不同處理措施對牛糞樣中隱孢子蟲卵囊殺滅效果觀察

江 斌 陳秀琴 吳勝會 林 琳 張世忠 蔡 羲

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013）

隱孢子蟲是一種主要寄生于人和多種動物胃腸道和呼吸道上皮細胞內(nèi)的寄生性原蟲。 目前已知的隱孢子蟲基因型有70 多種， 主要有安氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲、貝氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲等[1]。 犢牛感染隱孢子蟲后主要表現(xiàn)為精神沉郁、 厭食、腹瀉， 排出的糞便呈灰白色或黃褐色， 內(nèi)含大量纖維素、血液及黏液，后期呈水樣，嚴重的可導(dǎo)致犢牛發(fā)病死亡。 患牛排出的糞便會污染牛場及水源， 糞便中的隱孢子蟲卵囊在野外進一步發(fā)育為感染性卵囊并通過水源或土源性食物把病原傳染給其它牛只或人類，對人畜健康構(gòu)成威脅。 2022 年11 月，診療中心門診接收一腹瀉犢牛病例， 經(jīng)診斷為牛隱孢子蟲病，取患牛的糞樣分別采用1%甲醛溶液、1%二氯異氰脲酸鈉溶液、2%燒堿溶液以及密封厭氧發(fā)酵處理，經(jīng)5 d、10 d、15 d、20 d 后分別采用蔗糖漂浮、涂片、改良抗酸染色檢測樣本中牛隱孢子蟲卵囊數(shù)量，評價不同處理措施對糞樣中牛隱孢子蟲卵囊的殺滅效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 陽性糞樣卵囊數(shù)確定 取在診療中心被診斷為牛隱孢子蟲感染陽性犢牛糞樣2 g，置于燒杯中，加入蒸餾水10 mL，攪勻后用160 目銅篩過濾，濾液置于錐形量杯中，3 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，留下杯底糞渣，加飽和蔗糖溶液攪拌均勻，吸取表層液50 μL 進行涂片， 晾干后采用改良抗酸染色， 并在油鏡下檢查圓形或橢圓形并呈紅色的隱孢子蟲卵囊數(shù)量[2]。 計算4 個視野的卵囊數(shù)平均為13.25 個。 把該陽性糞樣100 g 分為5 份， 每份約20 g，分別裝入100 mL 塑料容器內(nèi)進行相關(guān)試驗。

1.1.2 消殺試劑 配制1%甲醛溶液、1%二氯異氰脲酸鈉溶液、2%燒堿溶液。

1.2 方法 把100 g 牛隱孢子蟲陽性糞樣均勻分別裝入5 個100 mL 規(guī)格的螺口塑料容器內(nèi)， 分別編號為A 組、B 組、C 組、D 組以及對照組。A 組糞樣中加入1%甲醛溶液5 mL；B 組糞樣加入1%二氯異氰脲酸鈉溶液5 mL；C 組糞樣加入2%燒堿溶液5 mL；D 組糞樣不加任何物質(zhì)并旋緊瓶口保持封閉狀態(tài)；對照組糞樣不加蓋，自然放置于室內(nèi)作為對照組。5 d、10 d、15 d、20 d 時各組分別取2 g 糞樣進行過濾、離心、漂浮、涂片、改良抗酸染色、鏡檢，計算每組4 個視野的隱孢子蟲卵囊數(shù)量的平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)用Excel 進行整理， 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進行分析，以P＜0.05 為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

從表1 看出，A 組糞樣經(jīng)處理后5 d、10 d、15 d、20 d 時檢出卵囊數(shù)量平均為3.5 枚、0.5 枚、0 枚、0 枚；B 組糞樣經(jīng)處理后相應(yīng)時間點卵囊數(shù)量平均為1.75 枚、0.25 枚、0 枚、0 枚；C 組糞樣經(jīng)處理后相應(yīng)時間點卵囊數(shù)量平均為7.5 枚、5.25 枚、2.75 枚、0.75 枚；D 組糞樣經(jīng)處理后相應(yīng)時間點卵囊數(shù)量平均為9.75 枚、6.50 枚、4.75 枚、3.00 枚； 對照組糞樣經(jīng)處理后相應(yīng)時間點卵囊數(shù)量平均為10.50 枚、8.50 枚、8.00 枚、7.25 枚。 三組消毒劑對牛隱孢子蟲均有不同程度的殺滅效果，其中B 組（二氯異氰脲酸鈉）效果較好，其次為A 組和C 組。 B 組與A 組之間差異顯著（P＜0.05），B 組與C 組之間差異極顯著（P＜0.01），A、B、C 三組與對照組之間差異極顯著（P＜0.01）。 密封厭氧發(fā)酵（D 組）對卵囊殺滅也有一定效果，與對照組之間差異顯著（P＜0.05）。

表1 不同處理措施對牛糞樣中隱孢子蟲卵囊的殺滅效果

3 討 論

從試驗看，1%甲醛溶液、1%二氯異氰脲酸鈉溶液、2%燒堿溶液對牛隱孢子蟲卵囊均有較好的殺滅作用， 密封厭氧處理對牛隱孢子蟲也有一定的殺滅效果。 甲醛殺滅卵囊的機理是甲醛與卵囊殼的蛋白質(zhì)相結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝固變性，起到對卵囊壁的破壞作用[3]。 一些報道也證實了甲醛的滅蟲效果[4]，在4 ℃條件下， 隱孢子蟲卵囊接觸到10%福爾馬林18 h 后會降低卵囊的感染性。 二氯異氰脲酸鈉加水后可生成活性氯和新生態(tài)氧， 對卵囊壁蛋白質(zhì)產(chǎn)生氯化和氧化反應(yīng)，故對卵囊有較好的殺滅作用[3]，孟德磊也證實氯消毒劑殺滅卵囊的效果，6%漂白粉持續(xù)作用2 h 可滅活92%隱孢子蟲卵囊[4]。在本試驗中，燒堿對牛隱孢子蟲卵有較好的殺滅效果，但效果不如二氯異氰脲酸鈉和甲醛， 分析可能與燒堿HO-不能破壞卵囊壁有關(guān)。 但也有研究表明堿類消毒劑中的HO-也能滲透到卵囊內(nèi)或孢子囊內(nèi)， 起到抑殺球蟲卵囊發(fā)育作用[5]。 在密封厭氧條件下，糞便會在厭氧條件下不斷發(fā)酵產(chǎn)生生物熱， 致使糞便溫度升高，高溫對孢子蟲卵囊的發(fā)育有抑制或殺滅作用，據(jù)報道， 在45～60 ℃潮濕環(huán)境下持續(xù)5～9 min 可完全滅活隱孢子蟲卵囊的活性[4]。

評價消毒劑對隱孢子蟲卵囊的的抑殺效果，除了檢查樣本卵囊數(shù)量變化外， 還可以通過在顯微鏡下觀察卵囊內(nèi)孢子發(fā)育情況（即卵囊孢子化率）進行評價，相關(guān)試驗有待進一步研究。

隱孢子蟲病是一種重要的多種動物共患病，會對人和動物健康構(gòu)成巨大的威脅， 也會造成重大的經(jīng)濟損失。隱孢子蟲主要通過糞口途徑傳播，易感動物或人類通過攝入含有孢子化卵囊的水、 食物或接觸到被污染的物品而感染。 衛(wèi)生措施對于減少環(huán)境中的隱孢子蟲至關(guān)重要。 首先在養(yǎng)殖場要做好動物糞便的無害化處理，及時清理糞便，可以采用糞便的堆集發(fā)酵或異位發(fā)酵來殺滅糞便中的孢子化卵囊，平時做好養(yǎng)殖場環(huán)境衛(wèi)生是防控該病的主要措施。其次， 對養(yǎng)殖場產(chǎn)生的污水和尿液要集中進行厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣， 經(jīng)過處理的沼液或沼渣可用于農(nóng)作物澆灌或堆肥。第三，對被污染的地面要采用含氯或醛制劑等消毒藥進行消毒，并保持地面干燥，阻止卵囊的孢子化。對飲用水要定期采用氯制劑進行消毒，可以抑殺水源中細菌和卵囊，確保水源干凈和無公害。