兔源A 型多殺性巴氏桿菌雙重PCR檢測方法的建立

王錦祥 付環茹 孫世坤 陳冬金 高承芳 桑 雷 謝喜平＊

（1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013；2.福建省畜禽遺傳重點實驗室 福州 350013）

多殺性巴氏桿菌（P.multocida）是感染家兔的重要病原菌。 根據該菌致病性和感染部位的不同，被感染兔可表現出多種病癥，如呼吸道疾病、敗血癥、中耳炎、結膜炎和組織器官膿腫等[1-2]。 多殺性巴氏桿菌廣泛流行于世界各地的兔群中， 給養兔業造成了巨大的經濟損失[3-5]。 近年來，隨著福建省兔產業的集約化和規?；l展， 該菌在福建省兔群中的廣泛流行也嚴重制約著福建省兔產業的高質量發展[6-7]。 根據多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的不同，可將其劃分為A、B、D、E 和F 五種血清型。 本研究室前期從福建省重要兔養殖區福州市、 龍巖市和南平市等地9 個兔場的呼吸道病死兔肺臟中分離到205 株多殺性巴氏桿菌，其中A 型多殺性巴氏桿菌的占比高達76.10%[7]。 由此可見，A 型多殺性巴氏桿菌是引起福建省兔巴氏桿菌病的主要病原。目前，用于兔源A 型多殺性巴氏桿菌的病原學檢測方法有細菌分離鑒定和多重PCR 方法[6-8]，尚未見雙重PCR 方法的報道。 本研究以兔源A 型多殺性巴氏桿菌kmt1 和hyaD 基因為靶基因， 分別設計特異性引物進行擴增，經反應條件優化，建立特異性強且敏感性高的檢測兔源A 型多殺性巴氏桿菌的雙重PCR 方法，為該病原的快速檢測提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試劑和菌株 胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），購自廣東環凱微生物科技有限公司；2×PCR Mix（TaKaRa）、 細菌基因組DNA 提取試劑盒（TaKaRa）和膠回收試劑盒（TaKaRa），購自寶生物工程（大連）有限公司；兔源A 型多殺性巴氏桿菌及其它兔源病原菌，包括D 型和F 型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌均由本研究室保存。

1.2 引物設計 應用Primer Premier 5.0 軟件，以A型多殺性巴氏桿菌CQ2 分離菌（GeneBank 登錄號：CP033599）的kmt1 基因（1729512～1730248）和hyaD基因（169389～172307）為參考基因，通過BLAST 分析，設計并合成2 對特異性引物。 kmt1 基因引物序列為：kmt1-F:5'-cgatcctgaccaacaaacctatt-3'/kmt1-R:5'-cttcaataatggccataagaaacgtaa-3'；hyaD 基因引物序列為：hyaD-F:5'-atatgaaaaaatatgatgtcggc-3'/hyaD-R:5'-ggcaggatgtgatgactt-3'； 兩對引物的Tm 值均為57.5 ℃。 kmt1 基因引物和hyaD 基因引物的預期擴增片段分別為541 bp 和221 bp。

1.3 目的基因的擴增及鑒定 分別應用kmt1 基因引物和hyaD 基因引物進行單重PCR， 從兔源A 型多殺性巴氏桿菌基因組DNA 中擴增相應的目的片段。 反應體系：PCR Mix 25 μL， 上游和下游引物（10 μmol/L）各2 μL，基因組DNA 1 μL，滅菌雙蒸水補齊至50 μL。 反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃30 s，57.5 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環擴增；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。 PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，用膠回收試劑盒純化回收，并將回收產物測序， 測序結果與相應的參考基因進行BLAST 比對分析，確定相應引物的特異性。

1.4 雙重PCR 的建立及反應條件的優化 以兔源A 型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA 為模板， 應用kmt1 基因引物和hyaD 基因引物同時進行擴增，建立雙重PCR 方法。 反應體系：2×PCR Mix 25 μL，4 條引物（10 μmol/L）各1 μL，基因組DNA 1 μL，滅菌雙蒸水補齊至50 μL。 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃30 s，57.5 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環擴增；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。將退火溫度設置為54～60 ℃，進行溫度梯度試驗，確定雙重PCR的最佳退化溫度；將4 條引物等量混合，在混合引物濃度為0.4～1 μmol/L 進行引物濃度梯度試驗，確定反應體系中最佳的混合引物濃度。

1.5 雙重PCR 的特異性試驗 以兔源A 型多殺性巴氏桿菌以及其它兔源細菌性病原菌，包括D 型和F 型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板， 應用建立的雙重PCR 方法分別進行擴增，驗證該方法的特異性。

1.6 雙重PCR 的敏感性試驗 將反應體系中兔源A 型多殺性巴氏桿菌基因組DNA 的終濃度設置為1×108～1×100拷貝/μL，應用建立的雙重PCR 方法分別進行檢測，驗證該方法的敏感性。

1.7 雙重PCR 的重復性試驗 取兔源A 型多殺性巴氏桿菌陽性樣品24 份，同時設置陰性對照，應用建立的雙重PCR 方法進行檢測，每份樣品重復檢測3 次，驗證該方法的重復性。

1.8 雙重PCR 的初步應用 應用本試驗建立的雙重PCR 方法和已報道的多重PCR 方法[8]同時檢測103 份呼吸道病死兔樣品， 根據兩種方法的檢測結果，評估該方法的臨床實用性。

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增及鑒定 經單重PCR 擴增，kmt1 基因引物和hyaD 基因引物分別特異地從兔源A 型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA 中擴增出大小分別為541 bp 和221 bp 的目的片段（見圖1）。目的片段的測序結果顯示， 其序列均與參考基因的序列完全一致。

圖1 kmt1 和hyaD 基因的單重PCR 擴增

2.2 雙重PCR的建立及反應條件的優化 雙重PCR 擴增結果顯示，kmt1 基因引物和hyaD 基因引物能同時特異地擴增出相應的目的片段 （見圖2）。對雙重PCR 方法的退火溫度和混合引物濃度進行優化后， 確定該方法最佳退火溫度為57.8 ℃（見圖3），最佳混合引物濃度為0.8 μmol/L（見圖4）。 優化后， 該雙重PCR 方法的反應體系為：2×PCR Mix 25 μL，4 條引物（10 μmol/L）各1 μL，基因組DNA 1 μL，滅菌雙蒸水補齊至50 μL。 反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃30 s，57.8 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環擴增；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。

圖2 kmt1 和hyaD 基因的雙重PCR 擴增

圖3 反應溫度的優化

圖4 混合引物濃度的優化

2.3 雙重PCR 的特異性試驗 該雙重PCR 方法對兔源A 型多殺性巴氏桿菌為kmt1 基因和hyaD基因雙陽性，對兔源D 型和F 型多殺性巴氏桿菌為kmt1 基因單陽性，對支氣管敗血波氏桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌和陰性對照則均為陰性（見圖5），表明該方法特異性強。

圖5 特異性試驗

2.4 雙重PCR 的敏感性試驗 雙重PCR 對kmt1基因的最低檢測限為1×103拷貝/μL， 對hyaD 基因的最低檢測限為1×104拷貝/μL（見圖6），表明該方法敏感性高。

圖6 敏感性試驗

2.5 雙重PCR 的重復性試驗 應用建立的雙重PCR 方法檢測兔源A 型多殺性巴氏桿菌陽性樣品24 份和陰性對照，每份樣品和陰性對照均重復檢測3 次，3 批次的檢測結果完全一致， 表明該方法重復性好。

2.6 雙重PCR 的臨床應用 應用建立的雙重PCR方法和已報道的多重PCR 方法[8]同時檢測103 份呼吸道病死兔樣品。結果顯示，雙重PCR 檢出kmt1 基因和hyaD 基因雙陽性樣品27 份，檢出kmt1 基因單陽性樣品11 份， 陰性樣品65 份； 多重PCR 檢出kmt1 基因和hyaD 基因雙陽性樣品26 份，檢出kmt1基因陽性樣品10 份，陰性樣品63 份，非特異擴增4份。 根據兩種方法的檢測結果，雙重PCR 方法與已報到的多重PCR 方法的符合率為96.12%， 表明該雙重PCR 方法具有良好的臨床實用性。

3 討 論

兔巴氏桿菌病是制約兔產業發展的重要疫病，雖然我國已有商品化兔巴氏桿菌病疫苗用于該病的預防，但該病還是廣泛流行于我國兔群中[5,7,9]。 A 型、D 型和F 型多殺性巴氏桿菌感染兔后都能引起兔巴氏桿菌病[10]，但從我國不同地區兔群中分離到的多殺性巴氏桿菌主要還是A 型菌株[5,7,10]。 因此，建立兔源A 型多殺性巴氏桿菌的快速檢測方法，掌握該菌在兔群中的流行情況對兔巴氏桿菌病的防控意義重大。

本試驗以kmt1 和hyaD 基因為靶基因， 建立了檢測兔源A 型多殺性巴氏桿菌的雙重PCR 方法。該方法對兔源A 型多殺性巴氏桿菌的檢測結果為kmt1 和hyaD 基因雙陽性， 對兔源D 型和F 型多殺性巴氏桿菌的檢測結果為kmt1 基因單陽性，對其它兔源常見細菌性病原包括支氣管敗血波氏桿菌、大腸桿菌、 肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌的檢測結果均為陰性。由此可見，以kmt1 基因和hyaD 基因為靶基因建立的雙重PCR 方法對兔源A 型多殺性巴氏桿菌具有很強的特異性。該方法對兔源A 型多殺性巴氏桿菌kmt1 基因的最低檢測限為1×103拷貝/μL，對hyaD 基因的最低檢測限為1×104拷貝/μL， 其檢測最低限與兔源F 型多殺性巴氏桿菌雙重PCR 檢測方法最低檢測限的數量級相同[10]，敏感性高。 建立的雙重PCR 方法對103 份臨床病死兔肺臟樣品的檢測結果與Townsend 等[8]建立的多重PCR 方法的符合率為96.12%。在對103 份臨床樣品的檢測過程中， 該多重PCR 方法對4 份樣品出現了非特異擴增，導致結果無法判斷，而本試驗建立的雙重PCR方法對103 份臨床樣品均未出現非特異擴增， 且陽性樣品檢出數和陰性樣品檢出數均高于該多重PCR 方法。由此可見，與該多重PCR 方法相比，本試驗建立的雙重PCR 方法能更好地適用于臨床樣品的檢測。 本研究建立的兔源A 型多殺性巴氏桿菌雙重PCR 檢測方法特異性強、敏感性高，且臨床適用性好，為臨床上掌握兔群中A 型多殺性巴氏桿菌的流行情況以及兔巴氏桿菌病的防控提供了有力的技術手段。