乳腺炎患者膿液中金黃色葡萄球菌分離株的耐藥性和流行病學分析

萬法圣,張 玨

上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科,上海 201203

化膿性乳腺炎是由乳汁淤積和細菌感染所致的急性化膿性疾病,多見于產后哺乳期女性。金黃色葡萄球菌是導致化膿性乳腺炎最常見的病原菌。該病臨床表現為局部組織紅、腫、熱、痛,多伴有發熱,如果不及時治療,會在較短時間內快速導致乳腺膿腫、敗血癥等。本研究對2018年10月至2020年12月在本院乳腺外科就診的113例乳腺炎患者的乳腺膿液進行細菌培養,將分離到的100株金黃色葡萄球菌的耐藥性和毒力基因進行檢測和聚類分析,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018年10月至2020年12月在本院乳腺外科因急性化膿性乳腺炎就診的133例患者乳腺膿液中分離到的金黃色葡萄球菌100株。

1.2方法

1.2.1患者一般資料收集 利用醫院病歷系統收集患者年齡、性別、癥狀及體征等一般資料。

1.2.2菌株的鑒定和聚類分析 采用基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)儀(德國布魯克公司)對菌株進行鑒定,使用BioTyper軟件將采集到的100株金黃色葡萄球菌的質譜圖匯總生成整合圖譜,采用Flex Analysis軟件對特征離子峰進行分析,最后使用BioTyper軟件對100株金黃色葡萄球菌進行聚類分析。差異水平代表彼此間的親緣關系:差異水平越小,表示親緣關系越近;差異水平越大,表明親緣關系越遠。

1.2.3藥敏試驗 菌株的藥敏試驗使用Vitek-2全自動微生物分析系統(法國梅里埃公司)和藥敏紙片法(英國OXiod公司)進行檢測。藥敏試驗結果參照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)2018標準進行判讀[1]。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922由上海市臨床檢驗中心提供。

1.2.4毒力基因檢測 采用聚合酶鏈反應(PCR)檢測金黃色葡萄球菌的毒力基因,包括溶血素基因(hla和hlb)和殺白細胞毒素基因(PVL),所用引物及參數參照文獻[2]。PCR相關試劑均為大連TaKaRa公司產品。PCR基因擴增儀為美國伯樂公司產品。

1.2.5多位點序列分型(MLST) 分型根據https://pubmlst.org/saureus/網站公布的數據對金黃色葡萄球菌的7個管家基因arcc、aroe、glpf、gmk、pta、tpi和yqil進行PCR擴增,擴增產物送上海伯杰生物公司測序,結果上傳至數據庫進行比對分型。

1.3統計學處理 使用WHONET 5.6軟件對藥敏試驗結果進行統計。采用SPSS20.0建立數據庫并進行統計分析,計量資料以例數或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1患者的一般資料及臨床特點 大多數患者的年齡在21～40歲,占91.0%,女性占98.0%。81.0%的患者都出現了高熱,且73.0%的患者的白細胞計數都超出了9.16×109/L,其中33.0%的患者的白細胞計數為12×109/L以上。見表1。

表1 患者的一般資料及臨床特點[n(%)]

2.2抗菌藥物藥敏試驗結果 100株金黃色葡萄球菌中培養出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)43株和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)57株,構成比分別為43.0%和57.0%。金黃色葡萄球菌對青霉素的耐藥率最高(92.0%),其次為紅霉素、苯唑西林和克林霉素,耐藥率分別為55.0%、43.0%和23.0%,對其他抗菌藥物的耐藥率不超過10.0%。MRSA對青霉素、苯唑西林、克林霉素和阿米卡星的耐藥率明顯高于MSSA,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 金黃色葡萄球菌對常見抗菌藥物的耐藥性分析[n(%)]

2.3毒力基因檢測結果 100株金黃色葡萄球菌中有27株攜帶PVL,其中MRSA有10株,占37.0%,MSSA有17株,占63.0%。溶血素基因hla和hlb的檢出率分別為77.0%和10.0%。同時攜帶2種和3種毒力基因的菌株有32株,占32.0%。毒力基因的電泳結果見圖1。

圖1 毒力基因的電泳結果

2.4聚類分析結果 采用BioTyper軟件對100株金黃色葡萄球菌進行聚類分析,在差異水平為700時,將100株金黃色葡萄球菌分成A、B、C、D 4個聚類。其中A聚類有72株,占72%;B聚類有2株,占2%;C聚類有17株,占17%;D類有9株,占9%。

2.5MLST結果 MLST共檢測到18種序列型,其中ST59(23.0%)是主要流行的序列型,其次為ST25(21.0%)和ST398(16.0%),其中ST59和ST398主要分布于MRSA。見表3。

表3 100株金黃色葡萄球菌分型結果[n(%)]

3 討 論

化膿性乳腺炎具有典型急性乳腺炎癥狀。本研究收集到的急性化膿性乳腺炎患者中,女性占98.0%,且91.0%的患者年齡集中在21～40歲的育齡階段。多數患者出現了高熱,伴有血常規的異常,73.0%的患者的白細胞計數超過了9.16×109/L,63.0%的患者中性粒細胞比率升高(≥70.0%)。C反應蛋白(CRP)作為炎癥疾病的標志物,與炎癥的發生、發展和疾病的嚴重程度具有相關性。本研究中69.0%的患者出現了CRP水平的升高(≥8 mg/L),40.0%的患者的CRP超過了20 mg/L。

金黃色葡萄球菌為急性乳腺炎的主要致病菌[3-4],本研究納入的133例患者中共分離金黃色葡萄球菌100株。藥敏試驗結果顯示,金黃色葡萄球菌對青霉素的耐藥率最高,為92.0%,其次為紅霉素和苯唑西林,耐藥率分別為55.0%和43.0%,對其他抗菌藥物的耐藥率都不超過10.0%。其中MRSA有43株,占43.0%,高于全國細菌耐藥監測網(CHINET)公布的耐藥數據(31.4%)[5],因MRSA除對頭孢洛林外的頭孢類抗菌藥物都耐藥,因此頭孢類抗菌藥物已不適宜作為臨床經驗用藥。CHINET數據顯示,MRSA除對β-內酰胺類和頭孢類抗菌藥物耐藥外,還對氨基糖苷類、大環內酯類、喹諾酮類、磺胺類抗菌藥物均不同程度耐藥,其耐藥率大部分高于MSSA。但慶幸的是,本研究分離到的MRSA除了對苯唑西林和青霉素全部耐藥,對大環內酯類抗菌藥物紅霉素和克林霉素,以及氨基糖苷類抗菌藥物阿米卡星有一定的耐藥之外,對其他抗菌藥物的耐藥率都為0。可見,社區獲得性的MRSA引起的感染,除了頭孢類抗菌藥物和大環內酯類抗菌藥物不推薦使用外,其他抗菌藥物都是可選的,并不需要使用萬古霉素和利奈唑胺等抗菌藥物。

盡管本研究中的乳腺炎患者分離到的金黃色葡萄球菌的耐藥率并不高,但毒力較強。100株金黃色葡萄球菌中有27株攜帶PVL,溶血素基因hla和hlb的檢出率分別為77.0%和10.0%。同時攜帶2種和3種毒力基因的菌株有32株,占32.0%。

PVL毒素是由LukSF-PV基因編碼的一種金黃色葡萄球菌毒力因子,可加重金黃色葡萄球菌的致病性,特別是導致嚴重的壞死、深層皮膚感染,如腦膜炎[6]、膿腫[7-8]、壞死性肺炎[9],甚至是敗血性休克[10]等。PVL陽性金黃色葡萄球菌已在全世界范圍內流行,非洲中西部國家的檢出率達到了57.0%[11],在嬰兒患者中的檢出率也高達57.5%[12]。所幸我國的檢出率為12.8%[13],但是本研究中PVL的檢出率為27.0%,由此可見PVL陽性金黃色葡萄球菌在乳腺炎患者中的占比較高,應引起臨床的高度重視。PVL通常被認為是社區獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(CA-MRSA)的特征,可引起頑固性皮膚感染[14]。但是在本研究中,PVL陽性金黃色葡萄球菌中MSSA占63.0%。可見,PVL并不是只在MRSA中存在,在MSSA中的檢出率也在增加。

α溶血素和β溶血素分別由溶血素基因hla和hlb編碼,可破壞紅細胞、血小板及中性粒細胞等的細胞膜,使細胞溶解,也可以引起全身各種組織器官的損傷。有研究對72株導致皮膚軟組織感染的CA-MRSA毒力基因進行檢測,發現hla和hlb的檢出率分別為97.2%和33.3%[15],高于本研究的檢測結果(hla 77.0%和hlb 10.0%)。可見,金黃色葡萄球菌的溶血素基因除了在乳腺炎患者中普遍存在,在其他皮膚組織感染中的檢出率更高,也應引起臨床高度重視。

MALDI-TOF MS技術在微生物的鑒定方面具有非常高的特異度和靈敏度,且操作簡單、費用低,可以完全代替傳統的生化鑒定方法[16],該方法還具有進行亞種水平的流行病學分析的潛力[17]。本研究中,通過MALDI-TOF MS分析技術,將100株金黃色葡萄球菌分成4個聚類,其中A型菌株為主要優勢菌,占72.0%。因此,此類菌株很有可能引起社區的流行,應引起關注。

社區獲得性和醫院獲得性的金黃色葡萄球菌的MLST有所不同,牛源性乳腺炎金黃色葡萄球菌以ST22和ST398為主[18],食品中檢測到的金黃色葡萄球菌以ST7和ST5為主要流行ST型[19-20]。而醫院中分離到的金黃色葡萄球菌以ST239為主[21]。本研究中乳腺炎患者分離到的金黃色葡萄球菌的MLST以ST59(23.0%)為主,其次為ST25(21.0%)和ST398(16.0%),其中ST59和ST398主要分布于MRSA。因此,對于社區獲得性的ST59和ST398型的MRSA要引起防控部門的高度重視。

綜上所述,乳腺炎患者乳腺膿液中MRSA毒力強,且有在社區廣泛流行的趨勢。因此,臨床上應持續監測金黃色葡萄球菌的耐藥性和毒力基因,以及最新的流行情況,為臨床治療由此類菌株引起的感染提供依據。