抗鼠棒狀桿菌單克隆抗體制備及鑒定

余建國 朱樓英

(1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江金華 321017；2.金華市實驗動物中心 浙江金華 321007）

鼠棒狀桿菌 （Corynebacterium kutscheri，CK）主要寄生于大鼠、小鼠上呼吸道，為動物源性致病菌，常為隱性感染。 臨床上主要表現(xiàn)偽結(jié)核癥狀或化膿性炎癥， 在鼠免疫功能損傷或抑制、 外界環(huán)境改變時，可引起鼠急性死亡。

實驗動物國家檢測標準中， 鼠棒狀桿菌是清潔級大鼠、小鼠必須排除的項目。鼠棒狀桿菌調(diào)查診斷方法目前有病原菌分離培養(yǎng)方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)（PCR）方法。實驗動物國家標準（GB/T14922-2011）中規(guī)定的檢測方法也是細菌學(xué)分離、血清學(xué)檢測，該檢測方法操作復(fù)雜，耗時長，容易造成漏檢。PCR 法雖然靈敏、快速，但儀器設(shè)備要求高，檢測成本昂貴，不適合基層規(guī)模推廣應(yīng)用。

單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展及其優(yōu)越性，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等生物技術(shù)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。 在鑒定細菌種類方面， 單克隆抗體技術(shù)具有的高靈敏性和高特異性是其它方法無法比擬的。 本研究通過細胞融合技術(shù)，篩選出分泌抗CK 單抗的雜交瘤細胞株，從而制備靈敏且特異度高的單克隆抗體， 為構(gòu)建可用于臨床快速檢測的血清學(xué)方法奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c 雌性小鼠(6～8 周齡)，由金華市實驗動物中心提供； 鼠棒狀桿菌的純培養(yǎng)菌體，由浙江省實驗動物中心惠贈。

1.1.2 試劑 鼠棒狀桿菌ELISA 檢測試劑盒、牛血清白蛋白、卵清蛋白等，市售；PBS、CBS 等緩沖液由實驗室自制。

1.2 方法

1.2.1 免疫抗原制備 收集鼠棒狀桿菌的純培養(yǎng)菌體，以小體積生理鹽水調(diào)至懸浮，冰浴條件下超聲粉碎5 min (150 W)， 粉碎物4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，收集上清。細菌沉渣重復(fù)超聲5 min，重復(fù)離心，取上清液4 ℃冷藏備用。

1.2.2 動物免疫 取4 只BALB/c 雌性小鼠（6～8 周齡）， 頸部及背部皮下多點注射免疫， 免疫劑量為50 μg/只，共免疫4 次。 初次免疫為1.2.1 中制備的免疫原與等體積弗氏完全佐劑乳化；加強免疫時，免疫抗原與等體積弗氏不完全佐劑乳化， 免疫劑量方式等均不變。 免疫間隔期為21 d， 第4 次免疫后10 d， 采尾根血10 μL， 加入到990 μL PBS 中，混勻，5 000 r/min 離心10 min，棄沉淀；收集上清、混勻，5 000 r/min 離心10 min， 棄沉淀， 上清保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3 細胞克隆 將致敏的脾細胞與SP2/0 瘤細胞以按文獻方法進行融合[1]。 14 d 后，用含鼠棒狀桿菌的大鼠肝勻漿做抗原，檢測培養(yǎng)上清。 融合前1 周，采用常規(guī)方法處理，復(fù)蘇凍存的SP2/0 細胞；采集血清效價符合試驗要求的小鼠脾細胞， 轉(zhuǎn)移至無菌篩網(wǎng)上，以注射器硅膠頭充分研磨脾臟，重復(fù)滴加PBS沖洗篩網(wǎng)3 次，收集研磨混合液，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，1 000 r/min 離心5 min， 收集后重懸15 min，以PBS 液洗滌溶液3 次，計數(shù)。

將SP2/0 細胞與脾臟細胞按1:5 混合， 按文獻方法進行細胞融合[2]。 采用間接ELISA 方法進行克隆篩選， 獲得能分泌抗鼠棒狀桿菌的特異性抗體且穩(wěn)定生長的瘤細胞系。 收集單克隆抗體細胞培養(yǎng)上清，用于鑒定，將細胞凍于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 單克隆抗體的制備與純化

1.2.4.1 單抗的制備 采用體內(nèi)誘生腹水法制備單克隆抗體，選取10 周齡左右的F1 昆明小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 mL 液體石蠟，5 d 后通過腹腔注射處于對數(shù)生長期的陽性雜交瘤細胞， 每只小鼠注射1×106個細胞；7～10 d 后， 待小鼠腹部明顯膨大時，無菌收集小鼠腹水，以3 000 r/min 離心15 min，以去除細胞與雜質(zhì)，加入適量防腐劑（防腐劑體積為腹水體積的0.05%），收集腹水上清并于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 單抗的純化 以辛酸硫酸銨沉淀法對單克隆抗體純化[3]。 將醋酸鈉-醋酸緩沖液（0.05 mol/L，pH4.2）與小鼠腹水上清按1:2 混合均勻，室溫下均勻加入正辛酸（每毫升上清加25 uL）；4 ℃靜置2 h，低溫下以15 000 r/min 離心30 min， 收集濾紙過濾液，校正pH 值至7.2。 冰浴條件下，均勻緩慢加入飽和硫酸銨溶液，調(diào)整硫酸銨的飽和度至45%，繼續(xù)攪拌30 min， 冰上靜置4 h，4 ℃下10 000 r/min 離心30 min，棄掉上清，保留沉淀；向沉淀中加入2 mL PBS，將溶液混勻后轉(zhuǎn)移至PBS 緩沖液中進行透析；透析液體在4 ℃條件下12 000 r/min 離心25 min，收集上清并分析抗體純度。

1.2.5 單克隆抗體的鑒定

1.2.5.1 單抗效價和靈敏度測定 用1.2.2 中制取的血清，采用間接ELISA 法測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的腹水效價， 抗體濃度稀釋倍數(shù)依次為2×102、4×102、8×102、16×102、32×102、64×102、128×102， 配置濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 ng/mL（CK 菌液懸液），用作靈敏度檢測。

1.2.5.2 抗體特異性的鑒定 以間接競爭ELISA法，設(shè)定泰澤氏菌（BP）、巴氏桿菌（PMU）、沙門氏菌（SE）、弓形蟲（TO）為參照，檢測單抗與CK 類似物的交叉反應(yīng)。

1.2.5.3 親和力試驗 親和力反應(yīng)可以提示單抗（mAb）的純度，本試驗采用間接ELISA 法檢測mAb與5 種免疫球蛋白的交叉反應(yīng)。 取1 μg/mL 天然IgE、IgG、IgM、IgA、IgD，按0.1 mL/孔進行包被，一抗選用非血清培養(yǎng)細胞上清液（0.1 mL/孔），二抗選取臨時稀釋的HRP 標記的山羊抗小鼠IgG （0.1 mL/孔）。 各孔加入0.1 mL TMB 進行顯色，最后各反應(yīng)孔中加入2 mol/L 硫酸0.05 mL 終止反應(yīng)。 于450 nm 處測各孔吸光度（A）值（見圖1）。

結(jié)果顯示：4 只實驗鼠的免疫抗體都能被CK 抗原抑制，半數(shù)抑制濃度（IC50）在150～4.69 ng/mL，其中3 號小鼠的IC50最好，由抑制曲線（見圖2）計算IC50為4.77 ng/mL。 3 號鼠的血清效價最高，靈敏度最強，所以，3 號鼠備選作親和試驗。 據(jù)CK-mAb 靈敏度測定結(jié)果， 可得親和度線性回歸方程：y=-0.4229x+0.4714，R2=0.0782， 經(jīng)計算， 其IC50為0.86 ng/mL[10]。 親和曲線顯示（見圖2）：當(dāng)包被抗原濃度為1.0 μg/mL 和0.5 μg/mL，mAb 與抗原結(jié)合達到50%飽和狀態(tài)時的濃度分別為3.16 μg/mL 和2.85 μg/mL，通過親和常數(shù)公式計算出親和常數(shù)Ka為1.96×109L/mol[4]。

圖2 3 號鼠親和力檢測結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 單抗效價和靈敏度檢測結(jié)果 由表1 可知，第4 次免疫10 d 后，4 只受免鼠均產(chǎn)生了血清學(xué)抗體，效價在1.6×103～1.28×104，抗體水平均值非常高。 免疫小鼠血清單抗靈敏度檢測結(jié)果見表2。

表1 單抗效價檢測結(jié)果

表2 單抗靈敏度檢測結(jié)果

2.2 單抗（CK-mAb）特異性鑒定 3 號小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0 融合后，經(jīng)過有限稀釋法[5]亞克隆和ELISA 篩選， 最后得到1 株能夠穩(wěn)定分泌抗CK-mAb 的雜交瘤細胞09A2B5，通過體內(nèi)誘生腹水法批量制備出抗體。 間接ELISA 測定腹水效價，細胞上清的效價為1:1 600，腹水的效價為1.256×105。從特異性試驗結(jié)果間接可知（見表3），單抗與泰澤氏菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、弓形蟲的交叉反應(yīng)比例分別為1.47%、0.91%、0.42%、0.06%。

表3 特異性試驗結(jié)果

3 討論與分析

單克隆抗體制備中， 高效價抗體的獲取相對簡易，但抗體的特異性易因雜蛋白干擾而呈現(xiàn)異常[6]。本試驗制備的鼠棒狀桿菌單克隆抗體 （CK-mAb），具有良好的特異性，為構(gòu)建血清學(xué)快速檢測方法（膠體金檢測法）奠定了堅實的基礎(chǔ)。

本研究在篩選瘤細胞系過程中， 采用了有限稀釋法，該法的缺點是需要進行多次克隆，延展了試驗周期。有文獻提示，甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法可以較好解決這一問題[7]，在未來的研究中有待進一步探索。

在mAb 交叉免疫試驗中，mAb 與天然IgE 的反應(yīng)性總體較好，與其它免疫球蛋白的反應(yīng)性極低，提示單抗本身極強的親和性。文獻提示，單抗的親和力與蛋白表達系統(tǒng)有密切關(guān)聯(lián)， 利用哺乳動物蛋白表達系統(tǒng)， 活性蛋白所必需的空間結(jié)構(gòu)和修飾更接近于天然狀態(tài)，與原核表達系統(tǒng)比較，能彌補缺少高級修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，表達的蛋白不能很好地折疊等缺陷， 對單克隆抗體的表達具有明顯的優(yōu)勢。

實驗動物的快速檢測技術(shù)相對缺乏， 以小鼠棒狀桿菌單克隆抗體為基礎(chǔ)的快速檢測方法的構(gòu)建，為實驗動物微生物評價和質(zhì)量控制提供了一條新的途徑。尤其是在病毒測定中，快速檢測可以發(fā)揮積極的作用。