雙組分調控系統與細菌耐藥性的關系及其抑制劑研究進展*

蔡楊,凌保東

(1.成都醫學院藥學院,成都 610500;2.成都醫學院結構特異性小分子藥物研究四川省高校重點實驗室,成都 610500;3.四川省彭州市第四人民醫院,彭州 611933)

雙組分調控系統(two-component regulatory system,TCS)廣泛存在于原核細胞中,是細菌感知和響應環境信號、調節生理行為最主要的機制,在細菌致病性、耐藥性、生物被膜形成、毒力因子調控等方面均發揮著重要作用[1]。當細菌TCS感知和響應環境刺激時,是通過組氨酸激酶(histidine kinases,HK)和胞內的反應調節蛋白(response regulators,RR)使相關蛋白磷酸化來發揮調控作用[2]。細菌蛋白質磷酸化修飾是調控細菌基因表達的一種重要方式,也是藥物作用的重要靶點。因此,靶向細菌TCS 抑制劑的開發成為新型抗感染藥物研究的熱點[3]。

1 TCS介紹

TCS是細菌、古細菌中最普遍的信號轉導系統[1],在細菌中共發現TCS 1 000多種,平均一個細菌基因組可包含TCS編碼基因50～60個,如銅綠假單胞菌編碼TCS 60多個,大腸埃希菌編碼TCS>30個,鮑曼不動桿菌中TCS有18個[4]。

1.1TCS 結構和功能 TCS通常由2種成分組成,即嵌入細胞膜中傳感器HK和胞內RR[5]。HK接受環境的刺激,RR引起相應的生理改變[5],它們在細菌細胞中具有高度特異性[6]。HK由信號接收域和結構保守的催化核心組成,催化核心包括蛋白二聚體和組氨酸磷酸轉移結構域(dimerization and histidine phosphotransfer,DHp) 和ATP 結合結構域[6]。RR由信號接收域和DNA結合的輸出結構域組成[6]。

細菌TCS感知和響應環境刺激時,通過HK和RR使相關蛋白磷酸化來發揮調控作用。分為4個步驟:①HK檢測外部環境或胞內/胞外生理性刺激,如滲透壓或 pH 值;②HK催化DHp上保守的組氨酸發生自身磷酸化;③磷酸基團轉移到同源RR接收結構域保守的天冬氨酸上;④磷酸化反應激活RR與特定DNA序列的結合,調節靶基因表達,實現對基因表達的控制[2,7]。許多HK也可以作為磷酸酶,使磷酸化的RR去磷酸化,從而可逆地控制基因表達。此外,復雜TCS信號傳導需要通過多步磷酸化接力傳遞來完成信號傳遞[3]。HK磷酸化后,磷酸基團轉移到胞內的一個接收結構域上,然后由組氨酸磷酸轉移酶將磷酸基團轉移至RR上,再引發信號輸出,引起多種細胞生理變化[3]。在某些情況下,單個 HK 蛋白可具有多個同源 RR 蛋白,或單個 RR 蛋白可被多個 HK 蛋白激活[8]。為了更敏感地響應不同的環境變化,信息也在不同的 TCS之間傳遞,形成一個復雜的信號轉導網絡,各TCS相互作用、互相協調,感應外界環境并做出應答[7,9]。

細菌具有多個TCS,每個TCS響應特定的環境信號,如pH值、營養水平、滲透壓、氧化還原狀態、群體感應蛋白和抗菌藥物[10],由此產生的細胞生理變化通常涉及激活細菌防御機制和增加抗菌藥物耐藥性[11],功能包括細胞生長、代謝調節、趨化性、毒力調節、群體感應、生物被膜形成和耐藥性產生等[2]。

1.2TCS的種類

1.2.1必需的TCS WalKR TCS已被證明在革蘭陽性菌(包括枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌和糞腸球菌)的生長中是必要的,功能主要為調節細胞壁代謝[12],但在革蘭陰性菌(肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌)中必需的TCS筆者未見報道。見表1。

表1 TCS種類及生理功能

1.2.2非必需的TCS 除了涉及生長的TCS,大多數 TCS 對正常生長條件下的細菌存活不是必需的。細菌應對特殊壓力環境的特定反應,如耐藥性、毒力調節與生物被膜的形成都依賴于非必需TCS。各種TCS參與并調節致病菌的毒力因子,包括毒素的產生和分泌,對抗菌藥物產生耐藥性。其他重要的功能包括運動性、粘附宿主、定植和生物被膜形成等。見表1。

2 TCS與細菌耐藥性的關系

2.1細胞表面修飾

2.1.1革蘭陰性菌 TCS PhoPQ和PmrAB通過上調負責修飾細菌膜中脂多糖脂質A基因的表達,在多種革蘭陰性菌(包括銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌等)的多粘菌素和抗菌肽的耐藥性中起重要作用[4,18]。脂質A修飾包括加入4-氨基阿拉伯核糖或磷酸乙醇胺,可降低細胞膜的凈負電荷,限制與陽離子抗菌藥物(如多粘菌素)的相互作用。PhoPQ 可感知細菌胞外鎂離子(Mg2+)、鈣離子(Ca2+)和陽離子抗菌肽的存在,PmrB感知環境中弱酸性、低鎂離子、鐵限制等信號[19]。PhoPQ參與沙門菌中毒力的控制,且在銅綠假單胞菌的生物被膜形成和毒力中發揮作用[4,20]。PhoPQ不存在鮑曼不動桿菌中,PmrAB獨立參與鮑曼不動桿菌對多粘菌素的耐藥性[13]。肺炎克雷伯菌的PhoBR調節編碼孔蛋白基因phoE表達下調,介導碳青霉烯類藥物的耐藥性[21]。

2.1.2革蘭陽性菌 TCS VraSR能夠對靶向細胞壁肽聚糖合成的抗菌藥物迅速做出反應,感知細胞壁損傷,阻礙細胞壁合成基因的轉錄反應,導致β-內酰胺類和糖肽類抗菌藥物耐藥,并且調節細菌的毒力和生物被膜的形成[22]。VraS或VraR基因的缺失會使金黃色葡萄球菌對β-內酰胺類藥物和萬古霉素重新敏感[23],并且在調節表皮葡萄球菌生物被膜的形成和對壓力的耐受性中也起著重要作用[24]。WalKR不僅參與細胞壁合成的調控,還與lytM、atlA、ssaA和isaA基因的啟動子區域特異性結合,正向調控自溶素和肽聚糖水解酶的表達,修飾細胞壁表面結構,增加萬古霉素耐藥性[12]。BraRS參與檢測金黃色葡萄球菌細胞膜的破壞,對桿菌肽和乳鏈菌肽的耐藥至關重要[22]。

2.2外排泵的過度表達 AdeRS是鮑曼不動桿菌中研究最深入的TCS之一。AdeRS中AdeR、AdeS或兩者共同突變導致外排泵AdeABC過表達[25],介導鮑曼不動桿菌的替加環素耐藥性[25]。當adeS失活,RND外排泵AdeABC顯現下調而導致鮑曼不動桿菌對氨基苷類藥物的敏感性增加[26]。根據轉錄組學數據,AdeRS控制近579個不同基因的表達[27]。此外,AdeRS也調控生物被膜的形成和表面運動相關功能[28]。鮑曼不動桿菌的TCS BaeSR通過上調外排泵基因adeA和adeB增加替加環素耐藥性[29]。BaeSR 的缺失可導致主要外排泵 AdeABC、AdeIJK 和 MacAB-TolC 表達顯著降低,增加鮑曼不動桿菌對替加環素和鞣酸的敏感性[30-31]。AdeRS 和BaeSR的耐藥機制重疊,提示BaeSR可能通過與AdeRS發生串繞,共同調控基因表達[30]。CpxAR可以控制外排泵編碼基因acrB、acrD和eefB的表達,與頭孢吡肟和氯霉素耐藥性有關[32];最新研究表明,當移動元件ISAba1插入BaeSR 基因后,外排泵基因(如macAB和adeIJK)表達增強,并介導鮑曼不動桿菌對多粘菌素的耐藥[33]。

2.3激活耐藥酶 銅綠假單胞菌中TCS CreBC激活染色體ampC基因,引發染色體β-內酰胺酶的過量產生,水解 β-內酰胺類藥物[34]。GluSR突變也可以激活伯克霍爾德菌的β-內酰胺酶引起β-內酰胺類藥物的耐藥性[35]。PhoPQ 失活改變嗜麥芽窄食單胞菌外膜通透性,并增加β-內酰胺酶的流入,導致β-內酰胺類藥物的耐藥性[36]。氣單胞菌中TCS BlrAB通過BlrB 感知肽聚糖損傷使BlrA磷酸化,導致幾種β-內酰胺酶的激活,包括頭孢菌素酶、青霉素酶和碳青霉烯酶[37]。AarG傳感器激酶通過調節aac(2')-Ia基因,導致氨基苷類乙酰轉移酶表達增加,與氨基苷類抗菌藥物耐藥性有關[38]。

2.4形成生物被膜 細菌生物被膜形成受TCS密切調控,TCS 控制生物被膜產生的關鍵成分以響應環境刺激,并最終觸發細菌從浮游菌階段轉變為生物被膜菌階段[39]。一旦形成生物被膜,細菌通過TCS或群體感應系統再次激活生物被膜內其他毒力基因[40]。銅綠假單胞菌多個TCS參與其生物被膜形成的整個過程,包括粘附-不可逆附著-聚集-成熟-解聚,涉及SagS、CreBC、GacSA等多個TCS[39,41-42]。SagS 激活 BrlR 上調MDR 外排泵,大大提高生物被膜的耐藥性[41];CreBC直接感知青霉素結合蛋白4(PBP4),增加生物被膜的形成[42]。GacSA 通過與 RetS 和 LadS 的相互作用來控制sRNA、RsmY 和 RmsZ 的表達,將細菌急性感染轉變為慢性感染[39]。除了調控生物被膜的形成,TCS在銅綠假單胞菌的運動性、毒素分泌和色素產生中都起重要作用。鮑曼不動桿菌通過激活BfmRS促進菌毛組裝系統CsuA/BABCDE表達,合成菌毛粘附于生物/非生物的表面[43-44]。敲除BfmR后塑料上生物被膜形成的喪失,導致美羅培南和多黏菌素E耐藥性上升。BfmS敲除后生物被膜形成受損,且減少Hcp蛋白的分泌[45],對氨曲南和多黏菌素敏感性降低[46]。GacSA在鮑曼不動桿菌中可以視為全局性調控劑,控制著多種基因的表達,包括毒力基因、菌毛、生物被膜形成以及運動性和芳香化合物代謝[39]。

3 TCS抑制劑

細菌TCS的主要調控方式是蛋白質磷酸化修飾,它既是調控細菌細菌諸多生命活動的一種重要方式,也是藥物作用的重要靶點[9,47]。目前靶向細菌TCS的藥物主要作用于TCS的HK-RR結構域而影響其生物學功能,涉及到的具體靶點主要有:①阻斷HK對外部刺激的識別;②抑制HK磷酸化;③抑制ATP結合;④抑制RR磷酸化;⑤抑制RR與DNA結合[48]。根據TCS來源,將TCS抑制劑分為三大類:小分子化合物類TCS抑制劑、天然產物類TCS抑制劑和抗菌肽類TCS抑制劑。

3.1小分子化合物類TCS抑制劑

3.1.1靶向組氨酸激酶HK的抑制劑 迄今為止,大多數報道的TCS小分子抑制劑主要作用于TCS的HK。HK的催化結構域在TCS結構中保守度高,故大多抑制劑都以HK為靶點。最早在1993年報道的TCS抑制劑是合成的噻唑衍生物,可以同時抑制銅綠假單胞菌HK AlgR2活性和RR AlgR1與DNA結合活性[49]。環苯、苯并咪唑、苯并葉惡嗪、雙苯等小分子化合物,不僅抑制HK,且影響細胞膜的完整性[48]。近年來以苯并噻唑為內核的小分子化合物成為研究熱點,GOSWAMI等[50]通過高通量篩選鑒定的類似物riluzole-4 和riluzole-12通過阻斷TCS GacS/GacA的信號影響RR GacA的表達降低喹諾酮類和吩嗪類等毒力因子的產生,并嚴重影響銅綠假單胞菌的運動性。THIELEN等[51]合成的2-氨基苯并噻唑類抑制劑在低Mg2+下抑制腸道沙門菌的生長,降低毒力基因pagC和pagK的表達,并減弱對多粘菌素B和多粘菌素E耐藥性,使多粘菌素B和多粘菌素E的MIC降低至少16倍。

3.1.2靶向反應調節蛋白RR的抑制劑 相較于靶向HK,靶向RR最大的優勢是直接控制基因表達,從而控制細菌的生理行為。在非同源HK-RR對之間可能發生不同程度的串擾,RR可以被來自另一個TCS的HK磷酸化,例如抑制同源HK會導致RR功能的不完全抑制[52]。TSAI等[53]鑒定的化合物Dephostatin通過SsrA-SsrB和PmrB-PmrA雙組分調控系統干擾信號傳導,可抑制沙門菌細胞內毒力因子并恢復多粘菌素的敏感性。TCS ArsRS對于幽門螺桿菌的酸適應和胃內定植至關重要,同時控制幽門螺桿菌主要毒力因子的表達,包括粘附因子和生物被膜[54]。

3.2天然產物類TCS抑制劑 近年來,發現越來越多的天然產物具有TCS抑制活性,很多天然藥物中已經分離出包括酚類、黃酮類、萜類等多種具有TCS抑制活性的中藥單體化合物[55]。ZHOU等[56]驗證木犀草素對HK853蛋白自磷酸化活性的抑制作用,且木犀草素對HKS53的結合和抑制并非特異性,該作用可以推廣到其他結構類似于木犀草素的黃酮類物質和TCS的其他HK蛋白。GONZALEZ等[57]證明7種天然類黃酮(包括木犀草素、山奈酚、槲皮素、楊梅素、芹菜素、白楊素和橙皮素)明顯抑制HsrA的DNA結合活性,其中芹菜素、白楊素、山奈酚和橙皮素表現出對幽門螺桿菌的殺菌活性,白楊素與克拉霉素或甲硝唑組合表現出協同抗菌活性。兩者的研究表明,黃酮類天然產物可作用于TCS不同靶點,進一步證明了黃酮類天然產物作為新型TCS抑制劑的潛力。

3.3抗菌肽類TCS抑制劑 抗菌肽對TCS的抑制主要表現為靶向胞內的RR受體和競爭性抑制HK。HO等[58]發現抗菌肽乳鐵素B降低大腸埃希菌對環境刺激的耐受性,通過選擇性結合RR受體結構域,抑制RR(BasR和CreB)及其同源HK(BasS和CreC)的磷酸化,表明抗菌肽可以直接影響TCS的磷酸化來抑制細菌的生長。能力刺激肽(CSP)是由肺炎鏈球菌分泌的 17 個氨基酸小分子肽。當CSP的濃度達到閾值時,CSP通過結合HK Com D ,激活RR ComE,導致毒力因子的表達[59]。經過化學修飾小分子肽可以競爭性抑制CSP,在肺炎鏈球菌肺部感染期間可有效地與HK ComD結合,抑制RR ComE調節基因的表達,降低了小鼠死亡率[60]。這種小分子肽可作為治療肺炎球菌感染的新一代抗菌劑。

3種類型TCA抑制劑舉例見表2。

表2 TCS抑制劑舉例

4 結束語

細菌通過TCS的蛋白質磷酸化修飾方式調控細菌生命活動;可以通過干擾TCS通路來開發的新型抗菌藥物 。按作用靶點分類,TCS抑制劑可以分為靶向HK和靶向RR以及同時靶向HK和RR的藥物。靶向抑制HK活性的藥物,可以減少磷酸基團的轉移,影響細菌細胞膜產生;靶向抑制RR活性的藥物,特異性強,直接控制基因表達;同時靶向抑制HK和RR的藥物表現出高度的疏水性,生物利用度較差。由于TCS信號轉導系統僅存在于原核細胞,開發的TCS抑制劑對人體細胞影響較小。通過靶向TCS來設計具有抗菌活性的小分子化合物抑制劑,研發周期長、投資大,目前尚沒有小分子化合物被開發成為臨床用藥。天然產物便宜易得,且具有一定的抗菌活性,這一類TCS抑制劑可以作為聯合用藥治療耐藥菌感染,既增強抗菌藥物的抗菌作用效果,還可較大限度地減少耐藥性的產生。部分抗菌多肽也可以影響細菌的蛋白質磷酸化過程,可以作為TCS抑制劑。但天然抗菌肽存在體內的代謝穩定性差、活性普遍不高和存在細胞毒性等缺陷。針對耐藥菌引起的感染,TCS抑制劑具有廣闊的開發應用前景,與常規藥物聯合用藥或將成為解決抗菌藥物耐藥性問題的新策略。