養陰益氣膠囊長期毒性實驗

唐穎馨,姚達寶,聶璐薇,劉娜

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院神經內科,武漢 430030)

隨著人口的增長和老齡化,腦卒中成為全球人類致殘和死亡的第2大原因[1]。糖尿病是腦血管病危險因素之一,約1/3腦卒中患者同時患有糖尿病,伴發糖尿病的腦卒中患者預后較差[2]。預防糖尿病、管理好糖尿病患者的血糖,對降低腦卒中的發生率、改善腦卒中患者的預后具有重要的臨床意義[3-5]。糖尿病屬于中醫的消渴病范疇[6],其治療需針對病因病機,抓住陰虛為本的實質,以氣陰兩虛為主要治療對象,并兼顧陽虛與血瘀的治療為綱[7-8]。養陰益氣膠囊則是針對這一治法治則而開發的中藥新藥,處方組成為黃芪、葛根、山楂、絞股藍、天花粉、葫蘆巴,以“益氣養陰為主,兼及溫陽與活血”為治則,增強養陰之力,又改善脾胃之功,具有益氣養陰,兼顧治療陽虛與血瘀的作用,對上、中、下三消的病證有明確的功效。從單味藥材來看,本品大部分藥材均具有一定的降血糖作用[9-12],由于伴發糖尿病的腦卒中患者多有陰虛與血瘀表現,因此養陰益氣膠囊對于腦卒中伴糖尿病患者的療效可能更好。養陰益氣膠囊作為中藥新藥,尚處于臨床前研究。因本品內容物含有較多的輔料,開展毒理實驗時,采用最大灌胃量給藥也無法達到足夠的毒性考察劑量,故本研究采用其浸膏進行灌胃給藥,以提高給藥量,連續給藥6個月來考察本品的長期毒性[13],以確定其安全劑量,為產品臨床安全應用提供支撐。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD大鼠90只,6～8周齡,雌雄各半,雌性體質量(146.9±8.9)g,雄性體質量(171.4±13.4)g,由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供(合格證號:醫動字19-008)。大鼠按性別分籠飼養,每籠5只,適應性飼養1周,自由進水,保持室溫(25±2)℃,相對濕度55%～60%,12 h光照/12 h黑暗;大鼠喂養飼料(玉米73.5%,麥麩20%,魚粉5%,谷粉1%,食鹽0.5%)由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供。

1.2藥物與溶媒 養陰益氣膠囊浸膏(浸膏1 g相當于生藥6.64 g),由健民藥業股份有限公司提供,每瓶400 g,批號:980920。溶媒為純化水,臨用前配制成不同濃度的混懸液。

1.3儀器 PRACTUM612-1CN電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司,感量:10 mg],XT-2000i全自動血球計數儀[希森美康生物科技(無錫)有限公司],AU680型全自動生化分析儀(貝克曼庫爾特有限公司),DM2500光學顯微鏡(德國徠卡公司)。

1.4動物分組與給藥 動物經適應性飼養1周后,按隨機數字表法將90只大鼠隨機分為養陰益氣膠囊大劑量組、小劑量組和空白對照組,每組30只,雌雄各半。養陰益氣膠囊大劑量組:每日灌胃給藥劑量為相當于生藥20 g·kg-1,相當于臨床日擬用量的60倍;養陰益氣膠囊小劑量組:每日灌胃給藥劑量相當于生藥5 g·kg-1,相當于臨床日擬用量的15倍;空白對照組:每日灌胃等容量的純化水。各組均每日上午灌胃給藥1次,灌胃容量均為5 mL·kg-1;給藥劑量根據每周體質量測量的結果進行調整;給藥時間均為180 d。給藥第90天時,處死大劑量組和空白對照組動物各10只,用于中間剖檢,以觀察灌胃90 d后動物是否存在明顯毒性作用;給藥第180天時,處死空白對照組和大劑量組動物各10只,小劑量組20只;其余動物停藥觀察2周后處死,處死前稱定體質量。

1.5動物基本情況觀察 實驗期間,每日觀察大鼠外觀體征、進食、行為活動、排便等情況;每周測量體質量1次,統計分析每4周體質量增長量。

1.6血液學指標檢測 動物處死后,取全血檢測紅細胞計數、血紅蛋白定量、白細胞計數及分類等。

1.7血液生化指標檢測 動物處死后,取全血,檢測丙氨酸氨基轉移酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase,AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、血糖(glucose,Glu)等。

1.8病理檢查 ①系統尸檢:全面檢查各組織器官的大小、形態、顏色、質地、有無出血、淤血、滲出等病理變化。②臟器系數:大鼠處死前稱定體質量,取出心、肝、脾、肺、腎、胃、腎上腺、腦垂體、甲狀腺、卵巢、睪丸等組織后,立即用濾紙吸干表面水分,稱定質量,計算臟器系數。③組織學檢查:10%甲醛(福爾馬林)溶液固定,石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察。

1.9可逆性觀察 給藥180 d后,每組均留大鼠10只,于停藥后繼續觀察2周再處死,各項檢測指標同前。

2 結果

2.1對動物基本情況的影響 3組大鼠實驗期間和停藥2周后,外觀體征和行為活動未見異常,大鼠活動自如,毛發整齊而有光澤,糞便呈顆粒狀;養陰益氣膠囊大、小劑量組大鼠體質量增加,與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05),大鼠體質量增長情況見表1。

表1 3組大鼠不同給藥時間體質量增長情況比較

2.2對血液學指標的影響 3組大鼠連續灌胃給藥180 d后,養陰益氣膠囊小劑量組和大劑量組血液學指標均在正常范圍內[12],與空白對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05);停藥2周后,養陰益氣膠囊小、大劑量組血液學指標均在正常范圍內,與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 3組大鼠給藥180 d和停藥2周后血常規指標比較

2.3對血生化指標的影響 養陰益氣膠囊連續灌胃給藥180 d后,養陰益氣膠囊大劑量組BUN高于空白對照組(P<0.05),但仍在正常范圍內[14];其余血生化指標各組間比較差異無統計學意義(P>0.05);停藥2周后,與空白對照組比較,養陰益氣膠囊小劑量組、大劑量組血液生化指標差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 3組大鼠給藥180 d和停藥2周后血生化指標比較

2.4對臟器系數的影響 系統尸解發現,給藥180 d和停藥2周,3組大鼠各組織器官的大小、形態、顏色、質地等均未見異常,無水腫、出血、滲出等變化。養陰益氣膠囊連續灌胃給藥180 d和停藥2周后,與空白對照組比較,養陰益氣膠囊小劑量組、大劑量組各臟器系數及生殖腺系數均差異無統計學意義(均P>0.05),見表4。

表4 3組大鼠灌胃180 d和停藥2周后臟器系數和生殖腺系數比較

2.5組織病理學檢查 空白對照組及大劑量組有個別動物肝細胞有輕度水樣變性,2組間有輕度水樣變性的細胞,數量差異無統計學意義(P>0.05),其他未見明顯病變,見圖1。

圖1 3組大鼠給藥180 d肝臟組織病理圖(HE,×100)

3 討論

藥物養陰益氣膠囊經過長期灌胃給藥(6個月)后毒性情況研究結果顯示,安全性總體良好,部分異常數據主要集中在血生化指標,如大劑量組大鼠BUN水平高于空白對照組,但仍在正常范圍內,且大劑量相當于臨床用藥劑量的60倍,小劑量組大鼠則未出現BUN增高的情況。此外,停藥2周后觀察,大劑量組大鼠BUN已恢復正常,表明大劑量藥物所致BUN異常在停藥后可逆,且臨床擬用量遠小于該劑量,故綜合來看,大鼠灌胃養陰益氣膠囊6個月,生藥安全劑量20 g·kg-1,且該劑量相當于臨床擬用量的60倍,整體安全性較好。

按照相關指導原則[13],中成藥因受制于制劑因素,在開展毒理學實驗,尤其是急性毒性實驗與長期毒性實驗時,一般會采用浸膏進行給藥,目的是能給予足夠大劑量,以充分暴露產品毒性情況。因此,浸膏作為中成藥所有物質成分的集合物,基本可以代替成品制劑進行毒理學研究,且相對于成品制劑而言,更能發現產品的毒性作用。而與本文浸膏所混合的輔料均為國家認可的無活性物質,并不會影響藥物安全性的評價。

當然,本研究仍存在一定的不足,由于本品的有效成分及其檢測方法研究尚需改進,未能伴隨毒動學研究,尚不能從物質基礎角度探索本品的安全性情況,僅通過動物行為表現、相關生理指標來反映。為此,后續將進一步通過腦卒中伴糖尿病動物開展PK-PD模型研究,以更加全面、深入地探索本品療效與安全性。