肌動蛋白相關蛋白2/3 復合體亞基4、環氧合酶2 在結直腸癌組織中的表達及與患者臨床特征和預后的關系

王雷，王越月，牛云霞#

1延安大學咸陽醫院病理科，陜西 咸陽 712000

2陜西中醫藥大學第二附屬醫院病理科，陜西 咸陽 712000

近年來隨著人們生活方式和飲食習慣的改變，中國結直腸癌的發病率逐漸升高，居全部惡性腫瘤第3 位[1]。結直腸癌可采取手術治療，但仍有不可控的轉移導致患者死亡，因此盡早診斷結直腸癌可大大提高患者生存率，延長患者生存期。肌動蛋白相關蛋白2/3（actin related protein 2/3，Arp2/3）是一種肌動蛋白裝配成核器，可參與微絲的產生，具有構建細胞骨架、參與細胞運動等功能[2]，其組成成分包括7 種亞基，通過互相作用連接為穩定的Arp2/3[3-4]。有報道指出，下調肌動蛋白相關蛋白2/3 復合體亞基5（actin related protein 2/3 complex subunit 5，ARPC5）的表達可有效抑制肺癌細胞擴散和惡性增殖，但目前關于Arp2/3 主要構成成分肌動蛋白相關蛋白2/3 復合體亞基4（actin related protein 2/3 complex subunit 4，ARPC4）的研究少有報道，ARPC4 與結直腸癌發生發展和預后的關系仍未明確[5-6]。此外，環氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）在結直腸癌組織中大多為陽性表達，而在正常組織中為陰性或弱陽性表達，提示COX2 對結直腸癌的預測價值較高。本研究探討ARPC4 和COX2 在結直腸癌組織中的表達及與患者臨床特征和預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015 年8 月至2017 年8 月延安大學咸陽醫院收治的結直腸癌患者的病歷資料。納入標準：①經病理檢查確診為結直腸癌，且為首次確診；②未服用過非甾體抗炎藥；③臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②術前曾接受過放化療；③合并多臟器衰竭；④妊娠期女性。依據納入和排除標準，本研究納入96 例患者，其中男45例，女51 例；平均年齡（57.18±7.13）歲；直腸癌47例，結腸癌49 例。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組織化學染色法檢測ARPC4、COX2 表達情況

采用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）連結法進行免疫組織化學染色。①烤片。收集結直腸癌組織標本，每例標本切取3 張切片，厚度為3 μm，檢查電烤箱是否完好，設置溫度為60 ℃，預熱完成后，將切片置于烤架上，烘烤30 min。②脫蠟、水化。將烘烤后的切片置于二甲苯溶液中浸泡5 min，拿出后放置5 min，進行脫蠟。然后分別在100%、95%、75%乙醇中浸泡5 min，完成水化。水化后將切片置于流水下清洗，將乙醇洗去，但注意不能用力沖洗。③高壓抗原修復。將250 ml 檸檬酸鈉溶解于2 L 蒸餾水中，溶解充分后置于高壓蒸汽鍋中，完全浸泡于水中，煮沸。蒸汽鍋出汽后等待2 min，關閉電源，等待切片自然冷卻后取出。分2 次浸泡于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，每次5 min。④干燥切片。用免疫組化筆在病灶組織旁畫圈，為將預加試劑固定于切片做準備。然后滴加3%過氧化氫，維持10 min，再用PBS 清洗3 次，甩干。⑤一抗孵育。滴加ARPC4、COX2一抗工作液，于4 ℃冰箱孵育過夜。分3次浸泡于PBS中，每次3 min。⑥二抗孵育。滴加兔抗人ARPC4、COX2 多克隆抗體，于室溫下放置30 min，分3 次浸泡于PBS 中，每次3 min。⑦二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色。現用現配DAB 試劑并滴加，等待1 min 后用PBS 清洗3 次。⑧蘇木素染色。染色30 s 后自來水沖洗1～2 次，甩干。⑨脫水、封片。將切片依次置于75%、95%、100%乙醇中，每次3 min，然后在組織中央滴一滴中性樹脂，封片。

1.3 免疫組織化學染色結果判定

由3 名經驗豐富的病理科醫師對染色結果進行判定，意見不統一時協商討論。ARPC4 主要定位于細胞質，COX2 主要定位于核膜與內質網。采用染色強度和陽性細胞百分比結合的半定量方法進行評分，綜合評分=陽性細胞百分比評分×染色強度評分。陽性細胞百分比評分：0%～5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～100%為3分；染色強度評分：未著色為1 分，淡黃色為2 分，深黃色為3 分。綜合評分0～1 分為陰性，2～9 分為陽性。

1.4 觀察指標

收集患者的臨床資料，包括年齡、性別、淋巴結轉移情況、腫瘤直徑、分化程度、T 分期、TNM 分期，比較不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中ARPC4、COX2 陽性表達率，分析結直腸癌組織中ARPC4 與COX2 表達的相關性。所有患者均隨訪3 年，比較不同ARPC4、COX2 表達情況結直腸癌患者的3 年生存率。

1.5 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對數據進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用回歸分析法進行相關性分析。以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌患者中ARPC4 和COX2 表達情況

結直腸癌患者中ARPC4 陽性表達率為61.46%（59/96），COX2 陽性表達率為59.38%（57/96）。

2.2 不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中ARPC4、COX2 陽性表達情況的比較

不同年齡、性別、腫瘤直徑、T 分期結直腸癌患者結直腸癌組織中ARPC4、COX2 陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）；有淋巴結轉移、低分化、Ⅲ～Ⅳ期結直腸癌患者結直腸癌組織中ARPC4、COX2 陽性表達率均高于無淋巴結轉移、中高分化、Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中ARPC4、COX2 表達情況的比較

2.3 結直腸癌組織中ARPC4與COX2表達的相關性

結直腸癌組織中ARPC4 與COX2 的表達呈正相關（r=0.618，P﹤0.05）。

2.4 生存情況的比較

ARPC4陽性表達結直腸癌患者的3年生存率為30.51%（18/59），低于ARPC4陰性表達患者的54.05%（20/37），差異有統計學意義（χ2=5.272，P=0.022）。COX2 陽性表達結直腸癌患者的3 年生存率為29.82%（17/57），低于COX2陰性表達患者的51.28%（20/39），差異有統計學意義（χ2=4.501，P=0.034）。

3 討論

在中國，隨著人們飲食習慣和環境的改變，結直腸癌的發病率不斷上升。國家癌癥中心統計數據顯示，2020 年結直腸癌新發病例45.6 萬例，其發病率居全部惡性腫瘤第2 位[7]。研究顯示，結直腸癌一旦發生轉移，即使經手術切除，依然容易復發[8-9]。接受過結直腸癌切除術的患者可能會發展為異時性結直腸癌。因此，早期篩查和預后評估對延長結直腸癌患者生存期具有重要意義，精準快捷的檢測手段可指導醫師判斷病情，從而制訂更規范的診療計劃，為患者爭取最佳治療機會。

ARPC 蛋白由7 個亞基組成，各亞基通過相互作用形成“C 型”的鉗形結構[10-11]，該蛋白具有3 個帶有極性基團的線性表位，抗原決定簇存在于ARPC 蛋白表面位置，易與相應抗體特異性結合，影響抗原抗體的結合能力[12-13]。ARPC 可影響腫瘤細胞和細胞外基質的運動能力，為惡性腫瘤的浸潤和轉移奠定基礎。ARPC 可通過磷酸化來發揮其生物學活性，磷酸化降低了ARPC 蛋白的穩定性，進而使其發揮作用。ARPC 可降低p53 的活性，抑制BCL2 相關X 蛋白（BCL2 associated X protein，BAX）轉錄，從而降低細胞膜的選擇透過性，繼而改變細胞周期和增殖能力，影響細胞凋亡過程，促進細胞增殖。本研究結果顯示，ARPC4陽性表達結直腸癌患者的3 年生存率低于ARPC4 陰性表達患者（P﹤0.05）。說明ARPC4對結直腸癌的發生發展具有重要作用，ARPC4高表達與腫瘤細胞免疫逃逸息息相關，ARPC4 可促進腫瘤細胞種植，縮短患者生存期。也有報道指出，ARPC4 可通過調控膀胱癌、肺癌、肝細胞癌侵襲轉移影響患者預后[14-15]。

內皮細胞之間的黏附功能對維持正常生命活動十分重要，肌動蛋白微絲骨架可以使內皮細胞之間緊密連接，即形成屏障功能。聯蛋白（catenin）和鈣黏著蛋白（cadherin）結合形成復合體后，維持了屏障功能的正常運行。有學者指出，ARPC4 可干擾catenin 與cadherin 結合，加速細胞周期，并正向調節腫瘤細胞中侵襲基因轉錄，造成細胞質內catenin 濃度升高并進入細胞核，加速腫瘤細胞的種植[16]。同時，ARPC4 作為Arp2/3 中心的重要組成部分，可增加微絲的數量，增強腫瘤細胞的侵襲性。也有報道指出，ARPC4 可對靶細胞進行雙向調節，通過抑制黑色素瘤中APRC4 的表達減緩腫瘤的侵襲速度，但其表達被明顯抑制后卻沒有這一效應[17]。

COX2 是一類參與前列腺素合成的限速酶，可被生長因子等物質刺激合成[18]。COX2 可在腫瘤中參與前列腺素合成，繼而促進腫瘤的發生發展，有學者在結腸癌轉移灶中發現COX2 呈高表達，且其表達活性明顯高于原發灶，證實COX2 對腫瘤侵襲具有促進作用，會提高結腸癌的復發風險[19]。有學者進行動物實驗后發現，定期服用COX2 抑制劑可使小鼠結腸息肉發生率降低40%，異常隱窩病灶發生率降低67%，表明COX2 抑制劑可預防結直腸疾病[20]。本研究中，有淋巴結轉移、低分化、Ⅲ～Ⅳ期結直腸癌患者結直腸癌組織中ARPC4、COX2 陽性表達率均高于無淋巴結轉移、中高分化、Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。提示ARPC4、COX2與結直腸癌患者的臨床特征密切相關。

WNT 信號通路中，ARPC4 可導致細胞質內catenin 大量聚集并入核，大大增強了catenin 與轉錄因子（transcription factor，TCF）/淋巴細胞增強結合因子1（lymphoid enhancer binding factor 1，LEF1）的結合能力，促進WNT 下游靶基因的表達。COX2可與TCF 結合，是眾多WNT 下游靶基因之一，catenin 的濃度變化可影響COX2 的表達。本研究結果顯示，結直腸癌組織中ARPC4 與COX2 的表達呈正相關（r=0.618，P﹤0.05）。分析可能因為ARPC4 高表達是catenin 濃度異常的誘因，而catenin 濃度增加可促進COX2 表達，進而促進腫瘤的發生發展。因此認為ARPC4 高表達→大量catenin 聚集→catenin 與TCF/LEF1 結合→上調COX2 表達→激活前列腺素→致癌，ARPC4 異常表達會導致COX2無法正常轉錄，進而導致癌變。

綜上所述，結直腸癌組織中ARPC4 與COX2的表達呈正相關，其表達與結直腸癌患者的臨床特征及預后有關。