廣東韶關煙區煙草鐮刀菌根腐病病原鑒定及致病性分析

沈會芳，鄧海濱，楊祁云，張景欣，曾 濤，蒲小明，孫大元，林壁潤*

（1.廣東省農業科學院植物保護研究所，廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640；2.廣東省煙草科學研究所，廣東韶關 512026）

鐮刀菌根腐病是嚴重危害煙草的根莖病害之一，能夠造成煙葉大幅減產，甚至絕收。根腐病菌種類復雜，不同地區的致病鐮刀菌種類不同，同一地區煙草根腐病也可由1 種或多種鐮刀菌引起。Lamondia[1]報道尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）是美國康涅狄格和馬薩諸塞州的雪茄煙致病菌。云南鑒定有F.oxysporum[2]、茄病鐮刀菌（F.solani）[3]和輪枝鐮刀菌（F.verticillioides）[4]。河南煙區病原菌有F.oxysporum、F.solani、層出鐮刀菌（F.proliferatum）和F.sinensis[5-6]。為有效防治該病害，需要首先明確該地區致病鐮刀菌的種類和致病性。

廣東韶關煙區以種植濃香型優質煙草為主，多年來，鐮刀菌根腐病零星發生，屬次要病害，但2022年3—7 月間，韶關降雨量明顯高于往年，煙草根腐病突然爆發成災，受害煙田達10%～15%，上升為主要病害，有關廣東省煙區侵染煙草的鐮刀菌種類未見報道。為有效防治該病害，本研究對韶關煙草根腐病菌進行分離純化，測定其致病力，以病菌形態特征與分子技術相結合鑒定病原菌，為生產中有效防治該病害提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病害樣本于2022 年3—7 月采自廣東韶關市的始興、南雄、烏莖和珠璣4 地。供試煙草：粵煙97，由廣東省煙草科學研究所提供。培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），馬鈴薯葡萄糖培養液（PDB）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病害調查及病原菌分離 在廣東韶關的始興、南雄、烏莖、珠璣進行病害調查。采用5 點取樣法，每點調查10 株煙株，記錄發病情況，計算發病率，拍照記錄病害癥狀。采集發病煙株，將病株根莖部用流水洗凈，晾干，從病健交界處切取約4 mm 見方的小塊病組織，參照方仲達[7]的常規組織分離方法，表面消毒后接種到PDA 平板，26 ℃培養5 d，挑取菌落邊緣菌絲接種到PDA 上培養，單孢分離獲得純化菌株。4 ℃保存備用。

1.2.2. 菌株形態特征觀察 將待測菌接種到PDA上，26 ℃培養，每24 h 觀察記錄菌落直徑、形態和顏色變化等。培養6 d 后，制片，觀察菌絲、孢子、分孢梗的顏色、形態，有無厚垣孢子產生，測量大型和小型分生孢子的大小（n=50）。參考前人文獻初步鑒定病原菌。

1.2.3 菌株的分子鑒定 將待測菌接種于PDB 培養液，26 ℃、150 r/min 培養3 d 后收集菌絲，采用uniq-10 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒提取基因組DNA。用ITS（ITS1 和ITS4）[8]、EF-1α（EF1和EF2）[9]和β-Tub（β-tub T01 和β-tub T02）[10]通用引物進行PCR 擴增，20 μL 反應體系：100 ng/μL DNA 模板1 μL、50 μmol/L 正向反向引物各1 μL、2×PCR Mix 預混液8.5 μL、ddH2O 8.5 μL。條件為：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34 個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測得的序列在NCBI 上做BLAST比對，提取GenBank 中相近的序列，用Mega 7.0軟件進行序列比對，構建基于EF-1α 和β-Tub 序列的Neighbor-Joining 系統發育樹，根據分離菌株與已知菌株的親緣關系確定病原菌的分類地位。

1.2.4 菌株致病性測定 參照邱睿等[11]方法，把待測菌株接種于滅菌麥粒上，26 ℃培養7 d，制成帶菌麥粒培養物。取100 g 滅菌土，接入帶菌麥粒（每缽接30 粒），拌勻，施足水后移入4～5 葉齡的健壯煙苗，每盆1 株，置于26 ℃溫室保濕培養。以拌入無菌麥粒為對照，每處理10 盆，3 次重復。接種后每天觀察各處理發病情況，處理后3、5、7 d，調查發病情況，計算發病率和病情指數。根腐病分級調查標準參考《煙草病蟲害分級及調查方法》（GB/T 23222—2008）[12]：0 級，植株生長正常；1級，植株基本生長正常或稍矮化，最下部葉片黃化或萎蔫；3 級，病株比健株矮1/4～1/3，1/2～2/3葉片黃化或萎蔫；5 級，病株比健株矮1/3～1/2，2/3 以上葉片黃化或萎蔫；7 級，病株比健株矮1/2以上，全株葉片黃化或萎蔫；9 級，病株基本枯死。病情指數=∑（病級數值×該病級植株數）/（最高級數×調查總植株數）×100。煙株出現癥狀后，進行病原菌再分離，觀察分離物形態。

1.2.5 數據統計與分析 采用DPS 軟件處理，用鄧肯氏新復極差多重比較法進行差異顯著性分析。

2 結 果

2.1 病害調查及樣本分離

分離病原菌，獲得49 株真菌，通過ITS 序列比對分析，其中45 株為鐮刀菌。采用ITS 序列在NCBI 上進行BLAST 比對時，部分菌株比對結果混亂，無法明確到種，因此，ITS 序列僅用于菌株的初步分類。結合各菌株外部形態特征及ITS 序列分析，將45 株鐮刀菌初步分為4 類（表1），每類隨機選取1～2 株，進行形態特征描述、系統發育分析和致病力測定。

表1 分離菌株情況Table 1 List of isolated strains

Ⅰ類菌株占比最大，為42.22%，廣泛分布在南雄、始興、烏莖和珠璣4 地，采集地發病率較輕，為6.00%～18.00%。Ⅱ類菌株和Ⅲ類菌株均分布于始興和南雄，采集地發病率較重，分別為28.00%～66.00%和24.00%～60.00%。Ⅳ類菌株僅分布于烏莖，采集地發病率較輕。可見，I 類菌株為廣東韶關煙區的優勢菌株，而Ⅱ類菌株和Ⅲ類菌株采集地的發病率明顯偏重。

2.2 4 類鐮刀菌的形態特征

19 株I 類菌株形態特征相似，代表性菌株SGF4和SGF12在PDA上的生長速度為9.00和9.67 mm/d。菌落白色，氣生菌絲稀疏，薄絨狀，菌落背面無色，不產色素（圖1）。分生孢子梗較長，產孢細胞瓶梗狀，多單生。大型分生孢子2～4 個隔膜，多數為3個隔膜，馬特形，較寬，兩端略向內彎曲，頂細胞圓錐形，基細胞鈍圓，大小為(12.29～32.45) μm×(3.52～5.64) μm。小型分生孢子在產孢細胞頂端聚集成假頭狀，紡錘形、梭形，無隔膜，大小為(5.58～13.26) μm×(2.45～4.05) μm。未見厚垣孢子。比對文獻[13-14]，初步鑒定為茄病鐮刀菌（F.solani）。

圖1 Fusarium solani 的形態特征Fig. 1 Morphological characteristics of Fusaium solani

12 株Ⅱ類菌株形態特征相似，代表性菌株SGF25 和SGF29 在PDA 上的生長速度為15.67 和14.33 mm/d（圖2）。菌落外圍白色，內圈粉紅色，氣生菌絲棉絮狀，豐富，菌落背面白色到肉色。產孢細胞瓶形或安瓿瓶形，短，多單生。大型分生孢子3～6 個隔膜，美麗形，孢子細長，腹背平行，頂細胞為細錐形，有喙，大小為(18.04～41.45) μm×(2.86～4.62) μm。小型分生孢子紡錘型或腎形，0～1個隔膜，大小為(4.56～12.48) μm×(2.25～3.62) μm。具厚垣孢子，球形。比對文獻[13，15]，初步鑒定為共享鐮刀菌（F.commune）。

圖2 Fusarium commune 的形態特征Fig. 2 Morphological characteristics of Fusarium commune

9 株Ⅲ類菌株形態特征相似，代表性菌株SGF36 在PDA 上的生長速度為13.67 mm/d（圖3）。菌落白色，氣生菌絲棉絮狀，豐富，表面粗糙，菌落背面為粉紅色。產孢細胞瓶梗狀，短，多單生。大型分生孢子美麗形，細長，較直，兩端稍彎曲，3～5 個隔膜，頂細胞細圓錐形，具喙，基細胞具足跟，大小為(18.54～45.85) μm×(2.35～3.84) μm。小型分生孢子在產孢細胞頂端聚集成假頭狀，長紡錘形、棒形或卵形，0～1 個隔膜，大小為(5.56～16.76) μm×(2.32～3.86) μm，未見厚垣孢子。比對文獻[16]，初步鑒定為藤倉鐮刀菌（F.fujikuroi）。

圖3 Fusarium fujikuroi 的形態特征Fig. 3 Morphological characteristics of Fusarium fujikuroi

5 株Ⅳ類菌株形態特征相似，代表性菌株SGF43 在PDA 上的生長速度為9.33 mm/d（圖4）。菌落外圍白色，內圈淡粉紅色，氣生菌絲薄絨狀，菌落背面粉紅色。產孢細胞瓶梗狀，短，單生。大型分生孢子美麗形，腹背平行，細長，2～5 個隔膜，多為3 個隔膜，頂細胞為細錐形，足跟不明顯或鈍圓，大小為(20.24～32.62) μm×(2.26～3.88) μm。小型分生孢子橢圓形，紡錘形或腎形，0～1 個隔膜，極少具2 個隔膜，隔膜處略有縊縮，大小為(4.24～12.56)μm×(2.84～4.65) μm。未見厚垣孢子。比對文獻[13-14]，初步鑒定為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）。

圖4 Fusarium oxysporum 的形態特征Fig. 4 Morphological characteristics of Fusarium oxysporum

2.3 4 類鐮刀菌的分子生物學鑒定

利用EF-1α 和β-Tub 通用引物對菌株進行PCR擴增，獲得片段長度在750 bp 和1300 bp 左右。用EF-1α 和β-Tub 序列在NCBI 上進行BLAST 比對，結果均較穩定。基于EF-1α 序列構建系統發育樹，見圖5，基于β-Tub 序列構建系統發育樹，見圖6，同時采用TEF-1α 和β-Tub 序列聯合構建系統發育樹，見圖7。SGF4 和SGF12 均與F.solani聚為一支，SGF25 和SGF29 均與F.commune聚為一支，SGF36 與F.fujikuroi聚為一支，SGF43 與F.oxysporum聚為一支。且基因序列一致性均在99%以上。

圖5 基于EF-1α 序列構建的系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on EF-1α sequences

圖6 基于β-Tub 序列構建的系統發育樹Fig. 6 Phylogenetic tree based on β-Tub sequences

圖7 TEF-1α 和β-Tub 序列構建的系統發育樹Fig. 7 Phylogenetic tree based on TEF-1α and β-Tub sequences

結合4 種類型菌株的培養特征、形態特征和系統發育分析，鑒定菌株SGF4 和SGF12 是茄病鐮刀菌（F.solani），SGF25 和SGF29 是共享鐮刀菌（F.commune），SGF36 是藤倉鐮刀菌（F.fujikuroi），SGF43 是尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）。

2.4 4 類鐮刀菌對煙草的致病性測定

4 類鐮刀菌對煙苗的致病性測定顯示，F.solaniSGF4、F.solaniSGF12 和F.oxysporumSGF43 處理后，煙苗未表現萎蔫癥狀，但煙苗矮小，葉片由下至上黃化（圖8-A、8-B、8-C）。F.communeSGF25、F.communeSGF29 和F.fujikuroiSGF36 處理后第2天，煙苗下部葉片開始萎蔫，隨著病情的發展，葉片由下至上黃化萎蔫，植株矮小（圖8-D、8-E、8-F）。

圖8 4 類鐮刀菌對煙苗的致病性（處理后7 d）Fig. 8 Pathogenicity of 4 types of Fusarium to tobacco seedlings（7 d post treated)

處理7 d 后拔出病株，F.solaniSGF4、F.solaniSGF12 和F.oxysporumSGF43 處理的根變黑，有側根但與對照相比較少（圖8-G）。F.communeSGF25、F.communeSGF29 和F.fujikuroiSGF36 處理根部變黑、腐爛，但幾乎無側根。綜上，不同類型鐮刀菌對煙苗均有致病性，其二次分離物與接種菌株均一致，確定4 類菌株均為煙草根腐病的致病菌。

從表2 可見，隨著處理時間的增加，F.communeSGF25、F.communeSGF29、F.fujikuroiSGF36 和F.oxysporumSGF43 侵染的煙苗病情指數明顯上升，病害發展迅速，處理后第7 天，病情指數分別為70.00、72.00、63.67 和52.00，煙株嚴重受害，已無經濟價值（圖9）。F.solaniSGF4 和F.solaniSGF12 侵染的煙苗病情指數上升平緩，雖然下部葉片黃化，但煙株一直可生長，具有一定的經濟價值，處理后第7 天的病情指數為36.67 和32.00。綜上，4 類鐮刀菌對煙草均有致病性，致病力強弱排序為F.commune≈F.fujikuroi＞F.oxysporum＞F.solani。

圖9 4 類鐮刀菌對煙苗生長的影響（處理后7 d）Fig. 9 Effects of 4 types of Fusarium on the growth of tobacco seedlings（7 d post treated)

表2 4 類鐮刀菌處理后煙苗的病情指數Table 2 The disease index of tobacco seedlings treated with 4 types of Fusarium

3 討 論

多種鐮刀菌可侵染煙草引起根腐病，不同地區的致病鐮刀菌種類不同，其中F.oxysporum或F.solani一直是各地煙草鐮刀菌根腐病的優勢致病菌。邱睿等[17]報道河南煙草根腐病菌有4 種，以F.oxysporum為主，占81.25%。蓋曉彤等[18]鑒定云南煙草根腐病病原有7 種鐮刀菌，其中F.oxysporum為優勢菌。而桑維鈞等[19]鑒定貴州煙草根腐病菌以F.solani為主。馬來西亞的主要致病菌也是F.solani[20]。本研究鑒定廣東韶關煙區致病菌有4 種，分別為F.solani、F.commune、F.fujikuroi和F.oxysporum。其中F.solani分布區域最廣，分離菌株數量最多，占比42.22%，為優勢種群。雖然F.solani在韶關煙區分布最廣，但在4 種致病鐮刀菌中，該菌致病性最弱，采集地發病率較輕，為6.00%～18.00%，致病性測定表明，煙株被侵染后，下部葉片變黃，但煙苗一直可生長，仍有一定的經濟價值。這也解釋了韶關煙區2022 年以前雖然每年有根腐病發生，但發病率一直較低，危害較輕，屬次要病害的原因。

但2022 年3—7 月，煙草根腐病在南雄和始興突然暴發，受害煙田面積達10%～15%，發病率在20%以上，嚴重的高達60%，且發病速度快，植株受害嚴重，最后全株枯萎，無任何經濟價值，可見其病原菌致病能力較強。從南雄和始興重病煙株上分離出F.commune和F.fujikuroi兩種鐮刀菌致病力均較強，接種煙苗7 d 病情指數均在63%以上，短期內可致煙苗黃化枯萎死亡。因此判斷造成南雄和始興煙草根腐病暴發的病原菌主要是F.commune和F.fujikuroi。本研究發現，F.commune和F.fujikuroi生長速度較快，在PDA 上生長速度均在13.00 mm/d 以上，當帶菌麥粒接種在土壤中，僅3 d即在土壤表面出現大量白色菌絲。而2022 年上半年，韶關煙區雨量豐富，高于往年，土壤濕度一直較大，兩種鐮刀菌在土壤中大量增殖積累，侵染煙草，最終爆發成災。

F.fujikuroi是一類重要致病鐮刀菌，可侵染多種重要經濟作物，引起水稻惡苗病[21]、玉米莖腐病[22]、大豆種腐病[23]等，造成重大經濟損失。邱睿等[5]雖然在河南煙區檢測出F.fujikuroi，但并未明確其是否具有致病性，本文明確了F.fujikuroi能夠侵染煙草引起根腐病。

4 結 論

本研究以鐮刀菌的形態特征為基礎，結合基于EF-1α 和β-Tub 序列構建的系統發育樹明確了廣東韶關煙草鐮刀菌根腐病菌有4 種，為茄病鐮刀菌（F.solani）、共享鐮刀菌（F.commune）、藤倉鐮刀菌（F.fujikuroi）和尖孢鐮刀菌（F.oxysporum），4 類鐮刀菌對煙草致病性強弱排序為F.commune≈F.fujikuroi＞F.oxysporum＞F.solani。F.solani分布較廣，是廣東韶關煙區的優勢種群。本研究明確廣東韶關煙草根腐病菌的病原菌種類及致病性強弱，可為生產中防治該病害提供依據。