動物源性食品中氟苯尼考殘留檢測方法的研究進展

呂小玲 福建圣農發展股份有限公司 福建南平 354100

氟苯尼考（Florfenicol，FF）是酰胺醇類廣譜抗菌藥， 與同類藥物氯霉素和甲砜霉素相比，FF 抗菌效果更好、安全性更高，因而在我國被廣泛用于畜禽和水產養殖業。近年來，由于獸醫知識的缺乏或受經濟利益的驅使， 不合理使用FF 的現象在我國一些養殖企業時有發生， 導致FF 殘留物在動物源性食品中常常被檢出。 毒理學研究證實，FF 及代謝物可誘導肝毒性[1-2]、生殖毒性[1]、胚胎毒性[1,3]、血液毒性[4-5]和免疫毒性[4-8]，它們在動物源性食品中的殘留給消費者健康帶來了潛在的風險， 也影響到養殖業的可持續發展。為保障食品安全，農業部在第235 號公告中明確規定FF 的殘留標志物為代謝物氟苯尼考胺（Florfenicol amine，FFA）， 其最大殘留限量（Maximum residue limit，MRL）見表1[9]。2017 年，農業部組織專家修訂了動物源性食品中獸藥的MRL， 規定FF 的殘留標志物為FF 和FFA 的總和[10]?？紤]到FF在食品動物體內可代謝生成大量結合殘留物[1,11-12]，歐盟和日本對FF 的殘留監控制定了更為嚴格的標準，規定動物源性食品中FF 及其代謝物的總和（以FFA 表示）作為FF 的殘留標志物[13-14]。

表1 中國、日本和歐盟關于動物源性食品中氟苯尼考最大殘留限量的規定

1 動物源性食品中氟苯尼考殘留檢測方法

檢測方法對于FF 的殘留監控至關重要。 截至目前， 已有大量文獻報道了動物源性食品中FF 的殘留檢測方法。其中絕大多數為理化分析方法，如高效液相色譜法[15-31]、氣相色譜-質譜聯用法[32-35]、液相色譜-質譜聯用法[11-12,36-65]和毛細管電泳法[66-68]。 此外還包括一些生物分析方法，如免疫分析法[69-77]、生物傳感器[78-79]和生物芯片技術[80]。 液相色譜-質譜聯用法特異性好、靈敏性高、定量可靠，在已報道的FF殘留檢測方法中占比最高。 但是，液相色譜-質譜聯用儀價格昂貴，運行和維護成本較高，不利于其在基層檢測機構中推廣。 氣相色譜-質譜聯用法在樣品前處理環節需要對FF 和FFA 進行衍生以使之氣化，增加了操作步驟，目前已不常用。 高效液相色譜法的各項性能指標均能滿足FF 殘留監控的需要，且分析儀器普及率高，檢測成本低廉，因而仍然被廣泛使用。 由于液相色譜系統配備的檢測器區分目標化合物和基質干擾的能力遠不如質譜檢測器， 為了確保方法具有良好的特異性， 必須在樣品前處理程序中增加必要的純化步驟， 同時需要對色譜條件進行反復優化，使得該類方法變得繁瑣，并令分析結果的重現性受到影響。 免疫分析法靈敏度高、操作簡便、分析時間短、檢測成本低，作為一種快速篩選方法有廣闊的應用前景。一些新型的檢測技術，如生物傳感器和生物芯片也逐漸趨于成熟并被應用于FF 殘留監控。 從待檢測的目標分析物來看， 多數方法能檢測可被萃取的FF 原型[19,21,23,25-30,32,34,38,40,47,51-52,55,57,61-63,66-68,71,73,76-77,79-80]或同時檢測FF 和FFA[15,17-18,20,22,24,33,35-37,39,41,43,45-46,49,53-54,56,58-60,65,70,72,74-75,78]，少數只能檢測單一的代謝物FFA[48]。 值得注意的是，FF 在食品動物體內能夠代謝生成大量的結合殘留物， 它們在動物源性食品中濃度高，殘留時間長[1,11-12]，因而逐漸受到關注。近年來， 檢測畜禽可食性組織中FF 總殘留物 （以FFA 表示）的方法越來越多[11-12,16,31,42,44,50,64,69]。從待分析的樣品基質來看，以畜禽和水產的肌肉、肝臟和腎臟為主[11-12,15-18,21-25,27,32-33,35-39,41-51,53-55,57,59-60,62-64,66-67,69-73,75-76,78,80]，牛羊乳[19,26,29-30,34,40,49,52,61,68,76,79]、 禽蛋[20,28,49,56,58,65]、 蜂蜜[41,52,76]、雞爪[60]和火腿腸[74]的文獻報道也有一定數量。羽毛和畜禽排泄物雖然不屬于可食性組織的范疇，但由于這些生物樣品易于采集，且其中可檢出的FF殘留物濃度更高，殘留時間更長，因而它們也被用于FF 殘留的日常監控， 相應的檢測方法已有文獻報道[81-84]。

2 樣品前處理技術

先進的分析儀器在FF 殘留檢測中的應用不僅明顯增強了方法的特異性和靈敏性， 也讓樣品前處理變得更加簡單。但是，這并不意味著樣品前處理在FF 殘留檢測方法中的地位變得不再重要。 相反，對于復雜樣品基質（如動物源性食品）中痕量FF 殘留物的檢測， 樣品前處理往往對分析結果的可靠性起著決定性的作用。 樣品前處理旨在從動物源性食品中提取、純化和濃縮FF 殘留物，使其能夠被分析儀器檢測。 為了實現這樣的目標， 各種樣品前處理技術被開發并應用于FF 殘留檢測。

2.1 動物源性食品中氟苯尼考殘留物的提取技術常用于從動物源性食品中提取FF 殘留物的技術包括溶劑提取技術和基于固相吸附材料的提取技術。溶劑提取技術包括液-液萃?。↙iquid-liquid extraction）、固相支持的液-液萃?。⊿olid-supported liquid extraction）、 超聲輔助提取 （Ultrasonic assisted ex-traction）、酶-微波輔助萃?。‥nzymeatic microwaveassisted liquid extraction）、QuEChERS （Quick, easy,cheap, effective, rugged and safe）方法、分散液-液微萃?。―ispersive liquid-liquid microextraction）、快速溶劑萃取（Accelerated solvent extraction）和亞臨界水萃?。⊿ubcritical water extraction）。液-液萃取是一種經典的溶劑提取技術，提取效率較高，所需的儀器設備簡單， 且同時適用于液態和固態樣品， 因而在FF 殘留檢測中應用最為廣泛[11-12,15-18,20-22,24-25,27,31-39,42,48-49,51,53-54,56-57,59-62,66,69-78,80]。 提取溶劑的選擇對于液-液萃取十分重要，FF 的親脂性較強， 可用乙酸乙酯[21,25,27,38,73,76-77]、乙腈[32,34,51,61,66]、乙酸乙酯-氨水混合物[57]、乙腈-水混合物[71]來提取，但也有方法以緩沖鹽溶液[27,80]作為提取溶劑。 FFA 含有伯胺基，略顯堿性，多用乙酸乙酯（堿性環境下提取）[11-12,16,31,42,58,74]、乙酸乙酯-氨水混合物[22-33,35,37,48-49,53-54,69,74]、乙酸乙酯-乙腈-氨水混合物[20,58,65]和乙腈-氨水混合物[59]來提??；也有一些方法采用甲醇-三氯乙酸-磷酸鹽緩沖液混合物[39,75]、丙酮-水混合物[15,17-18,24,36,60]和乙腈[56,78]從動物源性食品中提取FFA。FF 的部分代謝物被證實可以與可食性組織發生牢固結合，無法被直接提取[1,11-12]。 通過高溫條件下以強酸水解組織樣品，可將這些結合殘留物充分釋放出來。 在此過程中，FF 及代謝物（除FFA 外）側鏈上的酰胺鍵被水解，全部轉化為FFA（見圖1）。 將水解所得樣品的pH 調節至堿性，再以乙酸乙酯提取可以獲得令人滿意的提取回收率[11-12,16,31,42]。在實施液-液萃取的過程中，操作者需要經常接觸到乙酸乙酯、乙腈等有機提取溶劑，因而對他們的健康會造成一定的危害。 固相支持的液-液萃取是一種改良的液-液萃取技術， 以多孔硅藻土為液-液分配的載體，液態樣品（或樣品提取液）加入后可在硅藻土的表面形成高比表面積的液膜。 隨著有機提取溶劑（如乙酸乙酯）的加入，目標分析物能夠在水相與有機相之間進行高效分配， 從而獲得較高的提取回收率。 該技術降低了操作者暴露于有機提取溶劑的風險，安全性更好。 目前，Saito-Shida S 等[64]已將其用于牛和鰻魚可食性組織中FF 總殘留物的提取。 超聲輔助提取利用超聲波的空化效應和攪拌作用促使樣品基質中的FF 殘留物進入乙腈、冰乙酸溶液、丙酮-水混合物等提取溶劑中，提取效率高、 安全性好， 常被用于畜禽可食性組織[23,41,55,67]、禽蛋[58,65]和牛乳[19]中FF 殘留物的提取。酶-微波輔助萃取以蛋白酶K 水解組織樣品，以低頻微波促進FF 向乙腈-水混合物中擴散，可有效提取小龍蝦肌肉中的FF[63]。QuEChERS 方法是近年來美國農業部開發的一種快速樣品前處理技術， 目前已經商品化。 它能同時實現生物樣品中目標分析物的提取和凈化，而且提取回收率高、重現性好、操作簡便快速，在FF 殘留檢測中也有應用[19,45,52]。 分散液-液微萃取通過快速混合一定比例的超純水、 萃取溶劑（氯仿）和分散溶劑（脫脂牛乳），形成渾濁體系，增大FF 與氯仿的接觸表面積， 達到提取和濃縮的目的[29]。 該技術可對生物樣品中的目標分析物進行高倍濃縮，而且操作簡單、快速，價格低廉，但通常絕對提取回收率不高，而且不適用于固體樣品。快速溶劑萃取是一種在高溫高壓條件下以有機溶劑提取目標分析物的技術，提取回收率高、速度快，且易于實現自動化，被廣泛用于獸藥殘留分析。王波等[65]采用該方法提取鴿蛋中的FF 和FFA，結果表明在80 ℃和1 500 psi 壓力下，以甲醇-氨水-水混合物作為提取溶劑， 提取回收率高于92%， 相對偏差小于等于2.57%，比同等條件下液-液萃取法更有優勢。 亞臨界水萃取利用水在亞臨界狀態下對目標分析物溶解性明顯提高的特點， 能有效地將目標分析物從生物樣品中提取出來。通過比較，亞臨界水萃取對雞可食性組織中FF 和FFA 的提取效率比液-液萃取和超聲輔助提取更好[46]。而且更重要的是，亞臨界水萃取以水作為提取溶劑，更加環保。 但是，該提取技術依賴于特殊的高壓快速溶劑萃取系統，為了確保安全，操作者需要進行專業的培訓。

圖1 氟苯尼考及代謝物水解生成氟苯尼考胺的示意圖

基于固相吸附材料的提取技術也被用于從動物源性食品中提取FF 殘留物。 這些技術包括固相萃?。⊿olid-phase extraction）[44,68]、基質固相萃?。∕atrix solid-phase dispersion extraction）[19,40,43,47]、 磁性分散固相萃取（Magnetic dispersive solid phase extraction）[28,30]和織物相吸附萃取 （Fabric phase sorptive extraction）[26]。 它們所用的固相吸附材料為Strata X[19]、 溶膠-凝膠短鏈聚乙二醇 （Sol-gel short-chain ethylene glycol）[26]、磁性分子印跡聚合物[28]、磁性適配子改性吸附劑[30]、C18[40,43,47,68]和Oasis MCX[44]，這些固相吸附材料均能較好地吸附牛乳、 禽蛋或組織消解液中的FF 殘留物。 基于固相吸附材料的提取技術能同時完成生物樣品中目標分析物的提取、 凈化和濃縮，而且提取回收率高，重現性好，有機試劑消耗較少。 盡管如此，這些技術也有一些不足，如它們對樣品基質的潔凈度要求較高，通常只適用于牛乳、禽蛋和肌肉等內源性干擾物較少的生物樣品。 為了減少內源性干擾物對提取回收率的影響， 在提取之前還需要對這些樣品進行去蛋白[19,28,68]、脫脂[44]或稀釋[30,44]等處理。 此外，磁性分散固相萃取和織物相吸附萃取只能適用于牛乳等液態樣品。 最后，提取FF殘留物的固相吸附材料價格較為昂貴（如C18、Oasis MCX、Strata-X），有的制備工藝較為復雜（如溶膠-凝膠短鏈聚乙二醇、 磁性分子印跡聚合物和磁性適配子改性吸附劑）。

2.2 動物源性食品中氟苯尼考殘留物的純化技術動物源性食品中含有大量的內源性干擾物。 其中的部分干擾物可隨FF 和FFA 被共萃取而進入待檢測樣品中，這些干擾物的存在不僅降低方法的特異性，也損害分析儀器，縮短色譜柱的使用壽命。對于生物分析方法， 內源性干擾物的存在影響FF 或FFA 與檢測分子（如抗體）的特異性結合，使方法的準確性和精確性降低。 如何有效地消除內源性干擾物帶來的基質效應已經成為FF 殘留檢測面臨的重要挑戰之一。

事實上， 動物源性食品中部分內源性干擾物在樣品提取步驟已經被去除掉。 但是，那些隨FF 殘留物被共萃取的內源性雜質仍然能夠顯著地干擾檢測，它們的種類和含量取決于提取方法和提取溶劑。如對于畜禽可食性組織中FF 總殘留物的檢測，在提取之前需要對組織勻漿進行水解以釋放其中的結合殘留物，但在這一過程中，大量的內源性干擾物會被釋放出來，令后續樣品的純化變得更加困難。而以乙酸乙酯-氨水混合物直接提取組織樣品中的FF和FFA， 樣品提取液中的內源性干擾物就明顯少很多。 又如，用乙酸乙酯提取畜禽可食性組織、禽蛋和牛乳中的FF 殘留物， 樣品提取液中往往含有大量的脂肪；將乙酸乙酯換成乙腈，樣品提取液中脂肪的含量則明顯減少。 還有，以乙酸乙酯-氨水混合物提取豬肝臟中的FF 和FFA，樣品提取液呈現淺黃色，雜質較少；而將提取溶劑換為乙酸乙酯，樣品提取液中則含有大量酒紅色未知干擾物。由此看來，在保證FF 殘留物被充分提取的前提下，可以通過優化提取方法和選擇合適的提取溶劑來減少樣品提取液中的內源性干擾物。

那些進入樣品提取液中的內源性干擾物還可以使用相應的樣品純化技術去除掉。 對于共萃取的脂肪， 通常用正己烷[12,15,17-18,20-22,24-25,27,31,33,35-38,42,44-45,47-50,53-56,58-60,64-65,71,73-74,77]去除，也可用乙酸乙酯[16,31,50]和庚烷[57]脫脂，還能通過冷凍[33]和高速離心[76]的方式去掉。 正己烷脫脂效率高，不會導致FF 殘留物的損失[45]，因而被廣泛使用。 乙腈飽和的正己烷似乎更加適合去除禽蛋提取物中的脂肪[58,65]。乙酸乙酯在脫脂的同時也能提取少量的FFA。 但是FFA 結構中含有胺基，更易于溶解于酸性水溶液中，所以，用乙酸乙酯洗滌強酸水解后的組織消解液并不會影響FFA 的回收率[16,31,50]。 畜禽可食性組織、牛羊乳和禽蛋中含有大量的蛋白質，會干擾FF 殘留物的檢測，并堵塞色譜柱。這些蛋白質可用膜分離技術[15]去除掉，也可加入乙腈使之形成沉淀，然后通過離心去除[28-29,34,61]。 此外，甲基叔丁基醚[45]和鹽酸溶液[68]也是較好的蛋白沉淀劑。 QuEChERS 方法將液-液萃取、 鹽析和分散固相萃取結合起來， 也可有效地去除這些蛋白質[19,45,52]。 脫脂和去蛋白的操作并不能有效地去除那些在性質或結構上與FF 殘留物相似的內源性雜質，為確保方法的特異性，還需要使用其它一些樣品純化技術。 固相萃取技術依賴特殊的固相吸附材料分離FF 殘留物和內源性雜質，操作簡單，能夠同時對樣品進行提取、純化和濃縮，還可實現自動化，因而被廣泛用于動物源性食品中FF 殘留物的檢測[11-12,16-17,19,21,23-24,28,30,32-35,37,40-47,50,54-55,59,61,64,66-68]。 固相吸附材料的選擇對于樣品的純化效果至關重要， 文獻報道的固相吸附材料包括C18[11-12,21,32,40,43,47,59,66-68]、Oasis MCX[17,24,35,37,41,44-45,64]、Oasis HLB[23,33-34,41,46,61]、 硅藻土[16,50,55]、Strata-X[19]、磁性分子印跡聚合物[28]、磁性適配子改性吸附劑[30]、PSA[42]和苯基[54]。 其中，Oasis MCX 填料利用反相吸附和離子鍵吸附的雙重保留機制， 可較好地將FFA 與內源性雜質區分開來；磁性分子印跡聚合物是以FF 為模板分子制備的固相吸附材料，選擇性也很好；磁性適配子改性吸附劑通過DNA 適配子特異性吸附FF 的原理， 可有效去除內源性雜質。除此以外的其它固相吸附材料選擇性普遍不高，難以取得令人滿意的純化效果。 免疫親和色譜是基于抗原抗體特異性的結合反應而發展起來的一種樣品純化技術， 目前， 已經被應用于豬肌肉中FF 和FFA 的分離純化[39]；免疫親和色譜具有純化效率高、有機試劑用量少的優點，但也存在抗體穩定性不高、制備過程復雜和價格昂貴等不足。 薄層色譜是一種經典的色譜分離技術， 它利用樣品中各組分對吸附材料親和力的差異， 在連續的吸附和解吸附過程中將它們彼此分離開來； 薄層色譜板比固相萃取小柱具有更高的理論塔板數， 這使它能夠更加高效地純化復雜的生物樣品。 Zhou D 等[31]將豬可食性組織的消解液分別用固相萃取技術（Oasis MCX 吸附劑）和薄層色譜（普通的硅膠吸附劑）純化，結果表明薄層色譜的純化效果明顯優于固相萃取技術。此外，與固相萃取技術和免疫親和色譜相比， 薄層色譜還具有明顯的價格優勢。 當然， 薄層色譜也存在一些不足， 如薄層色譜板載樣量小， 為了確保方法的靈敏性，點樣前需要對樣品提取液進行高倍濃縮；若提取液中含水，會令濃縮過程變得非常困難[31]。 又如，薄層色譜對樣品的潔凈度有一定的要求， 共萃取的脂肪和蛋白質會干擾點樣和展開過程， 需要預先去除[31]。還有，薄層色譜的操作比固相萃取和免疫親和色譜更加復雜、費時。 最后，操作者在點樣環節也容易暴露于有機試劑中， 對其健康造成危害。 盡管如此， 薄層色譜作為一種樣品純化技術仍然有著巨大的應用前景，將它與高效液相色譜法結合起來，以薄層色譜優秀的樣品純化效果彌補液相色譜儀在特異性上的不足， 有助于拓寬高效液相色譜法在獸藥殘留分析中的應用[31,83]。

2.3 待測樣品中氟苯尼考殘留物的濃縮 濃縮也

是樣品前處理程序中重要的環節。 通過濃縮， 可以讓待測樣品中目標分析物的濃度成倍增加， 對于提高方法的靈敏性很有幫助。 濃縮往往是在樣品提取之后、檢測之前。 如上所述，大多數的FF 殘留檢測方法都以溶劑萃取法從動物源性食品中提取FF 和FFA。 對于所得到的樣品提取液，若是沸點較低的有機溶劑，通常采用旋轉蒸發法[17,25,32,35,37,48,64]和氮氣吹掃法[11-12,15,18,20-24,27,31,33,36,38,42,45,49,52-60,62-63,69,71,73-74,77-78]進行濃縮，也可以采用離心濃縮法[65]；若為含水的緩沖液或混合溶液，則常采用固相萃取[16,34,41,44,46,50,61,68]和免疫親和色譜[39]等技術進行濃縮。 旋轉蒸發法在減壓條件下對樣品提取液進行連續蒸餾，從而達到濃縮的目的；它能迅速去除樣品提取液中易揮發的有機溶劑，特別適合較大體積（如50～100 mL） 樣品提取液的濃縮。旋轉蒸發法也存在一些不足，如濃縮在減壓條件下進行， 若溫度過高則容易發生爆沸， 使樣品被污染，因而需要有專人看管；其次，旋轉蒸發儀一次只能處理一個樣品， 濃縮效率不如氮氣吹掃法。 氮氣吹掃法是在常壓條件下以氮氣（或空氣）吹掃經過加熱的樣品提取液來達到濃縮的目的， 比較適合較小體積（如0.5～50 mL）樣品提取液的濃縮，也常常配合固相萃取技術[17,21,23-24,31-35,37,41,44-45,50,54,61,68]、免疫親和色譜[39]和QuEChERS 方法[19,45,52]同時使用。 絕大多數氮吹儀能同時處理幾十個樣品， 效率比旋轉蒸發法更高。 固相萃取小柱和免疫親和小柱能夠將樣品提取液中的FF 殘留物保留于特殊的吸附材料上， 然后再用少量的洗脫溶劑將它們洗脫下來， 從而同時完成提取、純化和濃縮三個步驟。由于濃縮過程中無需對樣品提取液進行蒸餾或揮干， 因而固相萃取和免疫親和色譜非常適合含水較多的樣品提取液的濃縮。 隨著樣品前處理技術向更加簡單快捷的方向發展，一些集樣品提取、純化和濃縮于一體的新技術也不斷被應用于動物源性食品中FF 的殘留檢測。 其中最具有代表性的是分散液液-微萃取[29]、磁性分散固相萃取[28,30]和基質固相萃取[19,40,43,47]，它們的優缺點已在上述進行了比較。

3 樣品的檢測

多種方法被用于檢測樣品中的FF 殘留物。 高效液相色譜法是其中較為常見的一種， 液相色譜-質譜聯用法在FF 殘留檢測中應用最為廣泛。 氣相色譜-質譜聯用法、 毛細管電泳法和生物分析方法雖有報道，但并不多見、不作詳細介紹。

高效液相色譜法多使用紫外檢測器進行定量，檢測波長通常為220～240 nm[15-19,21-31]；也有個別方法采用熒光檢測器進行定量， 激發波長為224 nm，發射波長為290 nm[20]。 樣品中的FF 殘留物可采用反相C8[16,23]和C18 色譜柱[15,17-22,24-31]分離。若目標分析物為FF，流動相可為乙腈-水混合物[21,25,27-29]、乙腈-乙酸銨溶液混合物[23,26]和甲醇-水混合物[30]；若目標分析物中含有FFA，則需要使用梯度洗脫程序[15-16]將FFA 與內源性雜質分離開， 也可以在流動相中加入庚烷磺酸鈉[15,17]或十二烷基磺酸鈉[18,20,24,31]來獲得良好的色譜分離效果。 梯度洗脫雖然有助于提高色譜分離效果，但會導致基線漂移，并延長樣品分析時間。庚烷磺酸鈉和十二烷基磺酸鈉是常用的離子對試劑，它們可與FFA 形成離子對，增強FFA 在反相色譜柱上的保留。 流動相中離子對試劑的濃度對FFA的保留時間影響很大， 提示可通過調整離子對試劑的量來獲得良好的色譜分離效果。但是，這些離子對試劑在水中的溶解性不好， 在配制流動相時往往需要超聲助溶。 離子對試劑加得過多不僅會使流動相難以配制， 而且已溶解的離子對試劑在較低的室溫下還可能析出，影響方法的重現性。 此外，十二烷基磺酸鈉等離子對試劑很難從色譜柱上沖洗干凈，這會讓下一次分析前平衡色譜柱所需要的時間大大延長。一些研究表明，FFA 結構中的胺基可能與色譜柱填料中殘留的硅醇基結合，導致色譜峰拖尾[15-17,20]。為了獲得良好的峰型， 需要在流動相中加入三乙胺作為掃尾劑[15-18,20,22,31]。 Zhou D 等[31]、Qian M 等[83]較系統地考察了流動相組成與比例對FFA 檢測的影響，確定了最佳的流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（含2.5 mM 十二烷基磺酸鈉和體積百分比0.1%三乙胺）的混合物（33.3:66.7）。

液相色譜-質譜聯用法檢測待測樣品中的FF殘留物，可用于色譜分離的分析柱有反相C18 柱[11-12,36-37,39-40,43-47,49-51,53-65]、苯基柱[38,42]、苯基-己基小粒徑快速分析柱[41]、親水作用（HILIC）色譜柱[48]和甲基丙烯酸月桂酯-甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合物整體柱[52]。 流動相通常為乙腈-水混合物[12,37,39,53-55,58-59]或含有氨水[11]、甲酸[63-64]、冰乙酸[36]、甲酸銨[42,49]、乙酸銨[36,48,65]的乙腈-水混合物，甲醇-水混合物[46-47,50]或含有甲酸[38,43,57,61]、冰乙酸[41,60]、甲酸銨[61]、乙酸銨[40-41,43]的甲醇-水混合物。 也有的方法采用更為復雜的甲醇-乙腈-水混合物作為流動相[44-45,56,62]。 梯度洗脫被幾乎所有的液相色譜-質譜聯用法采用[11,36-65]。 對于FF 殘留物的檢測， 絕大部分方法采用電噴霧電離源[11,36-40,42-49,51-58,60-65]，也有一些方法采用加熱電噴霧電離源[12,41,50,59]或大氣壓化學電離源[50]。 FF 的掃描方式通常為負電子模式， 毛細管電壓為1～4.5 kV[36-40,43,45-47,49,51-58,60-63,65]；FFA 的掃描方式通常為正電子模式，毛細管電壓為1～5.5 kV[11-12,36-37,39,41-46,48-50,53-54,56,58-60,64-65]。 質譜的工作模式通常為多反應監測模式[11,37,39,42-52,54,56-58,60-63,65]，也有方法采用選擇反應監測模式[12,38,40-41,53,55,59,64]或全掃描模式[36]。

4 動物源性食品中氟苯尼考殘留檢測方法面臨的問題

4.1 目標分析物的認定 FF 在食品動物體內可被廣泛代謝，部分代謝物可與生物大分子（如蛋白質）形成牢固的結合殘留物而長期蓄積在動物源性食品中。 在治療劑量下，FF 結合殘留物占總殘留物的比例，牛肝臟和腎臟中分別為71.1%～91.1%和22.2%～76.1%，殘留持續時間長達30 d[1]；豬腎臟和肌肉中分別為76.8%～96.0%和65.7%～88.5%， 殘留持續時間為14 d[11]；雞腎臟、肝臟和肌肉中分別為81.9%～87.7%、80.7%～98.0%和47.0%～58.8%， 殘留持續時間長達20 d[12]。 這些結合殘留物無法被溶劑直接萃取，需經過強酸水解才能從組織中釋放出來，同時自身轉化為FFA[11-12,16,31,42,44,50,64,69]?？紤]到FF 結合殘留物可能帶來的食品安全風險， 歐盟和日本均規定FF的殘留標志物為以FFA 計算的FF 總殘留物，包括FF 原型及各種代謝物[13-14]。 但是在我國，農業部2017 年修訂的動物性食品中獸藥MRL 標準規定FF 和代謝物FFA 的總和被指定為FF 殘留監控的殘留標志物[10]。監控對象上的不同給FF 殘留檢測方法的開發者和使用者帶來了困惑，目前已報道的FF殘留檢測方法中，絕大多數只能檢測可被萃取的FF和FFA。 筆者認為， 采用這些方法監控動物源性食品中FF 的殘留可能得到 “假陰性” 的檢測結果，導致誤判。 以Imran M 等[12]的研究為例，肉雞按照30 mg/kg 劑量連續口服5 d，休藥7 d 后從腎臟中檢測到可被萃取的FF 殘留物濃度為125.04 μg/kg，低于MRL（750 μg/kg），應該判定為合格；而事實上，在該批樣品中還有806.50 μg/kg 的FF 結合殘留物未被發現。 類似這樣的動物源性食品一旦流入市場將會威脅食品安全，若銷往歐盟，則可能使我國的養殖企業面臨巨額賠償。 近年來，動物源性食品中FF 的總殘留物逐漸受到關注， 可檢測FF 總殘留物的方法也陸續有報道， 這些方法通過高溫條件下強酸水解組織樣品來釋放其中的FF 結合殘留物， 避免了“假陰性”的檢測結果。

4.2 氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率 準確性是FF 殘留檢測方法的重要評價指標，通常用回收率表示。 不恰當的樣品前處理可能導致方法的回收率偏低。 如檢測組織樣品中的FF 總殘留物，須先將組織勻漿充分水解之后才能進行提取。酸的強度、孵育溫度、水解時間以及FFA 在高溫、強酸環境中的穩定性對方法的回收率都有影響， 需要進行系統研究。Faulkner D 等[11]發現，70 ℃下不足以將組織樣品完全消解，FF 結合殘留物無法充分釋放；100 ℃下在6 N 鹽酸溶液中孵育8 h，FFA 的含量沒有明顯減少。Imran M 等[12]研究表明，在95～100 ℃下以6 N 鹽酸水解雞可食性組織2 h， 無法完全釋放其中的FF結合殘留物， 而同樣條件下水解4 h 回收率則明顯升高。 類似的結果也出現在Kong A 等[42]的研究中。在樣品提取步驟，FF 和FFA 可能因為提取溶劑的組成和提取環境的pH 值等因素損失。FFA 呈堿性，若以乙酸乙酯等有機溶劑進行提取， 需要同時加入少量氨水[20,22,33,35,37,48-49,53-54,58-59,65,69,74]，或者將樣品溶液的pH 調節為堿性[11-12,16,31,42,58,74]。 Imran M 等[12]研究了pH對于乙酸乙酯提取FFA 的影響，結果表明組織消解液的pH 小于10.5 時，至少有10%～15%FFA 在乙酸乙酯提取時損失掉，FF 側鏈上的酰胺鍵似乎容易在堿性條件下發生水解。 Qian M 等[83]發現，將尿液的pH 調節至大于12，再用乙酸乙酯提取其中的FF 和FFA，FF 的回收率小于33.7%， 而FFA 的回收率則大于126.3%， 提示若同時檢測可被萃取的FF 和FFA，調節pH 時需要特別注意。 濃縮通常不會導致分析物的損失，但對FFA 是一個例外。 研究表明，以旋轉蒸發或氮氣吹掃法濃縮樣品提取液（如乙酸乙酯）都可導致FFA 大量損失[17,31,37,83]。盡管原因尚不明確， 但在旋轉蒸發前于樣品提取液中加入異丙醇3 mL 和5%冰乙酸溶液1.5 mL[17]，或在氮氣吹掃前于樣品提取液中加入少量5%冰乙酸溶液[31,37,83]，能有效避免FFA 在濃縮過程中的損失。 樣品純化過程中同樣伴隨著FF 和FFA 的損失， 如用乙腈等蛋白沉淀劑去除牛乳中的蛋白質時，FF 可能會發生共沉淀，從而導致方法的回收率下降[19]。 Wei S 等[28]用乙腈對蛋白沉淀物進行了再次提取， 提高了FF 的回收率。 在用薄層色譜凈化組織提取液時，FFA 的胺基能與硅膠的硅醇基結合導致其在薄層色譜板上拖尾，使得方法回收率下降。調節展開液的組成以增強洗脫能力， 或在刮取硅膠時向下延伸一定距離都可以減少FFA 的損失[31,83]。 總之，樣品前處理的每個環節都可能導致FF 和FFA 的損失，且步驟越多，損失的可能性就越大，回收率也就越低。為保證方法的準確性， 系統地研究樣品前處理過程中影響回收 率的因素， 并在此基礎上優化樣品前處理程序很有必要。

5 小 結

氟苯尼考（FF）在我國養殖業中應用廣泛，建立可靠的殘留檢測方法對規范FF 的使用、 保障食品安全至關重要。 動物源性食品中大量存在的FF 結合殘留物值得關注， 為減少誤判，FF 殘留檢測方法應該能夠檢測動物源性食品中FF 的總殘留物。 樣品前處理是FF 殘留檢測方法的重要組成部分，優化樣品前處理程序， 能夠提高方法的特異性、 靈敏性、準確性和精確性。 薄層色譜純化效果好、價格低廉、綠色環保，可用來解決獸藥殘留分析中基質干擾這一技術難題。