專一性強、環(huán)境友好以及不易引起病原菌產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，受到研究者青睞。然而生物防治在該病防控中的應用較少。目前，已有研究者利用微生物進行雪茄煙的發(fā)酵，但大多數(shù)添加微生物的目的為降解大分子物質，進而提高其香氣物質[11-13]，而以拮抗發(fā)酵過程中的致霉菌為目的的研究尚未見報道。近年來云南省玉溪市雪茄煙在發(fā)酵過程中出現(xiàn)大量暗綠色霉層滋生現(xiàn)象，嚴重時整葉呈暗黑狀，影響煙葉品質，其霉變病原菌尚未得到系統(tǒng)鑒定，該病的高效綠色防控措施仍有提升空間。本研究通過病原分離、柯赫氏法則和致病性測定，明確玉溪雪茄煙葉霉變病的病原，篩選具有防治潛力的拮抗菌，并進行發(fā)酵試驗評價拮抗菌的防霉變能力，以期為霉變防控提供生防材料。

1 材料與方法

1.1 霉變調查與樣品采集

2022 年3—4 月在玉溪市調查雪茄煙發(fā)酵過程中煙葉霉變的發(fā)生情況，采集發(fā)霉煙葉樣品；用無菌濾紙擦拭發(fā)酵房頂部、內(nèi)部側壁，采集發(fā)酵房內(nèi)環(huán)境樣品，將樣品帶回實驗室用于病原菌分離培養(yǎng)。

1.2 培養(yǎng)基

病原真菌：PDA 培養(yǎng)基；生防細菌：NB 培養(yǎng)基或LB 培養(yǎng)基。

1.3 病原菌分離與保存

用無菌刀片切取發(fā)霉葉面病健交界處組織若干塊，于75%乙醇中表面消毒5 s，無菌水中漂洗，用無菌紙吸干后置于PDA 培養(yǎng)基28 ℃暗培養(yǎng)，48 h后檢測病原菌分離情況。對于環(huán)境樣品的病原菌，直接將采集濾紙放置在PDA 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。待長出菌落挑選邊緣菌絲再培養(yǎng)，重復2～3 次，確認疑似病原菌后進行保存。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 柯赫氏法則鑒定 用PDA培養(yǎng)基于28 ℃暗培養(yǎng)霉變煙葉病健交界處分離得到的病原菌48 h，挑取少許菌絲置于光學顯微鏡觀察。將病原菌接種在PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃下生長5 d，用無菌超純水收集孢子，通過三層無菌紗布過濾殘留菌絲，用0.1%的葡萄糖溶液稀釋孢子濃度至105spores/mL作為孢子懸浮液。將孢子懸浮液噴灑到健康雪茄煙葉，置于35 ℃、75%相對濕度條件下發(fā)酵，定期觀察霉變發(fā)生情況，顯癥后再次分離病原菌，并與原分離物進行形態(tài)、顯微、病狀對比。

1.4.2 病原真菌的ITS 基因測定 參照前人研究[14]進行病原菌基因組DNA 的提取，擴增的PCR 產(chǎn)物在上海榮序生物技術有限公司進行測序，ITS 基因PCR 擴增的前向引物為 ITS1 （ 序列：CCGTAGGTGAACCTGCGG），反向引物為ITS4（序列：TCCTCCGCTTATTGATATGC），擴增長度500 bp 左右。將序列結果輸入NCBI 網(wǎng)站（http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov）的生物技術信息中心數(shù)據(jù)庫，使用BLASTn算法將樣品序列與真菌模式菌株和參考菌株ITS 數(shù)據(jù)庫進行比對，查找與近緣模式菌相關的序列。利用MEGA11 軟件采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 生防菌篩選與鑒定

采用稀釋涂布平板法[15]，將健康的雪茄煙葉樣品用研缽搗碎，將1 g 搗碎煙樣添加到試管中，加無菌水至試管10 mL 刻度處，蓋塞振蕩30 min。取其上清液1 mL 梯度稀釋至104、105倍液，將100 μL稀釋液加到NA 培養(yǎng)基上進行均勻涂布，并在28 ℃恒溫養(yǎng)箱培育3 d。采集不同形態(tài)菌落的菌株，在NA 培養(yǎng)基上進行純化。以病原菌為指示菌，采用平板對峙法篩選拮抗菌，將直徑0.5 cm 的病原菌接至PDA 平板中心，并將純化的生防菌接種到距離煙草疫霉2.5 cm 處的外圍，呈等邊三角形頂點或者正方形頂點形式點接，并以只接病原菌的PDA 平板為空白對照。在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培育，直至對照平板的菌絲到達平板邊緣。觀察病原菌生長情況及周圍是否產(chǎn)生抑制帶，并測量抑制帶寬度（mm）。選擇抑菌效果較好的拮抗菌進行后續(xù)防治試驗。使用通用引物27F-1492R 通過PCR 擴增生防菌的16S rDNA 基因，擴增的前向引物為 27F（序列：TACGGYTACCTTGTTACGACTT），反向引物為1492R（序列：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG），擴增長度為1.5 kb 左右，擴增的PCR 產(chǎn)物在上海榮序生物技術有限公司進行測序。參照1.4.2 中的方法進行序列比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。參照《微生物學實驗》對菌株CD-1 的生理生化特性進行測定，并以實驗室中的蠟樣芽孢桿菌標準菌株作為對照組。

1.6 防霉變效果測定

選取大小均勻、無機械損傷和感染的雪茄煙葉進行發(fā)酵。將病原菌XJ-a 接種在PDA 培養(yǎng)基上，如1.4.1 中方法制備病原菌孢子懸浮液，將生防菌接種至150 mL 的NB 培養(yǎng)液中，28 ℃下，180 r/min搖動48 h，作為生防菌的種子液，將種子液離心并取離心所得的細胞顆粒溶于150 mL 的0.1%葡萄糖溶液作為生防菌發(fā)酵液備用。在發(fā)酵前同一時間點按先后順序，先噴灑50 mL 病原菌孢子懸浮液后緊接著噴灑50 mL 生防菌發(fā)酵液作為處理組，先噴灑50 mL 病原菌孢子懸浮液后緊接著噴灑50 mL 無菌水作為對照組，每組發(fā)酵煙葉質量均為2 kg，置于35 ℃、75%相對濕度條件下發(fā)酵30 d。分別在發(fā)酵15 d 和30 d 進行采樣并測定霉變率，試驗重復3 次。

1.7 雪茄煙香氣成分測定

將處理組與對照組發(fā)酵完成后的煙葉進行香氣成分測定。將煙葉置于40 ℃下干燥4 h，研磨后過60 目篩，稱量20 g 磨好樣品，放入三角瓶，加入350 mL 蒸餾水和1 mL 20 μg/mL 內(nèi)標溶液（正十七烷）。向50 mL 三角瓶中加入50 mL 乙醚置于60 ℃水浴下加熱萃取。將得到的乙醚萃取液濃縮并定容至1 mL 后進行分析。采用GC-MS（Agilent 7890A, Agilent, USA）分別對發(fā)酵第15 天和第30天的煙葉進行香氣成分測定，并參照文獻[16]將致香成分分成葉綠素降解產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、美拉德反應產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物。

1.8 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS Statistics 26 統(tǒng)計軟件進行方差分析（ANOVA），并進行差異顯著性檢驗（p<0.05），采用Excel 2016 對試驗數(shù)據(jù)進行處理以及圖表制作。每個處理包括3 個重復，試驗重復2 次。

2 結 果

2.1 病原菌分離與鑒定

2.1.1 病原菌分離 經(jīng)調查發(fā)現(xiàn)，在玉溪市發(fā)酵的雪茄煙包括云雪1 號、云雪2 號、多米尼加雪茄煙及普洱6 號，在發(fā)酵過程中均有霉變的現(xiàn)象，葉柄上有綠色霉菌，基部上會伴有少量白色菌絲著生，葉面上呈不規(guī)則狀粘附著大量綠色霉層。經(jīng)病組織分離，獲得11 株菌落形態(tài)相同的真菌，從發(fā)酵房頂部、內(nèi)部側壁的樣品中也可分離到相同的真菌。真菌在PDA 培養(yǎng)基上于28 ℃暗培養(yǎng)3 d 菌落直徑可達7.5 cm。菌落呈半絨毛狀，菌絲發(fā)達，菌絲初為白色，后為黃色（圖1a）。分生孢子為球形或近球形，直徑3.5～4.5 μm，著生在分生孢子梗上（圖1b）。孢子囊呈棕黑色圓形或卵圓形，外表微觀的凹凸紋理，直徑10.5～13 μm（圖1c）。其形態(tài)特征與黃曲霉菌相似。

圖1 柯赫氏法則試驗對比結果Fig. 1 Comparative results of Koch’s law test

2.1.2 柯赫氏法則鑒定結果 在發(fā)酵的第6 天開始顯癥，出現(xiàn)少量綠色菌絲依附在煙葉上，在發(fā)酵的第12 天，癥狀明顯，病原菌侵染嚴重，出現(xiàn)大量綠色霉層。經(jīng)再次分離的病原菌XJ-b 與原分離病原菌XJ-a 進行形態(tài)比較發(fā)現(xiàn)兩菌在PDA 培養(yǎng)基上形態(tài)近乎相同，均呈黃色（圖1a）；經(jīng)顯微鏡下真菌形態(tài)對比，兩菌菌絲寬度相近，孢子均為圓形和近圓形，直徑3～4.5 μm，孢子囊均為圓形或卵圓形的結構，直徑在10.5～13 μm 之間，高度相似（圖1b、c、d）；經(jīng)病狀對比，原分離病原菌XJ-a 的來源樣品與柯赫氏法則試驗顯癥煙樣的癥狀相似，均有綠色霉層依附，呈不規(guī)則斑狀分布在煙葉上（圖1e）。由此判斷病原菌XJ-b 與原分離病原菌XJ-a 為同一致病菌。

2.1.3 分子鑒定 將菌株XJ-a 和XJ-b 的ITS 序列在NCBI 上進行BLAST 比對，下載相似度較高的參考序列后使用MEGA11 軟件進行序列的多重比對，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。菌株XJ-a 和XJ-b與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的Aspergillusflavus聚在一起，且 ITS 基因序列均與模式菌株A.flavusstrain Beca_79T 相似性最高，分別為99.73%、99.89%，與曲霉屬（Aspergillussp.）的其他真菌相似性低于90%。基于ITS 的系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株XJ-a、XJ-b與多株A.flavus菌聚為一支，綜合形態(tài)學和分子生物學特征，確定雪茄煙葉發(fā)酵霉變病原菌XJ-a 和XJ-b 為黃曲霉（A.flavus）。

圖2 基于ITS 基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Construction of phylogenetic tree based on ITS gene sequences

2.2 生防菌篩選

本次從雪茄煙葉中共篩選出121 株煙草內(nèi)生細菌，以病原菌XJ-a 為指示菌，從121 株煙草內(nèi)生細菌中篩選獲得14 株拮抗菌，其中CC-3、DM-3、OD-a 等3 株菌的抑菌帶寬度均大于5 mm，從多米尼加雪茄煙葉中分離的生防細菌CC-3 表現(xiàn)出最強和最穩(wěn)定的拮抗活性，其抑菌帶寬度達9.04 mm，顯著高于其他生防菌（圖3），因此后續(xù)研究選用菌株CC-3 進行進一步試驗。

圖3 生防菌的拮抗作用Fig. 3 Antagonistic activities of biocontrol bacteria

2.3 菌株CC-3 的鑒定

菌株生理生化性質和16S rDNA 基因是鑒定菌株的重要指標。如表1 所示，菌株CC-3 革蘭氏染色、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗、過氧化氫酶試驗、甲基紅試驗及V-P 試驗等測定結果為陽性；菌株D-甘露醇試驗、檸檬酸分解試驗、硫化氫試驗、吲哚試驗及乳糖發(fā)酵試驗等測定結果為陰性，根據(jù)其測定結果初步判斷菌株CC-3為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。將菌株CC-3 的基因序列在NCBI 上進行BLAST 比對，下載相似度較高的參考序列后使用MEGA11 軟件進行序列的多重比對，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），菌株CC-3 與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的Bacilluscereus聚類在一起，且16S rDNA 基因序列與蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）的同源度達100%。因此，將菌株CC-3 鑒定為芽孢桿菌屬中的蠟樣芽孢桿菌。

表1 菌株CC-3 生理生化試驗結果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of bacterium CC-3

圖4 基于鄰接法構建菌株CC-3 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Construction of phylogenetic tree of isolate CC-3 based on neighbor-joining method

2.4 菌株CC-3 防治效果及香氣成分分析

如圖5 所示，對照組中發(fā)酵第15 天黃曲霉XJ-a已明顯侵染煙葉，呈綠色霉層依附在煙葉上，在發(fā)酵的第30 天侵染霉層略有變少且顏色略有變淡，而添加了生防菌CC-3 的處理組中，兩個發(fā)酵時期均無大塊霉層附著，只有微小霉層粘附至煙葉邊緣上，難以用肉眼觀察到。經(jīng)防治效果分析（圖6），僅用黃曲霉XJ-a 處理的煙葉，在發(fā)酵的15 d 和30 d，霉變率分別達69.35%、55.39%，而XJ-a 處理的基礎上再用生防菌CC-3 發(fā)酵，兩個時期的霉變率分別下降64.44%和52.66%，僅為4.91%和2.73%。說明雪茄煙發(fā)酵過程中，生防菌CC-3 可以有效抑制黃曲霉的侵染。

圖5 添加菌株CC-3 發(fā)酵煙葉霉變情況Fig. 5 Mildew of tobacco leaves fermented by adding strain CC-3

圖6 菌株CC-3 防治效果Fig. 6 Control effects of strain CC-3

兩個發(fā)酵組的致香成分總含量均隨發(fā)酵時間的增長而增加（圖7），在發(fā)酵完成后處理組香氣物質總量較對照組提高28.96%，對照組在發(fā)酵15 d和30 d 的致香成分總含量分別為2.12 和3.00 mol/L，兩個時期均顯著低于處理組，并且對照組的煙葉香氣成分的增加主要集中在葉綠素降解產(chǎn)物，而處理組的煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、美拉德反應產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物均有顯著增加，說明黃曲霉的侵染會降低雪茄煙的香氣成分含量，并且抑制類胡蘿卜素、西柏烷類降解及美拉德反應的發(fā)生，而菌株CC-3 的添加減少了黃曲霉侵染的同時提高了香氣成分含量。

圖7 不同處理發(fā)酵第15 天與第30 天的香氣成分Fig. 7 Different aroma compounds between 15 d and 30 d fermentation treatments

3 討 論

本研究從雪茄煙發(fā)酵煙葉霉變組織中分離獲得病原菌，通過形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)其菌落顏色形態(tài)與黃曲霉菌落形態(tài)類似，經(jīng)柯赫氏法則檢驗發(fā)現(xiàn)原病原菌與柯赫氏試驗分離病菌高度相似，經(jīng)ITS 基因分子鑒定和相似性比對，確定2 種病原菌為黃曲霉菌屬。經(jīng)霉變防效測定發(fā)現(xiàn)一株蠟樣芽孢桿菌CC-3可以有效防治雪茄煙發(fā)酵霉變。蠟樣芽孢桿菌所產(chǎn)生的芽孢可在高溫、弱酸和弱堿等相對極端環(huán)境下生存，具有很強的抗逆性[17]，可作為生防菌用于防治植物病蟲害。本研究將離心菌體噴霧至雪茄煙葉進行發(fā)酵，經(jīng)發(fā)酵期間測溫，發(fā)酵最高溫度可達55 ℃，而發(fā)酵結束后，仍取得較好的防治效果，煙葉霉變率下降了52.66%，說明蠟樣芽孢桿菌不僅能在較高溫度下存活，還能發(fā)揮較強的抑菌作用，符合蠟樣芽孢桿菌的耐高溫特性。目前蠟樣芽孢桿菌被廣泛應用于生物防治，成為目前生防菌研究的重要對象[18]，但在雪茄煙葉防霉問題上尚少見報道。

雪茄煙發(fā)酵可以使煙葉內(nèi)各種化學成分更加協(xié)調，進而提高煙葉質量[19]。在煙葉發(fā)酵過程中合理有效地利用微生物資源的代謝特點，添加有益微生物可以提高雪茄煙葉功能菌株的種類及數(shù)量從而促進煙葉內(nèi)的生化代謝，降解淀粉、纖維素、蛋白質等大分子物質，實現(xiàn)針對性的增香提質，降低刺激性并減少有害物[20]。本研究利用具有生防功能的蠟樣芽孢桿菌進行發(fā)酵，香氣物質總量提高了28.96%，這可能與蠟樣芽孢桿菌本身產(chǎn)酶特性有關，但香氣變化的原因需進一步研究。

雪茄煙作為一種吸食性煙草產(chǎn)品，其安全性至關重要。蠟樣芽孢桿菌已被證實是常見的食源性致病菌，其產(chǎn)生的毒素可引起腹瀉、嘔吐等癥狀[21]。但并非所有的蠟樣芽孢桿菌都具毒理性，蠟樣芽孢桿菌是否產(chǎn)生毒素主要取決于該菌是否攜帶毒力基因，具有編碼毒素的能力。如李雁飛等[22]發(fā)現(xiàn)承德市餐飲食品中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為10.4%，通過對分離的19 株蠟樣芽孢桿菌進行毒力基因檢測，發(fā)現(xiàn)攜帶毒理基因的菌株有14 株，有5 株并未攜帶。文英會等[23]從246 批飼料產(chǎn)品中分離蠟樣芽孢桿菌，總體分離率為25.60%，發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌Cereulide 毒素基因攜帶率為6.30%，混合型飼料添加劑中的蠟樣芽孢桿菌Cereulide 毒素基因攜帶率為13.3%。近年來，隨著人們對蠟樣芽孢桿菌的深入研究，非致病性蠟樣芽孢桿菌所具有的功效逐漸被人們所發(fā)現(xiàn)，并逐步應用在食品發(fā)酵工藝[24]。如Zhao等[25]發(fā)現(xiàn)一株蠟樣芽孢桿菌YB-1表現(xiàn)出高產(chǎn)乙基己酸酯和低產(chǎn)丙醇的特性，其應用于濃香型白酒的傳統(tǒng)釀造工藝中，可以改善濃香型白酒的風味和品質。本研究中利用蠟樣芽孢桿菌CC-1 進行雪茄煙發(fā)酵能有效抑制霉變并提高香氣成分，但CC-3 是否攜帶毒理基因尚未明晰，為更好地應用于雪茄煙防霉發(fā)酵工藝，后期將進行CC-3 毒理性研究，進一步評價該菌的致病性。

4 結 論

本研究從云南省玉溪市境內(nèi)采集雪茄煙發(fā)酵霉變病病樣，經(jīng)組織分離、形態(tài)學和分子生物學鑒定以及柯赫氏法則試驗，明確了雪茄煙發(fā)酵霉變病的病原為黃曲霉（A.flavus）。通過平板對峙法篩選獲得1 株抑菌能力較強的蠟樣芽孢桿菌。發(fā)酵試驗結果表明，蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）CC-3 可大大降低黃曲霉的侵染率并提高雪茄煙香氣成分含量。