內生菌對鎘脅迫蠶豆根尖細胞毒理效應的影響

馬蓮菊, 趙海彤, 任苓姝, 劉伊凝, 王 澤

(沈陽師范大學 生命科學學院, 沈陽 110034)

隨著工業的發展,重金屬污染越來越嚴重。鎘(Cd)是農業生產中的主要污染重金屬,其毒性僅次于汞。鎘不是植物生長的必需元素,過量的鎘對植物有很大毒害作用[1]。近年來,國內外學者關于鎘對植物生理生化影響方面的研究有很多,但從遺傳毒理方面所做的研究較少。

蠶豆是一種廣泛種植的經濟作物,是進行遺傳學及毒理學研究的理想材料[2]。1982年由Francesca等[3]建立的蠶豆根尖細胞微核技術深受人們重視,在細胞遺傳毒性檢測中得到了廣泛應用。

植物內生菌作為一種新的微生物資源,在農業上極具應用潛力。內生菌是植物微生態系統中的重要組成成分,能提高農作物的生長發育,增強農作物的抗重金屬、抗鹽堿、耐干旱、耐寒和抗病蟲害發生能力等,進而提高宿主植物對環境的適應性,從而保持植物生態系統的穩定[4]。

在前期的研究中,課題組從野大豆中分離純化出一株內生菌YD25,發現其具有吸附重金屬的作用。因此,選用內生菌YD25侵染蠶豆根尖,研究其對Cd脅迫蠶豆根尖細胞遺傳毒理的影響效應,以期探明內生菌對植物根尖細胞的誘抗活性,為內生菌的研究開發與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為日本青蠶豆種子;內生菌YD25由沈陽師范大學微生物遺傳實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 內生菌培養

將保存于PDA固體培養基中的內生菌YD25轉接到PDA液體培養基中,并在24 ℃和120 rpm的恒溫搖床中培養,10 d后待用。

1.2.2 蠶豆培養及處理

在盛有蒸餾水的燒杯中放入洗干凈的蠶豆種子,然后將其置于25 ℃的溫箱內浸泡12～24 h,此期間換水次數至少2次。將吸漲后的種子放入鋪有薄層濕潤脫脂棉的平皿內,溫箱溫度調節為25 ℃,將平皿放入其中,催芽36～48 h,期間換水2～3次至大部分種子初生根長為1～2 cm。

將已完成催芽的蠶豆種子分為2組,侵染組(E+)將30 mL 1%菌懸液加入蠶豆種子培養液中,進行內生菌侵染;未侵染組(E-)則不加入菌懸液,直接加入等量蒸餾水培養。2組同時用不同濃度CdCl2溶液(0, 4和8 mg·L-1)處理8 h,再進行鎘脅迫處理,共6組,然后將處理好的種子用蒸餾水浸洗3次,每次2～3 min,洗凈后在25 ℃下恢復培養22～24 h。

恢復培養后,在根尖細胞分裂高峰期,切取1 cm左右根尖,使用Carnoy固定液固定2～24 h。

1.3 測定方法

1.3.1 解離

用蒸餾水浸洗固定好的根尖2次,每次5 min,吸凈蒸餾水。用1 M HCl在60 ℃下解離11 min左右,再用冷1 M HCl洗1次。吸去HCl,用蒸餾水浸沒根尖3次,每次1～2 min。

1.3.2 染色

在10 ℃左右的黑暗條件下,用Schiff試劑染色1 h。

1.3.3 漂洗

用漂洗液漂洗3次,每次3～5 min。

1.3.4 水洗、壓片、鏡檢

水洗5～10 min,滴一滴45%醋酸壓片。將制片置于低倍鏡下找到分生組織區中細胞分散均勻和分裂相較多的部位,再轉換到高倍鏡下觀察。每組觀察根尖數為10個,每個根尖約1 000個細胞。

1.4 統計分析

進行根尖細胞微核千分率(MCN‰)、抑制率(%)、有絲分裂指數及染色體畸變率測定。

2 結果與分析

2.1 內生菌對鎘脅迫下蠶豆根尖細胞微核的影響

由表1可見,在無鎘脅迫下,陰性對照微核率最低(5.92±0.35‰),內生菌侵染后微核率明顯降低,抑制率達到21.11%;在鎘脅迫下,隨著鎘溶液濃度的增加,E-組與E+組的蠶豆根尖細胞微核率均增大,微核率與鎘溶液濃度之間表現為明顯的正相關。內生菌對微核的產生表現出明顯的抑制作用,抑制率達到20%以上,但隨著鎘溶液濃度上升,抑制率呈現下降趨勢,說明高濃度的鎘對內生菌作用有一定阻礙;在鎘溶液濃度相同的情況下,E+組蠶豆根尖細胞微核率均明顯低于E-組(p<0.01或p<0.05)。

表1 內生菌對鎘脅迫下蠶豆根尖細胞微核率、有絲分裂指數、染色體畸變率的影響

2.2 內生菌對鎘脅迫下蠶豆根尖細胞有絲分裂指數的影響

在無鎘脅迫下,E+和E-組相比,E+的有絲分裂指數明顯更高,且差異顯著(p<0.05);在鎘脅迫條件下,蠶豆根尖細胞有絲分裂指數隨鎘溶液濃度增加而呈下降趨勢,具有濃度效應。在同樣濃度的鎘脅迫下,蠶豆根尖經內生菌侵染處理后有絲分裂指數明顯升高(表1)。由此說明,內生菌對蠶豆根尖細胞有絲分裂存在著顯著的促進作用。

2.3 內生菌對鎘脅迫下蠶豆根尖細胞染色體畸變率的影響

由表1可見,鎘脅迫的根尖細胞染色體畸變率均大于未加鎘培養的根尖,說明鎘脅迫導致蠶豆根尖細胞有絲分裂過程中染色體發生畸變。內生菌具有顯著的降低蠶豆根尖細胞染色體畸變的功能。在無鎘脅迫下,E+組蠶豆根尖細胞染色體畸變率明顯低于E-組(p<0.05)。在同濃度的鎘溶液處理時,E+組較E-組的染色體畸變率明顯降低。

3 討 論

3.1 內生菌對鎘脅迫下蠶豆根尖細胞有絲分裂的影響

重金屬對蠶豆根尖細胞分裂的抑制作用主要體現在延長分裂間期使分化的細胞數量下降[5]。當植物抵抗重金屬脅迫時,代謝系統被激活,加速了重金屬離子的進入,使植物的代謝活動受到抑制,從而對植物產生了毒害作用[6]。在重金屬離子濃度高時,毒害作用超過了植物自身的保護作用,核酸酶活性降低,使DNA合成速率減慢,分裂間期延長,或與DNA結合,造成DNA的交聯,阻礙DNA復制的順利進行[7]。本研究發現,在一定的濃度范圍內,有絲分裂指數隨鎘離子濃度升高而逐漸降低,表明鎘縮短了細胞分裂期,延長了細胞分裂間期。內生菌對促進蠶豆根尖細胞分裂具有顯著作用,同時能有效地削弱鎘對蠶豆根尖的毒害作用。這表明內生菌可以誘導蠶豆根尖細胞周期發生變化,即縮短細胞分裂間期,促進細胞進入分裂態。有學者指出,內生菌具有合適的降解途徑或重金屬整合系統,能夠提高宿主植物對重金屬的耐受能力,從而有助于宿主植物在重金屬脅迫條件下生存[8]。

3.2 內生菌對鎘脅迫下蠶豆根尖細胞染色體畸變的影響

染色體畸變是微核形成的主要原因。染色體或染色單體斷裂會導致染色體或染色單體缺失,或者引起各種重排,從而出現染色體結構異常。鎘直接作用于DNA使DNA和蛋白質的合成及RNA轉錄受到干擾,使與染色體運動有關的物質(如紡錘體蛋白等)不能合成,或合成減少,造成染色體損傷后不能正常修復[9]。在本研究中,鎘脅迫作用于蠶豆根尖,導致不同程度的染色體畸變,染色體的畸變率與鎘的濃度呈正相關。被鎘染毒處理后的蠶豆根尖細胞內存在著多種染色體畸變類型,如染色體斷片、染色體滯后、染色體橋、多極分裂等。有研究指出,內生菌能夠提高植物對非生物脅迫的抗逆性,具有很強的耐重金屬性能[10-11]。通過本研究的數據也可以證明這一點,E+組染色體畸變率明顯低于E-組。

3.3 內生菌對鎘脅迫下蠶豆幼苗根尖細胞微核的影響

微核是指位于細胞質中完全與主核分開的圓形或橢圓形的小核[12]。微核產生與具有損壞性質的理化因子的作用有關, 這些因子使染色體發生斷裂,成為斷片,斷片不能進入子細胞而形成微核。因此, 微核率的高低可反映遺傳損傷的程度[13]。目前, 微核檢測技術已成為評價包括重金屬在內的環境污染物毒性的有效方法[14]。本研究結果表明,蠶豆根尖細胞微核率隨鎘濃度的增加而增加,且與染色體畸變率呈正相關。施加內生菌YD25后能有效地減少染色體畸變的產生,從而抑制蠶豆根尖細胞中微核的形成。因此,內生菌YD25可用來緩解鎘毒害,促進作物生長。

致謝感謝沈陽師范大學大學生創新創業訓練計劃資助項目(X202210166078X)的支持。