黑色素瘤相關(guān)抗原3、zeste 2 多梳抑制復(fù)合物2 亞基增強(qiáng)子在宮頸癌組織中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系

牛云霞，王越月，王雷

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，陜西 咸陽(yáng) 712000

2延安大學(xué)咸陽(yáng)醫(yī)院病理科，陜西 咸陽(yáng) 712000

宮頸癌是全球第三大女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率。目前，晚期宮頸癌患者的中位生存期僅16 個(gè)月，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[1]。因此，晚期宮頸癌患者的治療重點(diǎn)是改善患者的預(yù)后，抑制腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步侵襲、轉(zhuǎn)移。免疫治療是近年來(lái)新興的研究熱點(diǎn)之一，創(chuàng)傷小，易被醫(yī)師和患者接受。免疫靶點(diǎn)需要具有較高的特異性，即在正常組織中呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)，在腫瘤組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，從而避免治療后產(chǎn)生自身免疫性疾病[2]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展完善，人們逐漸意識(shí)到宮頸癌是由多基因參與的癌變，因此，了解宮頸癌特異性抗原對(duì)腫瘤的監(jiān)測(cè)、判斷至關(guān)重要，可為掌握腫瘤精準(zhǔn)治療奠定基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)黑色素瘤相關(guān)抗原3（melanoma-associated antigen 3，MAGEA3）的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，表明MAGEA3 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[3-4]。目前臨床已開(kāi)展關(guān)于MAGEA3 免疫治療的臨床試驗(yàn)，但僅局限在肺癌、膀胱癌等患者，對(duì)宮頸癌的研究較少。此外，zeste 2 多梳抑制復(fù)合物2 亞基增強(qiáng)子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）也被證實(shí)可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，但對(duì)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用及與患者預(yù)后的關(guān)系仍未能完全明確。因此，本研究探討MAGEA3、EZH2 在宮頸癌組織中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年5 月至2016 年5 月陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的宮頸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《宮頸癌磁共振檢查及診斷規(guī)范專家共識(shí)》[5]中宮頸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②精神狀態(tài)良好；③既往未接受手術(shù)或化療；④病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性宮頸癌；②隨訪資料不完整；③語(yǔ)言認(rèn)知功能障礙，無(wú)正常溝通能力。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入45 例宮頸癌患者，年齡30～67 歲，平均（47.92±5.16）歲。選取同期陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的18 例宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者和17 例健康體檢者。CIN 患者年齡31～66 歲，平均（46.89±5.31）歲。健康體檢者年齡29～65歲，平均（47.43±4.92）歲。宮頸癌患者、CIN患者、健康體檢者年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化法檢測(cè)MAGEA3、EZH2 的表達(dá)情況

取宮頸癌患者的宮頸癌組織、CIN 患者的CIN組織和健康體檢者的正常宮頸組織，切片、脫蠟、水化后，以0.01 mmol/L 枸櫞酸鹽溶液進(jìn)行抗原修復(fù)13 min，冷卻至室溫后，滴加少量過(guò)氧化氫，以滅活過(guò)氧化物酶活性，山羊血清封閉，于室溫下孵育20 min，并用濾紙將表面殘余水分擦除。滴加一抗EZH2 多克隆抗體、MAGEA3 多克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，梯度乙醇脫水，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。

結(jié)果判定：MAGEA3、EZH2 主要定位于細(xì)胞核，依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分。無(wú)著色計(jì)0分，淡黃色染色計(jì)1分，棕色染色計(jì)2分，棕褐色染色計(jì)3 分；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例﹤25%計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例25%～50%計(jì)1 分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例51%～75%計(jì)2 分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例﹥75%計(jì)3分。將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分相乘，﹤3分判定為陰性，≥3分判定為陽(yáng)性。

1.3 隨訪方法

采用電話或微信等方式對(duì)宮頸癌患者進(jìn)行為期3 年的隨訪，隨訪時(shí)間截至2019 年5 月，記錄患者的生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；MAGEA3、EZH2 表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析；宮頸癌患者預(yù)后的影響因素采用多因素Logistic 回歸分析；以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAGEA3、EZH2 表達(dá)情況的比較

宮頸癌組織、CIN 組織和正常宮頸組織中MAGEA3、EZH2 的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01），宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常宮頸組織和CIN 組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 宮頸癌組織、CIN 組織和正常宮頸組織中MAGEA3、EZH2 表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征宮頸癌患者M(jìn)AGEA3、EZH2 表達(dá)情況的比較

不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑、病理類型宮頸癌患者宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學(xué)分級(jí)為G3級(jí)宮頸癌患者宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)深度≤1/2、臨床分期為Ⅰ期、組織學(xué)分級(jí)為G1～2級(jí)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征宮頸癌患者M(jìn)AGEA3、EZH2 表達(dá)情況的比較

2.3 宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 表達(dá)的相關(guān)性

宮頸癌組織中MAGEA3 的表達(dá)與EZH2 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.337，P﹤0.05）。

2.4 預(yù)后情況的比較

MAGEA3 陽(yáng)性表達(dá)宮頸癌患者的3 年生存率為37.14%（13/35），低于陰性表達(dá)患者的80.00%（8/10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.147，P=0.042）；EZH2 陽(yáng)性表達(dá)宮頸癌患者的3 年生存率為37.84%（14/37），低于陰性表達(dá)患者的75.00%（6/8），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.679，P=0.031）。

2.5 宮頸癌患者預(yù)后影響因素的多因素分析

將2.2 中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、肌層浸潤(rùn)深度、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期作為自變量，宮頸癌患者的預(yù)后作為因變量，納入多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學(xué)分級(jí)為G3級(jí)均是宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P﹤0.05）。（表3）

表3 宮頸癌患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

宮頸癌主要由人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染引起，HPV 是一種可引起組織異常增生的小DNA 病毒，可在多種基因的作用下導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生，且該過(guò)程漫長(zhǎng)、復(fù)雜[6-7]。近年來(lái)，HPV 疫苗、宮頸癌的診斷已取得較大突破，臨床宮頸癌的治療主要采用手術(shù)、化療、放療或系統(tǒng)綜合治療。早期宮頸癌患者的治療效果較好，但對(duì)于持續(xù)性、晚期或復(fù)發(fā)性宮頸癌的治療效果較差。靶向治療作為一種新興的治療方式，可同時(shí)抑制多個(gè)癌基因的表達(dá)，具有高效、低毒的優(yōu)勢(shì)，為免疫治療的發(fā)展開(kāi)創(chuàng)了一條新道路[8-9]。此外，研發(fā)新的診斷手段、治療策略，對(duì)改善宮頸癌患者的預(yù)后有重要意義。

張晶晶等[10]對(duì)97 例宮頸癌患者的宮頸癌組織進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MAGEA3 表達(dá)上調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。陳茜等[11]通過(guò)敲除人宮頸鱗狀細(xì)胞癌SiHa 細(xì)胞系中EZH2的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著減弱。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常宮頸組織和CIN 組織（P﹤0.05），這可能與以下4個(gè)方面有關(guān)：①EZH2 可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌，從而改變微血管性質(zhì)和密度，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。②EZH2 可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)因子Ki-67 的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。③MAGEA3 可與p53結(jié)合，降低血細(xì)胞中p53 水平，從而使宮頸癌細(xì)胞更加活躍。④MAGEA3作為凋亡抑制基因，可降低腫瘤細(xì)胞凋亡率[12-13]。EZH2 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮監(jiān)控發(fā)育調(diào)節(jié)因子的作用，糾正其不當(dāng)表達(dá)，可確保神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育正常。研究認(rèn)為，EZH2是癌基因，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14-15]，MAGEA3在多種腫瘤中發(fā)揮癌基因作用，MAGEA3 的表達(dá)情況可能影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡等生物學(xué)行為[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學(xué)分級(jí)為G3級(jí)宮頸癌患者宮頸癌組織中MAGEA3、EZH2 的陽(yáng)性表達(dá)率分別高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)深度≤1/2、臨床分期為Ⅰ期、組織學(xué)分級(jí)為G1～2級(jí)的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。表明MAGEA3、EZH2均與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究顯示，腫瘤組織必須具備血管生成的條件，才可成功進(jìn)行侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。在肺癌、膀胱癌等腫瘤組織中，EZH2陽(yáng)性表達(dá)率越高，腫瘤組織的新生血管網(wǎng)越豐富，說(shuō)明EZH2過(guò)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)和血管密度有關(guān)，是一種腫瘤微血管生成刺激因子[19]。

本研究結(jié)果中，宮頸癌組織中MAGEA3 的表達(dá)與EZH2 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.337，P﹤0.05）。表明MAGEA3、EZH2 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了協(xié)同作用，通過(guò)共同建立新生血管網(wǎng)，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，同樣的結(jié)論也適用于卵巢癌、胃癌等。李青等[20]研究顯示，沉默MAGEA3基因的表達(dá)可抑制宮頸細(xì)胞的惡變潛能，其作用可能涉及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號(hào)通路的激活。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的促微血管生成因子，研究表明，MAGEA3 參與了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2）信號(hào)通路的構(gòu)成[21]。MAGEA3 可促進(jìn)腫瘤組織中FGRF2 的表達(dá)，使腫瘤微血管生成活躍，并通過(guò)調(diào)節(jié)纖維連接蛋白，參與腫瘤細(xì)胞的侵襲過(guò)程。雖然MAGEA3 及FGRF2 均通過(guò)影響腫瘤微新生血管生成來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制仍未明確，仍需進(jìn)一步探討。

未來(lái)的研究可進(jìn)一步關(guān)注MAGEA3、EZH2 表達(dá)對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值，為宮頸癌的臨床監(jiān)測(cè)提供幫助。細(xì)胞表面包圍的MAGEA3 抗原，主要經(jīng)組織相溶性復(fù)合體辨別結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)合物后被宮頸癌細(xì)胞識(shí)別，進(jìn)而提高腫瘤細(xì)胞的增殖能力；EZH2則通過(guò)參與DNA 甲基化抑制抑癌基因轉(zhuǎn)錄，二者在免疫療法治療宮頸癌中應(yīng)用前景廣闊。本研究結(jié)果顯示，MAGEA3、EZH2 陽(yáng)性表達(dá)宮頸癌患者的3 年生存率均低于陰性表達(dá)患者，提示MAGEA3、EZH2 檢測(cè)可為復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)提供有價(jià)值的信息。

綜上所述，MAGEA3、EZH2在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，且陽(yáng)性表達(dá)患者預(yù)后較差，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)深度﹥1/2、臨床分期為ⅡA 期、組織學(xué)分級(jí)為G3級(jí)均是宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。