不同成熟度烤煙萜類物質含量及相關基因研究

劉 芳，宋笑龍，馬浩波，孟智勇，宗勝杰，王 宏，張 昭，田洪彰

（1. 河南省農業科學院煙草研究所，河南 許昌 461000；2. 河南省煙草公司洛陽市公司，河南 洛陽 471000；3. 山東臨沂煙草有限公司費縣分公司，山東 臨沂 276000）

香氣是評價煙葉內在質量的核心內容和重要指標。煙葉烤后散發出來的細膩清新的香氣大多來源于致香前體物質的降解，萜類是其中重要一類。煙草中萜類致香前體物主要有類胡蘿卜素（四萜類化合物）、類西柏烷類和賴百當類（二萜類化合物）[1-3]。賴百當類化合物一般只存在于香料煙和部分雪茄煙中，西柏烷類[4-6]則是由烤煙表皮腺毛合成并分泌產生，調制后主要降解為茄酮及其衍生物[7]。類胡蘿卜素屬于四萜化合物，其降解產物是烤煙中性致香物質的重要組成成分，并且香味物質閾值相對較低、刺激性較小、香氣質較好，能夠使煙葉產生木香、花香、果香和甜香等諸多特色香氣[8-9]。前人大量研究了萜類化合物合成和降解途徑[10-12]，也有部分學者對萜類化合物合成關鍵酶基因[13-14]進行分析，但關于不同成熟階段的烤煙萜類化合物相關基因表達與煙葉品質綜合分析的報道較少。成熟度是影響煙葉品質的重要因素，采收成熟度偏低或偏高會導致烤后煙葉表現出青雜氣、刺激性重，香氣不足，口味寡淡等弊端，嚴重影響煙葉原料的工業可用性[15-19]。只有深入研究致香物質在不同成熟度的差異規律，才能精準把握煙草采收最佳成熟度[20-22]。

中煙100 是河南煙區的主栽品種，本項目針對中煙100 不同成熟度腺毛特性和葉面分泌物合成關系進行差異性分析，并分析了萜類化合物合成和降解通路中相關酶基因表達的差異性，結合不同成熟度烤后煙葉香氣物質含量開展比對分析，以期探明煙葉的最適采收期，為進一步提高烤煙香氣質量和工業可用性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022 年在河南省農業科學院煙草研究所試驗田開展，試驗品種為中煙100。試驗地塊肥力中等、均勻一致，行株距為1.2 m×0.5 m，其他田間栽培管理及病蟲害防治按照當地優質煙生產技術規程實施。試驗烤房為密集烤房，符合DB43T 1635—2019 《密集烤房建設及配套設備技術規范》標準。烤房裝煙室規格為：8.0 m×2.7 m×3.5 m。

1.2 試驗設計

以16～18 葉位和10～13 葉位分別代表上部葉和中部葉作為研究目標，以常規成熟采收為對照，根據實際生產，設置采收成熟度差異梯度試驗，成熟度設置及外觀標準如表1。

表1 不同成熟度標準Table 1 Criteria for different maturity levels

分別在各部位葉片不同成熟度階段，取5 株代表性煙株的鮮煙葉，沿主脈兩側截取8片直徑為5 cm的圓形葉片混合用于葉表面分泌物的提取與檢測，同時取10 cm 左右的長條狀葉片混合用于腺毛密度觀察、類胡蘿卜素測定和RNA 的提取，每個處理重復3 次。其他葉片按照設定成熟度采收后，分別以三段式工藝在相同的烘烤條件下進行調制，烤后各處理樣品分別取2 kg 用于常規化學成分測定、香氣成分測定及感官質量評價。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 煙葉腺毛形態觀察及腺毛密度統計 用FAA 固定液固定煙葉，每個樣本做3 次重復，經0.2%羅丹明染料染色30 min 后，用清水去除未結合的羅丹明B，通風條件下自然晾干，沿著葉片中部主脈兩側1 cm 處剪取1 cm×1 cm 左右的葉片組織，使用超景深顯微鏡觀察并拍照，觀察腺毛形態并對腺毛密度進行統計。

1.3.2 類胡蘿卜素含量測定 采用95%乙醇浸提，分光光度計法檢測[23]。

1.3.3 西柏烷二萜醇的測定 取樣后采用氣相色譜-質譜聯用儀（Agilent 7890-5977）按照行業標準YC/T 470—2013 進行西柏烷二萜醇含量的測定與分析，每個處理重復3 次。

1.3.4 煙葉總RNA 的提取 采用RNA 提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）提取參試煙葉的總RNA，將提取的RNA 用適量的DEPC 水（經焦碳酸二乙酯處理過并經高溫高壓滅菌的超純水）溶解后，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.5 萜類化合物合成關鍵酶基因表達量測定采用One Step RT-PCR 反應試劑盒（TaKaRa One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit）在同一反應管內連續進行RNA 的反轉錄和PCR 擴增反應，每個處理重復3 次。根據GenBank 發布的DXR、CYP71D16、PAL、C4H、CHS、4CL和L25（內參基因）序列設計基因擴增引物（見表2）。qRT-PCR反應體系為20 μL：2×PCR Buffer 10 μL，TaqHS 0.4 μL，Mix 0.4 μL，正反向引物各0.4 μL，50×ROX 0.4 μL，Total RNA 2 μL，ddH2O 6 μL。擴增反應條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s（前兩步為反轉錄反應）；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，根據Ct值計算相對表達量。

表2 熒光定量PCR 引物序列Table 2 Sequences of fluorescence quantitative PCR primers

1.3.6 萜類化合物降解的中性致香物質含量測定以二氯甲烷為萃取溶劑，采用Agilent 7890-5977 氣相-色譜質譜聯用儀離子掃描內標（北京微標標物公司）相對定量法對烘烤調制后煙葉的中性致香物質進行定性定量分析[18]，每個處理重復3 次。

1.3.7 常規化學成分測定 不同成熟度煙葉采集后通過同一工藝進行烘烤處理，利用連續流動分析儀，參照行業標準YC/T 159—2002 測定總糖、還原糖，YC/T 160—2002 測定煙堿，YC/T 161—2002測定總氮，YC/T 162—2002 測定氯含量，YC/T 173—2003 測定鉀含量。

1.3.8 感官質量評價 各處理烘烤后的煙葉經過恒溫恒濕回潮，切絲，卷制成（900±15）mg/支、長度為85 mm/支的單料煙支。由評吸專家參照行業標準YC/T 138—1998 對香氣質、香氣量、雜氣、濃度、勁頭、刺激性、余味、燃燒性和灰色9 個單項指標進行打分，取其平均值，采用專家咨詢法并借鑒相關研究方法[24]，對9 個指標分別賦以25%、15%、12%、10%、10%、13%、10%、2.5%和2.5%的權重，采用加權平均法計算各處理的感官質量綜合分值。

1.4 數據分析

采用Excel 2010、SPSS 19.0 進行處理與分析。

2 結 果

2.1 不同成熟度煙葉腺毛形態密度分析

腺毛按其形態可分為長柄腺毛、短柄腺毛和保護毛，一般認為，腺毛密度大、腺毛分泌物多的烤煙吃味醇和、香氣濃郁[7]。腺毛形態如圖1 所示，腺毛密度統計詳見表3。

圖1 不同處理煙葉腺毛形態Fig. 1 Glandular hair morphology in flue-cured tobacco under different treatments

表3 不同處理烤煙腺毛密度Table 3 Glandular hair density in flue-cured tobacco with different treatments

從圖1 和表3 可以看出，各成熟度煙葉均以長柄腺毛居多（占60%左右），短柄腺毛較少（占25%左右），保護毛最少（占15%左右）。中部葉和上部葉的腺毛變化規律一致，隨著成熟度的提高，腺毛密度呈顯著下降趨勢，煙葉長柄腺毛和短柄腺毛脫落嚴重，保護毛變化幅度較小。隨成熟度提高，相鄰成熟度煙葉腺毛總量脫落幅度增大，以T3 與T4處理之間的脫落幅度最大，中、上部葉分別為33.57%、29.50%，T1 與T2 處理之間最小，分別為11.13%、12.33%。

2.2 不同成熟度煙葉類胡蘿卜素含量

類胡蘿卜素是一類重要的四萜類化合物，一般認為類胡蘿卜素含量越高，烤后煙葉刺激性較小、香氣質較好，能夠產生木香、花香、果香和甜香等特色香氣[8]。由表4 可知，隨著煙葉成熟度的提高，中、上部煙葉中的類胡蘿卜素含量均不斷降低，且各處理間差異達到顯著水平。降解幅度隨成熟度提高則表現為慢-快-慢的趨勢，T2 至T3 處理（成熟至完熟階段）降幅最大，中、上部葉分別達到了40.18%、33.83%，T1 至T2（欠熟至成熟）、T3 至T4（完熟至過熟）處理降解幅度相對較小。同一成熟度下煙葉類胡蘿卜素含量表現為中部葉>上部葉。

表4 不同處理烤煙類胡蘿卜素含量Table 4 Carotenoid content in flue-cured tobacco under different treatments

2.3 不同成熟度鮮煙葉西柏烷二萜醇含量

西柏三烯二醇是煙草表面腺毛最主要的分泌物，一般認為，西柏三烯二醇含量越高，煙葉香氣越醇[11]。從圖2 可知，中部葉α-西柏三烯二醇（α-CBD）隨著成熟度的提高呈現先升高后降低的趨勢，T3 處理含量達到最高，分別較T1、T2、T4高出13.77%、6.91%、2.42%；β-西柏三烯二醇（β-CBD）隨著成熟度的提高呈現不斷降低的趨勢；(α+β)-西柏三烯二醇含量在T3 處理時最高，顯著高于其他3 個處理。上部葉α-CBD、β-CBD、(α+β)-CBD含量變化趨勢與中部葉一致，α-CBD 含量T3 處理最高，T3 和T4 處理均顯著高于T1、T2，β-CBD含量 T1 處理最高，且不同處理間差異顯著；(α+β)-CBD 含量T3 處理最高，達到289.89 μg/g。

圖2 不同處理烤煙西柏三烯二醇含量Fig. 2 Content of cetylene glycol in flue-cured tobacco under different treatments

2.4 不同成熟度煙葉萜類化合物代謝基因表達量

基因CYP71D16和DXR共同參與了西柏烷類化合物的合成，基因PAL、C4H、4CL及CHS是類胡蘿卜素降解與轉化的關鍵基因。由圖3 可知，隨著成熟度的增加，烤煙上部葉CYP71D16和DXR基因表達量呈現先升后降的趨勢，均在T3 處理達到最高；類胡蘿卜素降解的關鍵基因PAL及4CL的表達量隨著成熟度的增加逐漸升高，C4H、CHS基因的表達量均表現為先升后降的趨勢，在T3 處理達到最高且顯著高于其他3 個處理。烤煙中部葉CYP71D16和DXR基因表達量呈現先升后降的趨勢，其中CYP71D16的表達量以T2 處理最高，且各處理間存在顯著差異，而DXR的表達量以T3 處理最高；類胡蘿卜素降解的關鍵基因PAL的表達量呈上升趨勢，C4H、4CL及CHS的基因表達量逐漸上升，在T3 處理達到最高后開始呈現降低趨勢。

圖3 不同處理萜類化合物合成與降解關鍵基因表達量Fig. 3 Expression levels of key genes for synthesis and degradation of terpene compounds under different treatments

2.5 不同成熟度煙葉萜類化合物降解的中性致香物質含量

從表5 可知，隨著成熟度的提高，類胡蘿卜素降解類中性致香成分總量呈現逐漸降低的趨勢，與2.2 中類胡蘿卜素的研究結果一致。

表5 不同處理烤后煙葉萜類化合物降解的中性致香物質含量Table 5 Contents of neutral aroma components degraded by terpenes in flue-cured tobacco leaves with different treatments μg/g

西柏烷類降解的中性致香成分總量呈現先升高后降低的趨勢，中、上部葉均以T3 處理達到最高。中部葉T3 處理分別較T1、T2、T4 高出9.54%、4.44%、6.15%，上部葉T3 處理分別較T1、T2、T4高出37.50%、21.22%、12.73%。同一成熟度，中部葉>上部葉，與2.3 中西柏烷二萜醇的研究結果相一致。

2.6 不同成熟度烤后煙葉常規化學成分差異

從表6 可知，隨著成熟度的增加，上部葉總糖、還原糖呈先升高后降低的趨勢，以T3 處理最高，且顯著高于其他3 個處理。總氮含量逐漸降低，各處理的鉀離子、氯離子和煙堿含量差異不顯著，其中煙堿含量（3.55%～3.96%）偏高。中部葉總糖、還原糖呈先升高后降低的趨勢，以T2 處理最高，各處理的總氮、煙堿、氯離子含量差異不顯著，鉀離子含量T3 處理顯著高于T1、T2、T4，分別高出16.84%、17.89%、15.79%。從化學成分協調性[25]來看，上部葉T3 處理的糖堿比、鉀氯比均最高，各處理的氮堿比差異不大；中部葉糖堿比、氮堿比、鉀氯比均以T3 處理最高。結果表明，在一定范圍內，成熟度的增加有利于總糖和還原糖含量及糖堿比和鉀氯比的提升，使烤后煙葉化學成分更協調。

表6 不同處理烤后煙葉常規化學成分Table 6 Conventional chemical components of flue-cured tobacco leaves with different treatments

2.7 不同成熟度烤后煙葉感官質量

由表7 可知，中、上部煙葉不同成熟度的感官質量評價結果均以T3 處理表現最佳。上部葉T3 處理的香氣質好、勁頭足、刺激性小、余味綿長，吸食口感表現為細膩柔和，有回甜香，T1 處理燃燒性稍差，香氣透發性不佳，香氣量略顯不足，而T4處理煙氣口感較差，刺激性明顯，濃度稍低。中部葉T3 處理表現為香氣質好、香氣量大，煙氣狀態較好，抽吸時滿足感強，相比于T3 處理，T2 處理香氣量、煙氣濃度較好，稍有雜氣，余味稍殘留，T4 處理香氣量略欠缺，濃度偏低，勁頭、燃燒性較差，而T1 處理煙氣質量略粗糙，香氣質欠佳，雜氣重，余味平淡，綜合表現最差。中部葉感官質量綜合得分表現為：T3>T2>T4>T1。

3 討 論

本研究通過測定6 個與對萜類化合物合成與降解相關基因表達量，結合成熟過程中煙葉表面腺毛變化情況及烤后煙葉品質，證實煙葉成熟度是影響烤煙香氣成分的重要因素，與烤后煙葉香氣含量及感官評吸質量密切相關。隨著葉片逐漸成熟，長柄腺毛的腺頭逐漸脫落，腺毛密度降低，與前人研究一致[7]。在完熟葉片中基因CYP71D16和DXR的表達量最高，對應烤后完熟煙葉中性致香成分總量最多、感官評價得分最高，表明煙草中二萜類物質的降解物無論是在提升煙香、改善煙氣余味還是在降低煙氣刺激性、增進吸味等方面都發揮了重要的作用，與彭國崗等[11]、張思琦等[13]研究結果一致。隨著成熟度的增加，基因PAL的表達量上調，C4H、CHS基因在完熟葉片中表達量最高，表明類胡蘿卜素轉化、降解過程關鍵基因表達量與煙葉品質密切相關，與文利超[14]等研究結果中類胡蘿卜素降解基因PAL表達下調趨勢相反。該文獻中煙葉樣品主要集中在大田旺長期，煙葉中的類胡蘿卜素處于積累階段，而本文煙葉采集于成熟衰老后期，類胡蘿卜素以降解為主，這可能是類胡蘿卜素降解酶基因表達量存在差異的重要原因。

本研究表明，在一定程度上，成熟度越高的煙葉物質轉化越充分，化學成分越協調，香氣越飽滿，但過熟煙葉會導致內含物質降解過度，煙氣平淡無味，滿足感降低，整體質量下降，與前人研究結果一致。由于烘烤工藝也是影響煙葉色素降解幅度及香味物質含量的重要因素，不同成熟度煙葉自身生理生化變化不同，導致失水、變黃過程對烘烤條件的需求可能存在差異，但本文通過對烤前煙葉的萜類物質及相關基因表達量進行差異分析，避免了烘烤工藝對煙葉質量的影響，為選擇適宜成熟度提供了更有效的數據支撐。本文涉及的西柏烷類只是腺毛分泌物中的一類，其他腺毛分泌物含量及對煙葉質量的影響有待于進一步研究。

4 結 論

本研究觀測了不同成熟度中煙100 腺毛形態、結構以及主要萜類化合物含量的差異，利用qRT-PCR 技術初步探索了烤煙萜類化合物合成與降解相關酶基因表達量，結合煙葉內在品質綜合分析表明，在當前煙葉生產中煙100 成熟采收基礎上推遲采收5～7 d，使煙葉達到完熟程度，可提高煙葉的香氣物質生成量，減輕烤后煙葉煙氣雜氣、刺激性，提高中上部煙葉質量及工業可用性。