氟離子植入豬骨源羥基磷灰石對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞黏附、增殖與成骨分化的影響

李梁 陳桂珍

【摘 要】目的 檢測(cè)氟離子植入豬骨來源羥基磷灰石（PHA）對(duì)小鼠前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）黏附、增殖及成骨分化的影響。方法 取豬骨松質(zhì)用高溫?zé)Y(jié)的方法制備PHA，使用氟化鈉浸泡結(jié)合二次高溫?zé)Y(jié)進(jìn)行氟離子植入，制備獲得氟化豬骨源羥基磷灰石（FPHA）骨塊，進(jìn)行研磨獲得顆粒材料后制備壓片，采用PHA顆粒制備的壓片為對(duì)照組，采用FPHA顆粒制備的壓片為實(shí)驗(yàn)組。在壓片材料表面接種小鼠MC3T3-E1前成骨細(xì)胞株，通過掃描電鏡SEM觀察不同時(shí)間細(xì)胞黏附形態(tài)，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶ALP、骨鈣素BGLAP、骨橋蛋白OPN mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 掃描電鏡SEM觀察可見，PHA與FPHA組細(xì)胞黏附生長(zhǎng)良好；兩組細(xì)胞接種1、7d后OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；FPHA組接種3、5 d后OD值高于PHA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；RT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)PHA組細(xì)胞接種3、7 d后ALP、BGLAP mRNA表達(dá)水平均高于PHA組，且兩組細(xì)胞接種7 d后材料表面細(xì)胞ALP與BGLAP mRNA表達(dá)水平均高于細(xì)胞接種3 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 PHA與FPHA材料均具有良好的細(xì)胞相容性，氟離子植入豬骨羥基磷灰石可促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞早期增殖與成骨分化。

【關(guān)鍵詞】氟離子；羥基磷灰石；成骨細(xì)胞；黏附；增殖；成骨分化

中圖分類號(hào)：R783.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1004-4949（2023）16-0001-04

Effects of Fluoride Incorporation into Porcine Hydroxyapatite on Adhesion， Proliferation and Osteogenic Differentiation of MC3T3-E1 Cells

LI Liang， CHEN Gui-zhen

（Department of Stomatology， the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmacological University， Guangzhou 510080， Guangdong， China）

【Abstract】Objective To evaluate the effects of fluorine incorporation into porcine hydroxyapatite （PHA） on attachment， proliferation and osteogenic differentiation of rat pre-osteoblast cell line MC3T3-E1. Methods PHA was fabricated from porcine bone by thermal treatment. Fluorine incorporation was carried out by sodium fluoride immersion and a second stage thermal treatment. The fluorinated porcine hydroxyapatite （FPHA） bone blocks were prepared， grinded to obtain particle materials， and then prepared into tablets. The tablets prepared by PHA particles were used as the control group， and the tablets prepared by FPHA particles were used as the experimental group. Mouse MC3T3-E1 pre-osteoblast cell line was inoculated on the surface of the tableting material. The cell adhesion morphology at different times was observed by scanning electron microscopy （SEM）. The cell proliferation was detected by CCK-8 method. The expression of osteogenic related genes alkaline phosphatase ALP， osteocalcin BGLAP and osteopontin OPN mRNA was detected by RT-PCR. Results SEM observation showed that the cells in the PHA and FPHA groups adhered and grew well. There was no significant difference in OD value between the two groups on 1st and 7th days after cell inoculation （P>0.05）. The OD value of FPHA group was higher than that of PHA group on 3rd and 5th days after cell inoculation， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The results of RT-PCR showed that the expression levels of ALP and BGLAP mRNA in FPHA group were higher than those in PHA group on 3rd and 7th days after cell inoculation， and the expression levels of ALP and BGLAP on the surface of the two groups on 7th day after cell inoculation were higher than those on 3rd day after cell inoculation， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion PHA and FPHA materials have good cell compatibility. Fluorine incorporation into porcine hydroxyapatite can promote the early proliferation and osteogenic differentiation of mouse preosteoblasts.

【Key words】Fluorine； Hydroxyapatite； Osteoblast； Adhesion； Proliferation； Osteogenic differentiation

動(dòng)物骨來源羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是口腔臨床應(yīng)用最廣泛的骨組織替代材料之一，主要由天然骨經(jīng)物理化學(xué)手段去除有機(jī)物后制備獲得，具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，在體內(nèi)可被緩慢降解并引導(dǎo)成骨[1，2]。但由于其缺乏骨誘導(dǎo)性，研究人員試圖對(duì)其改性以更好地滿足骨缺損修復(fù)的臨床需求。離子摻雜（植入）可改變磷灰石材料的理化與生物學(xué)性能，是目前磷灰石材料改性研究的熱點(diǎn)。氟元素是骨形成及骨基質(zhì)礦化的必需元素，可通過不同的機(jī)制影響骨代謝，包括通過降解釋放到體液中參與骨改建，在植骨材料表面與植骨受區(qū)直接刺激成骨或破骨細(xì)胞活性，直接刺激成骨細(xì)胞合成相關(guān)蛋白等[3]。同時(shí)，氟也可促進(jìn)磷灰石晶體的形成和生長(zhǎng)，并對(duì)骨組織的礦化起促進(jìn)作用[4]。因此，氟離子植入可能是提高磷灰石材料成骨效能的有效方案。然而，目前仍缺乏比較成骨細(xì)胞對(duì)FPHA和HA材料反應(yīng)的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)在前期已制備完成豬骨源羥基磷灰石PHA與氟離子植入豬骨源羥基磷灰石FPHA的基礎(chǔ)上，通過觀察PHA與FPHA兩種材料對(duì)小鼠前骨細(xì)胞MC3T3-E1早期黏附、增殖及成骨分化的影響，評(píng)估FPHA新材料的體外生物學(xué)性能，旨在加強(qiáng)對(duì)不同生物材料的骨傳導(dǎo)機(jī)制的理解，并為開發(fā)用于醫(yī)學(xué)植入的更好骨傳導(dǎo)生物材料提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 PHA及FPHA壓片的制備

1.1.1 PHA與FPHA骨顆粒的制備 取成豬股骨頭松質(zhì)骨，高壓鍋內(nèi)煮30 min后取出，去盡軟組織晾干，以30%雙氧水浸泡24 h，雙蒸水沖洗；再以100%酒精浸泡24 h，取出干燥，將骨塊研磨并收集直徑約0.25～1 mm的骨顆粒，以程序控溫馬弗爐（西格瑪公司，SGM6812BK，洛陽(yáng)）燒結(jié)至800 ℃（升溫速率10 ℃/min，在空氣中維持加熱2 h），自然冷卻至常溫后取出。將PHA顆粒浸泡于0.25 mol/L氟化鈉溶液24 h后，二次高溫?zé)Y(jié)至700 ℃（升溫速率10 ℃/min，在空氣中維持加熱3 h），冷卻后以去離子水清洗浸泡3次，24 h/次，然后置于80 ℃干燥箱整夜干燥，制備獲得FPHA顆粒[5，6]。

1.1.2 PHA與FPHA壓片制備 秤取200 mg骨粉，利用旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)制備為直徑8 mm、厚2 mm圓形片狀。放入48孔板中后進(jìn)行紙塑包裝，以25 KGy劑量進(jìn)行鈷60γ射線滅菌備用。其中，采用PHA顆粒制備的壓片為對(duì)照組（PHA組），采用FPHA顆粒制備的壓片為實(shí)驗(yàn)組（FPHA組）。

1.2 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)與接種 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)小鼠前骨細(xì)胞株MC3T3-E1（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）培養(yǎng)于含10%胎牛血清（Gibco，美國(guó)）及1%青鏈霉素（Sigma，美國(guó)）的α-MEM低糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)）中，在37 ℃、5%CO2、95%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，3 d后換液，細(xì)胞鋪板80%左右傳代，將第3～5代細(xì)胞應(yīng)用于細(xì)胞黏附、增殖與成骨分化檢測(cè)。觀察MC3T3-E1細(xì)胞在PHA組與FPHA組壓片表面黏附形態(tài)、MC3T3-E1細(xì)胞在PHA與FPHA組壓片表面增殖情況、MC3T3-E1細(xì)胞在PHA與FPHA組壓片成骨相關(guān)基因表達(dá)。

1.3 MC3T3-E1細(xì)胞在PHA與FPHA壓片表面黏附形態(tài)觀察 取懸浮于50 μl培養(yǎng)基中約5×104個(gè)細(xì)胞接種于各壓片表面，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置30 min，待細(xì)胞貼壁后每孔加入250 μl培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。分別于接種后4 h與24 h后棄培養(yǎng)基，2.5%電鏡專用戊二醛固定2 h，PBS漂洗3次后，酒精梯度脫水（30%、50%、70%、90%、100%），15 min/次，丙酮置換酒精30 min，醋酸異戊酯置換丙酮30 min，CO2臨界點(diǎn)干燥，噴金鍍膜后通過掃描電鏡（FEI，Quanta 200，荷蘭）觀察MC3T3-E1細(xì)胞在PHA與FPHA壓片表面的黏附形態(tài)。

1.4 CCK-8評(píng)估MC3T3-E1細(xì)胞在PHA與FPHA壓片表面增殖情況 將PHA及FPHA壓片放入48孔板中，表面加入500 μl培養(yǎng)基預(yù)浸泡24 h后吸出，取懸浮于50 μl培養(yǎng)基中約2×104個(gè)細(xì)胞接種于各壓片表面，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置30 min，待細(xì)胞貼壁后每孔加入250 μl培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞接種1、3、5、7 d后吸盡原培養(yǎng)基，每孔加入300 μl新鮮培養(yǎng)基與30 μl CCK8試劑（DOJINDO，同仁化學(xué)研究所，日本），避光孵育60 min后每孔取100 μl加入96孔板。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光密度值（OD值），OD值即代表增殖的相對(duì)細(xì)胞數(shù)量。

1.5 RT-PCR檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞在PHA與FPHA壓片成骨相關(guān)基因表達(dá) 將MC3T3-E1細(xì)胞分別接種在PHA與FPHA壓片3、7 d，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因ALP、BGLAP、OPN的表達(dá)水平：為了提取足夠數(shù)量的總RNA，每組中5個(gè)壓片為1個(gè)樣本，通過Trizol（Invitrogen，美國(guó)）進(jìn)行總RNA的提取；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa BIOINC，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。通過ABI 750（ABI，美國(guó)）熒光定量PCR儀檢測(cè)ALP、BGLAP、OPN基因表達(dá)水平，內(nèi)參為GAPDH。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理本研究數(shù)據(jù)，進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本資料t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組MC3T3-E1細(xì)胞黏附形態(tài) PHA組與FPHA組細(xì)胞正常黏附生長(zhǎng)，24 h細(xì)胞充分延展，呈多邊形，伸出大量偽足與材料緊密粘附，并可見細(xì)胞間相互連接，見圖1。

2.2 兩組MC3T3-E1細(xì)胞增殖情況 兩組細(xì)胞接種1 d后OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；FPHA組接種3、5 d后OD值優(yōu)于PHA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組細(xì)胞接種7 d后OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2。

2.3 兩組MC3T3-E1細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá) FPHA組細(xì)胞接種3、7 d后ALP、BGLAP mRNA表達(dá)水平均高于PHA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組細(xì)胞接種7 d后材料表面細(xì)胞ALP與BGLAP mRNA表達(dá)水平均高于細(xì)胞接種3 d后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組細(xì)胞接種3、7 d后OPN mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖3。

3 討論

從來源上看，HA可分為化學(xué)合成羥基磷灰石與生物骨來源羥基磷灰石（BHA）兩類，后者是指由動(dòng)物骨組織經(jīng)物理和（或）化學(xué)手段去除有機(jī)物后制備獲得[3]。牛骨來源的羥基磷灰石已在局部頜骨缺損修復(fù)中廣為應(yīng)用，如口腔種植修復(fù)治療中的上頜竇提升、拔牙位點(diǎn)保存、種植位點(diǎn)增加骨量等。在用于制備BHA的生物供體當(dāng)中，豬骨與人骨的成分相似度高，有其他動(dòng)物骨無法相比的天然多孔結(jié)構(gòu)，本研究制備豬骨來源PHA、FPHA并研究其生物學(xué)性能，探索一種新的骨替代材料。

細(xì)胞黏附是生物材料與生物體相互作用的第一階段，對(duì)隨后的遷移、增殖、分化非常關(guān)鍵，更快的黏附可通過競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制減少細(xì)菌感染的機(jī)會(huì)，材料的理化性影響細(xì)胞的早期黏附，包括材料親水性、表面粗糙度、孔隙率等。粗糙的表面具有更高的表面能，較表面能低的表面更有利于細(xì)胞的黏附和延展[5]，本實(shí)驗(yàn)中制備的PHA、FPHA組壓片在掃描電鏡下顯示出多孔隙的粗糙表面，MC3T3-E1細(xì)胞在接種至材料表面2 h后呈現(xiàn)良好的黏附狀態(tài)，提示兩種材料均有良好的細(xì)胞相容性。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，兩組細(xì)胞接種1 d后OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），根據(jù)MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特征，在接種24 h內(nèi)為黏附及緊密結(jié)合過程，其后進(jìn)入早期增殖，細(xì)胞倍增周期為2～3 d，且實(shí)驗(yàn)操作中兩種材料接種細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)，黏附時(shí)間一致，本研究認(rèn)為此階段兩種材料對(duì)細(xì)胞增殖的影響尚不明顯；FPHA組接種3、5 d后OD值優(yōu)于PHA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明FPHA組細(xì)胞增殖較PHA組快，分析其原因?yàn)镕PHA組釋放氟離子促進(jìn)了細(xì)胞增殖。兩組細(xì)胞接種7 d后OD值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），考慮是由于壓片容納細(xì)胞數(shù)量有限，細(xì)胞融合達(dá)到80%以上后出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制。回顧有關(guān)氟離子研究的相關(guān)文獻(xiàn)，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為低濃度的氟離子對(duì)成骨有促進(jìn)作用，高濃度的氟抑制成骨[6]。本實(shí)驗(yàn)在制備條件中氟濃度為0.25 mol/L，制得材料在細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中被證明有良好的細(xì)胞相容性，在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中此氟濃度可促進(jìn)細(xì)胞增殖。細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因檢測(cè)中，F(xiàn)PHA組細(xì)胞接種3、7 d后ALP、BGLAP mRNA表達(dá)水平均高于PHA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。堿性磷酸酶是一組膜結(jié)合蛋白，在堿性環(huán)境中可以水解為一系列單磷酸酯，具有轉(zhuǎn)磷酸基的作用。與成骨分化相關(guān)的ALP是一種細(xì)胞外酶，通過水解有機(jī)磷酸酯為細(xì)胞外基質(zhì)礦化過程中磷灰石的沉積提供足夠的磷酸根，因此在體外鈣化過程中起著決定性的作用，ALP是細(xì)胞成骨分化的重要早期標(biāo)志。骨鈣素是一種由成骨細(xì)胞產(chǎn)生的非膠原蛋白激素[7]，因此常被用作骨形成過程的標(biāo)志物。在許多研究中，BGLAP被用作判斷給定藥物促進(jìn)骨形成能力的生物標(biāo)志物[8]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示氟植入材料能促進(jìn)表面細(xì)胞的早期成骨分化。

綜上所述，PHA與FPHA均具有良好的細(xì)胞相容性，MC3T3-E1能在兩種材料表面黏附生長(zhǎng)。氟離子植入豬骨羥基磷灰石可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖與早期成骨分化。

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編輯 胡錦英