鱗翅目昆蟲生物鐘的研究進展與展望

全林發，姚 瓊，董易之，徐 淑，池艷艷，陳炳旭

（廣東省農業科學院植物保護研究所/農業農村部華南果蔬綠色防控重點實驗室/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640）

0 引言

地球自轉和公轉產生光、溫可預測的周期性變化，生物長期適應晝夜光溫變化及四季輪換而演化出內在自主計時機制——生物鐘(circadian clock)。幾乎所有的生物，包括細菌、真菌、植物和后生動物，都維持內源性的24 h計時制[1]。生物鐘賦予昆蟲預測時間和外界環境變化（如光照或溫度）的能力，以協調代謝、生理、行為等生命過程與環境信號的同步，減少不必要的物質和能量消耗，極大地增強自身生存和競爭能力[2]。

在昆蟲中，生物鐘可調控其卵孵化、化蛹、成蟲羽化、成蟲運動、交配、取食行為節律及生理代謝活動等。1971 年，Konopka 等[3]在黑腹果蠅Drosophila melanogaster發現了第一個生物鐘基因Period(Per)，自此黑腹果蠅也成為了研究昆蟲生物鐘分子遺傳機制的典范，同時推動了鱗翅目昆蟲分子生物鐘的研究。鱗翅目昆蟲包括蝴蝶和飛蛾大約有16萬種，是當前物種最豐富的昆蟲群體，其中大部分具有夜行性（約占所鑒定種類的75%～85%），其余15%～25%屬于日出型種類[4]。鱗翅目昆蟲在生態系統中扮演著傳粉者和獵物的重要角色，已知的主要農林害蟲近70%屬于鱗翅目，其幼蟲部分以糧食作物為食，對經濟和全球糧食安全有著重大影響。此外，一些體型較大的鱗翅目物種已成為研究昆蟲發育、生理學、生態學和進化等生物現象的典范[5]。Williams[6]和Truman等[7]以鱗翅目昆蟲為基礎的開創性研究首次證實了昆蟲晝夜節律主時鐘存在于大腦，該成果極大推動了鱗翅目昆蟲時間生物學學科的發展。

目前，從事鱗翅目昆蟲生物鐘研究的科學家以帝王蝶Danaus plexippus與鱗翅目模式昆蟲家蠶Bombyx mori為主要對象，初步建立了鱗翅目昆蟲生物鐘分子調控模型，即生物鐘基因的轉錄-翻譯反饋環路(transcription-translation feedback loops,TTFLs)[2]。近些年來，鱗翅目昆蟲生物鐘的研究也漸漸拓展到其他非模式農林害蟲生長發育與行為調控、生理解毒代謝與防治等領域，對深入了解鱗翅目昆蟲豐富多變的生理行為調控機制，有效開展鱗翅目經濟昆蟲的生產及農林害蟲防治具有重大意義。本研究總結了晝夜節律生物鐘對鱗翅目昆蟲孵化與取食、生長與變態、生殖與滯育、求偶與遷徙等生理行為的影響，重點概述了鱗翅目昆蟲生物鐘分子調控機制、生物鐘與內分泌激素協同調控機制等重要研究進展，并基于生物鐘原理探討了鱗翅目昆蟲與植物協同進化關系及重要生態意義，最后展望了將生物鐘理論應用于農業害蟲防治和經濟昆蟲飼養改良的應用前景。

1 鱗翅目昆蟲生理行為生物鐘

1.1 生物鐘與鱗翅目昆蟲發育和變態

鱗翅目昆蟲屬于完全變態昆蟲，個體發育經過卵、幼蟲、蛹和成蟲4 個不同的蟲態。生物鐘系統在鱗翅目昆蟲卵孵化、幼蟲蛻皮生長、化蛹和羽化整個發育歷程中起到不可或缺的調節作用。昆蟲卵孵化是最早被描述的生物鐘事件[2]。在棉鈴蟲Helicoverpa armigera、柞蠶Antheraea pernyi、玉米螟Ostrinia nubilalis等鱗翅目昆蟲中，卵孵化節律受環境光或溫度刺激誘發，這種節律屬于內源性的生物鐘節律，在轉入持續黑暗后仍能維持。許多鱗翅目昆蟲成蟲羽化也具有明顯晝夜節律性，如蠶蛾總科，夜蛾科，螟蛾科和鳳蝶科等。而成蟲的羽化節律不僅受光照影響，還具有一定溫度補償效應，同時會受飲食和營養元素的影響[8]。此外，鱗翅目昆蟲滯育是研究昆蟲感應光周期變化的典范。昆蟲滯育發生與內源生物鐘息息相關。目前鱗翅目昆蟲滯育生物鐘研究主要集中在蛹或卵滯育發生前的誘導階段(diapause induction)。其中家蠶卵滯育研究最為深入，其卵滯育發生在受精核15次分裂的階段，并受親代胚胎發育后及胚后發育期生物鐘授時因子（光照、溫度等）的誘導[9]。對于蛹滯育的昆蟲，蛹滯育誘導取決于暗期的長短，在暗期介入光照中斷后會降低蛹滯育誘導的效果，在二化螟Chilo suppressalis、玉米螟、環帶錦斑蛾Pseudopidorus fasci、黑紋粉蝶Pieris melete等研究中均得以證明[2]。除此之外，有研究認為鱗翅目昆蟲其他時期發育同樣受生物鐘系統和光周期的影響[2]。

1.2 生物鐘對鱗翅目昆蟲生殖的影響

早期，鱗翅目昆蟲生物鐘研究著眼于生殖行為及生理方面，包括成蟲交配行為、性信息素(pheromone)分泌與響應等。鱗翅目成蟲交配由生物鐘調控，交配前雌蛾求偶鳴叫，并通過尾部性腺節律性合成和釋放性信息素，雄蛾則同步響應雌蛾性信息素，從而產生晝夜節律性的交配行為。例如：黃地老虎Agrotis segetum成蟲交配行為受信息素生物合成激活肽(Pheromone biosynthesis activating neuropeptide,PBAN)調節，并由中樞生物鐘系統控制[10]。灰翅夜蛾Spodoptera littoralis成蟲成功交配的重要前提是兩性生殖行為的節律同步，否則交配率會降低[11]。二點織螟Aphomia sabella雌蛾會周期性分泌6種性信息素類似物，且對雄蛾具有引誘活性[12]。此外，許多蛾類雄蟲精子由睪丸釋放到上層輸精管的過程具有明顯晝夜節律，如蘋果小卷蛾Cydia pomonella和灰翅夜蛾等[7,13-14]。在灰翅夜蛾中，雄蛾睪丸中卵黃原蛋白釋放與分子震蕩器有關，其中Per基因沉默使得精子釋放節律異常，進而影響卵受精[15]。除此之外，部分鱗翅目昆蟲的精子活力也存在節律性變化。

1.3 生物鐘與鱗翅目昆蟲求偶及其他行為

鱗翅目昆蟲求偶行為(courtship behavior)是生物鐘行為學研究中非常豐富的部分。在許多夜蛾科、螟蛾科、天蛾科等鱗翅目昆蟲中，均發現其節律性求偶行為[2]。近年來，鱗翅目幼蟲周期性取食行為(feeding behavior)研究對于昆蟲生產和害蟲控制具有重要意義。鱗翅目幼蟲主要以植物組織為食，隨著齡期增加幼蟲食量往往大增，最新研究表明夜蛾科的斜紋夜蛾和灰翅夜蛾末齡幼蟲取食行為存在明顯的晝夜節律性，而部分鱗翅目昆蟲取食花蜜（或花粉）或訪花行為也受生物鐘系統的影響[14]。另外，帝王蝶Danaus plexippus通過自帶的時間補償-太陽羅盤精準定位并達到遷徙目的是鱗翅目昆蟲經典的生物鐘行為學案例[16]。除此之外，鱗翅目幼蟲排泄、清理腸道等自由運動節律事件也有報道[17-18]。

2 鱗翅目昆蟲生物鐘分子調控機制

2.1 鱗翅目昆蟲信號轉導的核心生物鐘基因

目前，鱗翅目昆蟲生物鐘基因的克隆和鑒定相關的報道不算多，最早在家蠶和帝王蝶中生物鐘研究中開展，主要包括周期蛋白基因(Period，Per)、永恒蛋白基因(Timeless，Tim)和2 個隱花色素基因(Cryptochrome，Cry1和Cry2)、周期循環蛋白基因(Cycle，Cyc)和時鐘蛋白基因(Clock，Clk)等核心生物鐘基因。隨后，人們又分別在鱗翅目天蛾科柞蠶[19]；夜蛾科灰翅夜蛾[20]、粘蟲Pseudaletia unipuncta[13]、斜紋夜蛾Spodoptera litura[21]、甜菜夜蛾Spodoptera exigua[22]、黃地老虎[10]、東方粘蟲Mythimna separata[23]，以及卷葉蛾科蘋果蠹蛾Cydia pomonella[24]和梨小食心蟲Grapholita molesta[25]中鑒定出上述核心生物鐘基因。近期，雙時蛋白基因(Doubletime，Dbt)在斜紋夜蛾[21]和棉鈴蟲[26]中被鑒定；旋轉蛋白基因(Vrille，Vri)在斜紋夜蛾[17]中被鑒定；最新發現的核心鐘基因(Clockwork orange，Cwo)也在棉鈴蟲[27]和斜紋夜蛾[18]中被鑒定。這些核心生物鐘基因的克隆和鑒定結果為闡明鱗翅目昆蟲生物鐘分子機制研究奠定了基礎。

2.2 鱗翅目昆蟲的生物鐘分子調控信號路徑

昆蟲周期性節律特征通常由中樞和外周組織、信號輸入和節律輸出等成分構成的調控系統來產生和維持。其中以溫度和光照為代表的環境信號可借助輸入途徑傳遞到中樞生物鐘系統，經過處理、整合后經輸出系統將節律信號傳遞出去，或聯結外周生物鐘系統共同調節并維持機體的正常生理活動[21]。

對于昆蟲目而言，生物鐘研究最早起源于模式生物果蠅晝夜節律的探索，而后逐漸拓展到各種非模式昆蟲。在果蠅中，生物鐘調節系統是由一系列生物鐘基因構成的至少3 個相互依賴的轉錄-翻譯反饋環路(transcription-translation feedback loops,TTFLs)（圖1A）。第1個TTFL中，PER/TIM蛋白在細胞質中形成二聚體，夜間轉移至細胞核，抑制CLK/CYC的轉錄活性，從而抑制自身的轉錄。第2 個TTFL 中，PDP1ε是Clk基因轉錄的激活物，VRI 與PDP1ε競爭P/V-box 結合位點，抑制或去抑制Clk基因的轉錄。第3 個TTFL中，Cwo基因與CLK/CYC的靶標E-box元件特異性結合而抑制CLK/CYC 介導的轉錄活性，抑制自身轉錄和Pdp1ε、Vri、Tim和Per等基因的轉錄。上述TTFLs中的基因被轉錄、翻譯為蛋白質，隨后累積至觸發轉錄關閉的閾值，此模型是昆蟲生物鐘研究的基礎。與果蠅的TTFLs 有所不同，鱗翅目昆蟲由于進化出2 種類型的CRY，一是與果蠅dCRY 同源光敏感CRY1，另一個是與脊椎動物類似的光不敏感CRY2，從而演化出不同于果蠅的新TTFL（圖1B）。在帝王蝶季節性遷徙機制研究中發現，DpCRY1 能夠介導DpN1 胚胎細胞系中DpTIM降解[28-29]。在DpN1胚胎細胞系和大腦中，DpCRY2 與DpPER 和DpTIM 相互作用，共同抑制DpCLK:DpBMAL1介導的轉錄活性[30-31]。由此衍生了以帝王蝶為代表的鱗翅目昆蟲分子生物鐘環路模型。在新的TTFL中，CRY一旦接受光照，便引起TIM磷酸化，使得PER/TIM/CRY2三聚體降解，然后CRY2:PER二聚體結合到CLK和BMAL1的E-BOX上，從而調節Cry2、Per和Tim等基因的表達，進而產生相應的節律變化，其中CRY2 主要起到轉錄抑制的作用[29,32]（圖1B）。這一環路模型在帝王蝶Cry2和Clk基因敲除等試驗中得到了驗證[33-35]。隨后，人們基于果蠅核心生物鐘元件同源序列比對與分析，對帝王蝶和秋尺蛾Operophtera brumata基因組進行組裝與鑒定，逐步推測整合出鱗翅目昆蟲分子生物鐘的第2 和第3 個TTFL[32,36]（圖1B）。在第2個TTFL中，CLK:BMAL1復合體誘導Vri和Pdp1 基因轉錄，這2 個基因一旦被翻譯，就會競爭結合VP-box 位點，從而抑制Clk基因轉錄[35]。第3 個TTFL 中，CLK:BMAL1 二聚體激活Cwo基因轉錄，CWO 進入細胞核，通過與時鐘基因E-box元件結合，抑制CLK：BMAL1 的活性。其中光在CRY1 和JET 介導的TIM 降解過程中起重要作用，但在鱗翅目昆蟲中引發CRY2降解的途徑仍然未知。此外，由DBT，CK2 和SGG 介導的磷酸化可調節生物鐘蛋白的活性、蛋白互作、核易位和降解等途徑。上述鱗翅目昆蟲3個TTFLs模式圖的繪制為進一步研究鱗翅目昆蟲生物鐘調控機制奠定了理論基礎。

圖1 昆蟲生物鐘基因的轉錄-翻譯反饋模型[14]

2.3 鱗翅目昆蟲發育與變態生物鐘分子作用機制

目前，揭示鱗翅目昆蟲發育過程中的“守時”奧秘方興未艾，而探明該過程中分子作用機理對于理解昆蟲發育與變態進程具有重要生物學意義。從胚胎發育中期開始，卵孵化節律便受內源生物鐘調控。柞蠶腦移植實驗最早證明，控制卵孵化節律的生物鐘基因存在于大腦中[19]。近期研究發現，在正常光周期(LD)和持續黑暗(DD)條件下，家蠶胚胎中Per、Tim、Cry和Clk基因表達隨時間節律性震蕩，其中Tim和Per參與卵孵化晝夜節律的信號輸出，且Per在此過程中起到負反饋調節作用[37-39]。然而，Per和Tim基因在鱗翅目昆蟲生物鐘行為中的負反饋調節作用仍存在一定爭議。近期研究發現，家蠶Per基因敲除后試蟲出現羽化規律紊亂的現象[38]。類似的，梨小食心蟲Per和Tim基因表達干涉后對其成蟲羽化節律有顯著影響[25]。上述結果為進一步探明Per和Tim基因在鱗翅目昆蟲晝夜節律調控中的作用機制提供了理論基礎。

除昆蟲大腦外，在鱗翅目昆蟲頭部、中腸、脂肪體和腺體等組織中的外周生物鐘(peripheral clocks)基因也參與調控整個發育歷程。人們首先在柞蠶脂肪體細胞質中檢測到非循環的PER染色[40]。在幼蟲發育過程中，部分幼蟲組織同時表達多個鐘基因。例如，在家蠶末齡幼蟲的頭部、中腸、脂肪體和絲腺中Tim、Per、Clk和Bmal1 生物鐘基因轉錄活躍，且表現出不同日節律變化[14]。同樣，不同鐘基因在斜紋夜蛾末齡幼蟲中，頭部、中腸和脂肪體中也存在節律性表達特性。在全黑暗條件下，斜紋夜蛾幼蟲頭部Cwo、Bmal1 和Clk基因表達仍維持節律震蕩，但Per和Tim基因日表達節律喪失[18]。由此推測，斜紋夜蛾幼蟲沒有一個完全成熟且獨立于Per和Tim的具有自我持續振蕩功能的晝夜節律生物鐘。另有研究表明，其他獨立于Per或Tim基因調控機制也能維持幼蟲發育階段的內源性計時系統，例如斜紋夜蛾幼蟲從5 齡開始就表現出進食、排便和運動行為的晝夜節律[18]。類似的，灰翅夜蛾脂肪體中運行著一個獨立于大腦中樞生物鐘的外周生物鐘系統[20]。然而，目前關于鱗翅目昆蟲外周生物鐘與中樞生物鐘(central clocks)的協同互作機制仍待進一步挖掘明晰，以期進一步理解生物鐘對昆蟲生理行為節律的調控作用及昆蟲-環境進化關系。

3 鱗翅目昆蟲生物鐘與內分泌激素協同調控機制

生理時鐘和內分泌系統在生理和行為上的協同調控是一個令人著迷而又困惑的課題，近年來備受關注。研究表明，生物鐘調節機體的代謝和內分泌系統，使機體適應環境溫度、光照和食物[41-43]。這是由一系列轉錄因子通過轉錄-翻譯反饋環(TTFLs)和內分泌激素的相互調節而介導的[44-46]。其中昆蟲滯育是一個受生物鐘和內分泌系統共同調控的經典而長期備受關注的課題。

在蠶業和昆蟲學領域，溫度和光誘導的滯育機制與滯育激素(Diapause hormone,DH)協同調控機制是一個持續了100多年的話題。在許多成蟲滯育的昆蟲中，晝夜節律系統的紊亂會影響滯育的發生，然而關于生物鐘與內分泌激素調控的分子調控機制的研究仍缺乏深入報道。家蠶是鱗翅目昆蟲唯一的模式昆蟲，其滯育是研究光、溫兩大授時因子協同作用機制的理想狀態。近期，Ikeda 等[47]利用TALEN 技術構建了一個家蠶生物鐘基因Per敲除的突變體，并證明了敲除Per基因可破壞家蠶晝夜行為節律和時鐘基因的時序表達模式，進而影響光周期對家蠶胚胎滯育誘導的調控作用。Cui 等[48]研究表明，家蠶生物鐘基因Per敲除后，試蟲生物鐘系統TTFLs受損，在蛹期通過轉錄調控因子Cyc基因直接上調GABA受體GRD亞基的表達，增加GABA的合成并限制其分解，不斷促進GABA-ergic信號發揮作用，最終抑制（延遲）DH 的釋放，降低DH的滯育誘導作用。這項研究證實了Per基因敲除后改變了家蠶典型的溫度和光周期依賴的滯育決定，并通過GABA-DH 神經遞質-內分泌激素途徑影響蛹期滯育發生，并表明了GABA受體GRD亞基由家蠶的生物鐘和內分泌系統共同控制。該結果為解釋家蠶生理時鐘對內分泌激素的調節機制提供了一個實例。

4 鱗翅目昆蟲-植物生物鐘系統的協同進化

在昆蟲-植物長期互作的進化史中，植物逐漸演化出躲避昆蟲侵害的防御策略，同時吸引鱗翅目成蟲傳粉者；相對應的，幼蟲演變出躲避或適應植物防御系統的機制，成蟲則進化出了高效獲取食料的結構[14]。在這個生存游戲中，植物和鱗翅目昆蟲的生物鐘系統似乎在控制不同活動/生理現象的時序上發揮了重要作用。

在植物-昆蟲協同進化研究中，兩者在生態學和進化上建立一種有效的互惠關系，而植物-昆蟲生物鐘的同步性是互惠共存的基礎。例如，矮牽牛花Petunia axillaris氣味釋放與煙草天蛾觸角感知花香信號而啟動的飛行活動表現出高度同步性，從而確保了成蟲高效獲取蜜源及傳粉（圖2A）[49-50]。此外，植物-昆蟲生物鐘系統一方面會增強植物對害蟲晝夜攻擊的抵抗力，另一方面又會促使昆蟲進化出躲避植物的生物鐘防御策略，即在24 h內的特定時段產生有毒物質（植物）和解毒酶（幼蟲）[14]。在模式植物擬南芥-粉紋夜蛾Trichoplusia ni互作研究中，擬南芥通過生物鐘介導茉莉酸積累的模式與取食行為節律一致以抑制害蟲取食活動（圖2B）[51]。而鱗翅目夜蛾科昆蟲為避免寄主植物防御策略演化出“白天代謝解毒，夜間取食”的節律性取食活動[18,20,51-52]。在斜紋夜幼蟲“取食-解毒代謝”研究中，幼蟲中腸和脂肪體中成簇的解毒基因在24 h內呈現出“白天高，晚上低”的震蕩表達，使得幼蟲對煙堿類殺蟲劑的敏感性呈現出時節性差異，其中Clk，Bmal1，Per和Cwo等鐘基因在其解毒基因震蕩表達調控中發揮重要作用（圖2C）[18]。由此可見，斜紋夜蛾生物鐘基因參與了自身對異生物質的解毒代謝調控，研究結果為進一步解析斜紋夜蛾晝夜習性和農藥耐受能力提供了理論基礎，同時為農藥噴施的時機選擇提供了參考，為夜蛾科害蟲精準防控開拓了新思路。例如，利用人工飼料飼養的煙草天蛾，其幼蟲取食晝夜節律的喪失目前被認為是一種有效降低自然寄主煙草Nicotiana attenuata晝夜防御機制負面影響的生存策略[14]。

圖2 鱗翅目昆蟲與植物相互作用的生物鐘調控事件

5 展望

近年來，生物鐘生物學研究一直是科學界備受矚目的前沿課題，其研究成果常常發表于Nature、Science和Cell等頂尖期刊。隨著時間的推移，生物鐘的研究愈加深入，揭示了越來越多的復雜機制，令人振奮的是，該領域漸漸重視多學科交叉滲透與協同，深入淺出地揭示自然生物“守時”的奧秘。然而，與現存眾多的鱗翅目物種相比，人們對鱗翅目昆蟲生物鐘的研究微乎其微，尤其是農業害蟲生理行為的生物鐘調控機制及害蟲遺傳防治技術研究等方面。近期，鑒于生物鐘對鱗翅目昆蟲解毒和代謝等生理功能的調控作用，科學家們開始重視昆蟲時間毒理學的研究，以期將生物鐘理論應用于農業害蟲防治生產實踐，為促進農業害蟲綜合防控提供科學依據和新的有效抓手。近年來，鱗翅目昆蟲晝夜節律授時機制雖然取得了較大進展，但主要集中在核心生物鐘調控方面，對于普遍存在于其他組織中的外周生物鐘研究還非常有限，外周生物鐘的調控機制及其與中樞生物鐘系統的互作機制研究將是生物鐘研究的重要發展方向。另外，生理時鐘和內分泌系統在生理行為上的協同調控仍是一個耐人尋味的話題，而目前家蠶滯育的生物鐘-內分泌激素協同調控機制研究成果為昆蟲滯育的研究開辟了新思路。

生物鐘除了陚予生物對環境的適應能力外，同時也能對環境與生態產生重要影響[53]。迄今為止，許多研究已道明了昆蟲生物鐘系統的重要生態學意義。在自然界中，鱗翅目昆蟲生物鐘系統不僅是維持個體正常生命活動的關鍵，同時通過植物-昆蟲長期的“攻守”互作而協同進化，進而影響整個生態系統物種多樣性的發展。近期，基于生物鐘系統的昆蟲-植物互作機理研究為闡明植物防御與昆蟲反防御的內在調控機制提供了新的線索和研究方向。不難預測，下一代組學和基因組編輯技術的蓬勃發展將極大促進模式昆蟲和非模型昆蟲時間生物學的研究和應用，進一步加深人們對生物環境適應與進化途徑的理解。此外，家蠶作為最早實現人工馴化和飼養的經濟昆蟲，同時是后基因組時代用作功能基因分析的重要鱗翅目模式昆蟲[54]，近年來基于ZFN、EEN、TALEN 及CRISPR/Cas9 系統介導的基因組靶向編輯技術的快速發展，使得家蠶基因組靶向編輯技術的研究和應用取得了一系列重要進展[38-39,47]。不難預見，利用家蠶基因組靶向編輯技術，將有望促進蠶絲遺傳改良、絲腺生物反應器開發等產業瓶頸問題的突破[55]。