中國市售食品接觸硅膠制品的細胞毒性評價

郭一凡，張京偉，范曉潔，王文娟，封棣

中國市售食品接觸硅膠制品的細胞毒性評價

郭一凡，張京偉，范曉潔，王文娟，封棣*

（北京工商大學 輕工科學技術學院，北京 100048）

為了研究不同細胞毒性測試方法之間的差別，本研究利用不同體外細胞毒性評價測試體系下的食品接觸硅膠制品（Food Contact Silicone Products, FCSPs）的整體安全性進行研究。樣品在體積分數為95%的乙醇中模擬遷移（70℃保持2 h）后，通過系統優化實驗條件，發展了FCSPs遷移液的細胞毒性評價方法。利用HeLa（子宮頸癌細胞）-NRU、HeLa-CCK-8（CellCountingKit-8，CCK-8）、HepG2（Human Hepatoblastoma）-NRU、HepG2-CCK-8共4種測試體系對中國市售的19種FCSPs進行了細胞毒性評價。樣品在不同測試體系下的細胞毒性結果不同，其中65%的樣品呈現中度毒性。FCSPs的整體生物安全性亟須關注并深入研究。本研究為食品接觸材料的體外生物測定提供了研究思路和科學依據。

食品接觸硅膠制品；模擬遷移；細胞毒性

食品接觸硅膠制品（Food Contact Silicone Products，FCSPs）指各種適用于預期與食品接觸或已接觸食品的由硅橡膠制成的制品。作為食品接觸材料（Food Contact Materials，FCMs）的一種，由于性能優良，FCSPs已廣泛用于人們的日常生活中，如模具、蒸盤/盒、杯、管、墊和密封件等。在與食品接觸過程中，其中的化學物質可遷移至食品中，從而給人體帶來安全風險。FCSPs在使用過程中化學物質遷移所引起的食品安全風險不容忽視。目前，FCSPs的安全性研究仍主要集中在一些高風險化學物質及其遷移的相關研究，如硅氧烷[1-4]、重金屬[5-6]、芳香烴[7]、N-甲基苯胺、N, N-二甲基苯胺、2,6-二叔丁基對甲苯酚及苯并噻唑等[8]。但是，由于受分離分析技術的制約，對硅膠制品中遷移物質的分析不可能是完整詳盡的，特別是非有意添加物質（Non Intentionally Added Substances，NIAS）來源復雜，且部分NIAS化學結構不明，使得對NIAS的識別和量化非常困難且耗時。此外，在與食品接觸過程中，終產品中的多種化合物可同時遷移，并共同作用于人體從而造成危害。因此，考慮到單一物質及其遷移的化學分析研究，無法評價終產品在使用過程中的整體安全性，亟須采用體外生物學評價對終產品的整體安全性進行研究。

近年來，作為化學分析的補充，FCMs的體外生物測定已被廣泛關注。體外生物測定法可以檢測出不能通過化學分析或定量結構-活性關系（Quantitative Structure-Activity Relationship，QSAR）預測FCMs的潛在毒性，能夠提供FCMs化學遷移（混合物）的實際危險和質量評估的綜合信息。其中，細胞毒性評價是FCMs體外生物測定的基本方法，也是遺傳毒性以及內分泌干擾活性等研究的先行實驗[9-10]。FCMs的細胞毒性評價方法可通過檢測不同的毒性途徑，如細胞通透性損傷和細胞增殖破壞等來進行，常見的方法有中性紅攝入（Neutral Red Uptake，NRU）測定、噻唑藍MTT或衍生物MTS測定、細胞中總蛋白質含量（Total Protein Content，TPC）測定、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridine，BrdU）摻入實驗等[11]，其中前2種是較為常用的方法。近年來，對FCMs的細胞毒性測定已被應用于塑料[12]、紙質[13]、罐頭涂層[14]、納米材料[15-16]等FCMs化學遷移物的毒性評價，但目前鮮見FCSPs遷移物的細胞毒性研究。

實驗室前期已經使用HeLa細胞-中性紅方法對FCSPs的細胞毒性進行了研究[17]，在此基礎上，本研究考察了不同細胞系、不同細胞毒性測試方法、不同樣品處理條件對細胞毒性的影響。通過系統優化實驗條件，發展了FCSPs的模擬遷移液的細胞毒性評價方法，并利用HeLa-NRU、HeLa-CCK-8、HepG2-NRU、HepG2-CCK-8共4種測試體系對中國市售的19種FCSPs進行了細胞毒性評價。

1 實驗

1.1 材料

測試材料：通過市場及電商購買了19種硅膠廚具（1號、4～7號、12號、15～18號為模具；2號、8～10號為蒸盤；3號為馬卡龍墊；11號為蒸盒；13和14號為刻度量杯；19號為伸縮杯）。

細胞株：人宮頸癌細胞株（HeLa）和人肝癌細胞株（HepG2），由中日友好醫院臨床研究所提供。

陽性對照材料為有機錫作穩定劑的聚氯乙烯；陰性對照材料為高密度聚乙烯。

1.2 主要試劑與耗材

主要試劑與耗材：無水乙醇、二甲基亞砜，均為分析純，北京化工廠；DMEM培養基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、磷酸鹽（Phosphate Buffered Saline，PBS）緩沖液（1x），北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（Trypsin）、青霉素/鏈霉素（Penicillin/Streptomycin），Hyclone公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS），北京四季青生物科技有限公司；中性紅細胞增殖及毒性試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8試劑盒，北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.3 儀器與設備

主要儀器與設備：Axiovert 200倒置顯微鏡，蔡司光學儀器上海國際貿易有限公司；細胞CO2培養箱，上海鄂禾儀器有限公司；ME104E電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；LMQ.C-100E高壓滅菌鍋，濟南存昌生物技術有限公司；TGL-2150低溫高速微量離心機，四川蜀科儀器有限公司；TTL-DC1水浴氮吹儀，禾緣天地儀器（北京）科技有限公司；BIOBASE2001型酶標儀，山東博科科學儀器有限公司；HY-4型振蕩器，常州市瑞華儀器制造有限公司。

2 生物學檢測

2.1 樣品處理

樣品遷移液的制備：樣品用超純水清洗、晾干、剪碎。準確稱取20 g（±0.001 g）樣品至50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL體積分數為95%的乙醇，蓋緊塞子并用封口膜密封，70 ℃下保持2 h，降至室溫后將遷移液轉移至氮吹管中使用高純氮氣將遷移液吹干，加入1 mL DMSO復溶制成測試液，將測試液保存于4 ℃冰箱，24 h內進行細胞毒性實驗。陰性和陽性對照樣品用上述相同方法進行處理。

2.2 細胞培養、種板與暴露

細胞培養：由體積分數為10%的胎牛血清、體積分數為1%的雙抗（青霉素和鏈霉素）、體積分數為89%的DMEM高糖培養液配制成完全培養基。細胞在CO2體積分數為5%和溫度為37 ℃的二氧化碳培養箱中培養。

細胞接種：選取顯微鏡下生長狀態良好的細胞，在超凈臺內經PBS緩沖液清洗、胰蛋白酶（質量濃度為0.25 g/mL）消化、離心后（1 800 r/min、5 min），棄上清，向離心管內加入適量完全培養基，充分吹打混勻，形成單細胞懸液；使用細胞計數板對細胞懸液進行計數，將密度調整到1×105個/mL，接種于96孔板中；設置空白對照組、陰性對照組、陽性對照組和實驗樣品組，每孔中加入100 μL細胞懸液，每組至少6孔；接種后的96孔板置于溫度為37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養24 h。

暴露：顯微鏡下觀察96孔板中細胞長勢，生長至70%～80%即可進行下一步操作。棄去孔中原培養液，空白對照組加入體積分數為1%的DMSO，陰性對照組加入高密度聚乙烯測試液，陽性對照組加入有機錫作穩定劑的聚氯乙烯測試液，實驗樣品組加入用培養基稀釋得到的200、100、50、25、12.5 mg/mL樣品測試液。每孔接種100 μL，混合均勻，放回培養箱繼續培養24 h。

2.3 細胞毒性實驗

NRU檢測：棄孔板中原培養液，用PBS洗滌細胞，隨后加入100 μL不含血清的DMEM細胞培養液，并加入10 μL中性紅染色液，在細胞培養箱內孵育；2 h后去除孔板中含有中性紅染液的細胞培養液，用PBS溶液洗滌細胞1～2次；加入100 μL中性紅檢測裂解液，在室溫下，放置于平板搖床上，裂解10 min后取出，全自動酶標儀檢測540 nm波長處的測吸光度。

CCK-8檢測：棄孔板中原培養液，參照CCK-8說明書進行實驗，96孔板每孔加入CCK-8和不含血清的DMEM培養液混合液100 μL（現配現用， CCK-8與DMEM的體積比為1∶9），放回培養箱繼續培養，2 h后取出，在450 nm波長處測吸光度。

2.3.1 細胞毒性評價

各組細胞進行其相對增殖率（Relative Growth Rate，RGR）的計算，RGR值為實驗組平均吸光度值與空白對照組吸光度值之比的百分數。根據相關標準[18]，RGR值對應的細胞毒性分級見表1。

表1 細胞毒性分級

2.4 數據處理及統計學分析

應用統計學軟件SPSS20.0進行數據統計處理，實驗結果用平均值±標準差表示，組間差異比較采用t檢驗，＜0.05表示數據有顯著性差異。應用GraphPad Prism 8軟件進行半抑制濃度（Half Maximal Inhibitory Concentration, IC50）計算。

3 結果與分析

3.1 FCSPs的模擬遷移條件

根據歐盟法規（EU）No 10/2011[19]規定，一般采用蒸餾水作為水性食品模擬物，將體積分數3%的乙酸作為酸性食品模擬物，體積分數95%的乙醇作為脂類食品模擬物，體積分數50%的乙醇作為乳類食品模擬物，模擬遷移的溫度與時間依據樣品實際使用溫度和時間設定。在本研究中，由于樣品種類豐富，檢測量大，且樣品形狀不規則、薄厚不均，比表面積差異較大，因此最終選擇相同質量的樣品進行測試?？紤]到“最嚴苛的使用條件（脂類食品接觸）”和后續生物學實驗檢測相容性，最終選擇體積分數95%的乙醇作為本研究的食品模擬液。此外，根據法規和文獻，選擇70 ℃持續2 h作為加速模擬的遷移條件[3]。

3.2 不同處理條件對細胞毒性的影響

盡管近年來FCMs的細胞毒性研究越來越多，但FCMs的細胞毒性評價尚無標準可依。不同的實驗條件可能導致不同的實驗結果。因此，本研究考察了1號樣品的料液比（制品與食品模擬液用量比例）、濃縮程度（氮吹至1 mL和氮吹至干）、復溶介質（DMSO和體積分數為95%的乙醇）、暴露時間（12、24、48 h）等不同處理條件對HeLa細胞RGR值的影響（NRU檢測）。

3.2.1 遷移比例對細胞毒性的影響

盡管歐盟法規（EU）No 10/2011[19]規定在進行FCMs化學遷移研究時采用6 dm2材料接觸1 kg的食品或食品模擬物，但在FCMs的細胞毒性研究中，采用的遷移比例不盡相同。如Binderup等[20]用150 mL體積分數為99%的乙醇回流提取5 g食品接觸用紙；Mittag等[14]將3 dm2罐頭涂層在200 mL體積分數為95%的乙醇中模擬遷移；也有將0.5 dm2的塑料片浸入100 mL食品模擬物中的遷移過程[21]。本實驗將20 g樣品及20 mL體積分數為95%的乙醇（模擬液沒過樣品的最小體積）設料液比（g/mL）為1∶1，考察3種料液比（g/mL）（1∶1、1∶2、1∶3）對細胞毒性的影響（圖1a）。結果表明，3種料液比對HeLa細胞的RGR值不存在顯著性差異，考慮實驗效率（減少后期大體積濃縮時間）和成本，最終選擇20 g樣品在20 mL體積分數為95%的乙醇中進行模擬遷移。

3.2.2 濃縮方式對細胞毒性的影響

已有研究中對進行細胞毒性實驗的FCMs遷移液濃縮處理方式不同，如將乙醇遷移液干燥后用DMSO復溶[14, 19]，或是乙醇提取液直接經過濃縮后上樣[13]。本研究探究了2種處理方式對細胞毒性的影響（圖1b），結果顯示，體積分數為95%的乙醇氮吹近干后加1 mL的DMSO復溶得到的RGR值顯著低于體積分數為95%的乙醇氮吹至1 mL上樣（＜0.01）的RGR值。這可能是由于DMSO比體積分數為95%的乙醇具有更好的溶解性，使得更多的物質作用于細胞而導致了更大的細胞毒性?？紤]到更極端的遷移情況對細胞毒性的影響，最終遷移液的濃縮方式選擇為氮吹至干，再加入1 mL的DMSO復溶。

3.2.3 復溶介質對細胞毒性的影響

體積分數為95%的乙醇和DMSO是FCMs細胞毒性實驗中的常用溶劑[13-14]，但細胞對兩者的耐受程度不同。本研究分別考察了體積分數為95%的乙醇和不同體積分數的DMSO（0、0.1%、0.25%、0.5%、1%、3%、5%、10%、20%）下對細胞毒性的影響（圖1c）。結果表明，乙醇體積分數為95%并且DMSO體積分數在0.5%以內時，對細胞無明顯影響。但是當DMSO體積分數超出0.5%時，隨著體積分數的不斷增加，RGR值逐漸呈下降趨勢，且當DMSO體積分數為1%時，RGR值出現顯著下降。DMSO體積分數在0.1%～1%時，細胞RGR值與對照組均無差異，但是當體積分數超出1%時，隨著濃度的增加，RGR值呈下降趨勢，且可以看到體積分數為3%時，RGR值出現顯著下降。這說明細胞對DMSO的耐受濃度比體積分數為95%的乙醇的耐受濃度高，因此最終選擇DMSO作為氮吹至干后的復溶介質，且進行后續細胞實驗時的濃度不大于1%。

3.2.4 暴露時間對細胞毒性的影響

根據已有研究[22]報道的細胞暴露時間，本次研究考察了不同暴露時間（12、24、48 h）對細胞的毒性影響（圖1d）。結果表明，在遷移液中暴露24 h和48 h對HeLa細胞RGR值無顯著性差異（＞0.05），這與Vlad-bubulact等[23]、Ezati等[24]的研究結果一致。根據已有標準[25]規定，細胞在遷移液中暴露24 h后可以確定細胞毒性反應。此外，也有研究發現，暴露于FCMs遷移液48 h后，細胞對中性紅攝取能力低于24 h[22]。本研究最終選擇細胞在遷移液中暴露24 h。

圖1 不同處理條件對細胞毒性的影響

注：*表示差異較顯著，＜0.05；**表示差異顯著，＜0.01；***表示與空白對照組相比差異極其顯著，＜0.001。

3.3 食品接觸硅膠制品遷移液的細胞毒性

分別利用NRU和CCK-8 2種測試方法，以及HeLa和HepG2 2種細胞構建了4種測試體系，即HeLa-NRU、HeLa-CCK-8、HepG2-NRU、HepG2-CCK-8，考察了19種FCSPs在不同質量濃度下（200、100、50、25、12.5 mg/mL）的細胞毒性。結果表明，4種測試體系中的陰性對照組RGR值大于80%，陽性對照組RGR值小于30%，說明測試體系均可靠。隨著樣品測試液濃度增大，其RGR值減小，細胞毒性增大，樣品在HeLa-NRU測試體系中呈現劑量-效應關系，如圖2中5號和7號樣品所示。

圖2 5號和7號樣品（遷移液）在不同質量濃度下對細胞毒性的影響

注：*表示與空白對照組相比差異顯著（＜0.05）；**表示與空白對照組相比差異極顯著（＜0.01）；***表示與空白對照組相比差異極其顯著（＜0.001）。

圖3展示了19種樣品在4種測試體系下的IC50值。由圖3可以看出，19種樣品遷移液在4種測試體系下的細胞毒性結果差異較大。圖4展示了19種樣品在最高上樣濃度（200 mg/mL）下，在4種測試體系得到的RGR值。

在HeLa-NRU測試體系下，19種樣品的IC50值為0.064（5號）～0.91 g/mL（15號），提示5號樣品（模具）的細胞毒性最大，19號樣品（伸縮杯）的細胞毒性最小。在200 mg/mL下，58%的樣品（1、2、8、12～19號）的RGR值在57%～75%時，為細胞毒性2級；42%的樣品（3～9、10、11號）的RGR值在27%～49%時，為細胞毒性3～4級。在HeLa-CCK-8測試體系下，10號樣品（蒸盤）的細胞毒性最強，IC50值為0.095 g/mL。26%的樣品（1、2、8、12、13號）的RGR值在55%～73%時，為細胞毒性2級；21%的樣品（3、9～11號）的RGR值在30%～48%時，為細胞毒性3級。

在HepG2-NRU測試體系下，19種樣品的IC50值為0.056（5號）～0.34 g/mL(16號），5號樣品（模具）細胞毒性最大，與HeLa-NRU測試體系結果相同。37%的樣品（3、8、12、16～19號）為細胞毒性2級，63%的樣品（1、2、4～7、9～11、13～15號）為細胞毒性3級。在HepG2-CCK-8測試體系下，19種樣品的細胞毒性最不敏感，IC50值為0.23 g/mL～8.21 g/mL，僅有3號樣品（5%）的RGR值為75%，為細胞毒性2級，其余均為1級?？偟膩碚f，19種FCSPs中有1種樣品（5號，模具）呈現重度毒性，12種樣品（63%）在至少一種測試體系下呈中度毒性。

圖3 19種FCSPs在不同測試體系下的 IC50值

在本研究中，使用同一細胞（HeLa或HepG2細胞）進行NRU和CCK-8測試，同一樣品在2種測試方法中結果不同，這與李雪等[26]的研究結果一致。造成該結果的原因是這2種細胞毒性實驗檢測的毒性指標的差異。MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需加入有機溶劑被溶解后才能檢測，增加了工作量，而且溶解甲瓚的有機溶劑會損害人體健康。而CCK-8法克服了MTT法檢測的不足之處，CCK-8試劑被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臜物，可直接進行測定，生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比[27]。NRU實驗是基于細胞對中性紅的攝入能力來檢測細胞增殖或細胞毒性的方法，主要對導致溶酶體破壞的細胞毒性反應靈敏[28-29]。Weyermann等[30]對這2種方法進行了比較，結果發現MTT比色法主要對影響線粒體酶活性的毒性反應敏感，NRU法主要對導致溶酶體破壞的細胞毒性反應靈敏。本研究結果表明，19種FCSPs無論是對HeLa細胞還是對HepG2細胞，NRU測試方法都比CCK-8測試方法更敏感。此外，在本研究中使用相同測試方法在HeLa和HepG2細胞中結果也不同，這可能是由于不同細胞對同一物質的耐受程度不同。已有報道指出不同的細胞毒性實驗可能得出不同的結果，這取決于選擇的受試系統和細胞毒性實驗，因此多種測試方法或體系聯用可以更全面地評價FCMs的細胞毒性[30]。評價毒性作用機理尚不明確待檢化合物時，應合理地選擇樣品濃度、細胞類型和檢測生物學終點的評價指標或評價方法，綜合評價FCMs遷移液混合物的毒性，以增加結果的可信度。

圖4 19種FCSPs的細胞毒性（200 mg/mL）

4 結語

作為化學分析的補充，體外生物檢測可以確定混合遷移物危害和質量評估的綜合信息。本文研究了不同測試體系下FCSPs細胞毒性的評價方法，為FCSPs以及其他FCMs的體外生物測定提供了研究思路和科學依據，為FCMs的安全評價體系提供重要的科學理論基礎。樣品在脂類食品模擬物（體積分數為95%的乙醇）中進行加速模擬遷移（70 ℃保持2 h）后，利用HeLa-NRU、HeLa-CCK-8、HepG2-NRU、HepG2-CCK-8共4種測試體系對中國市售的19種FCSPs進行了細胞毒性評價。結果表明，不同的測試方法和不同的細胞導致不同的細胞毒性結果。19種FCSPs中有13種（68%）在至少一種測試體系下呈中毒或重度毒性。推測FCSPs原料及添加劑中的重金屬、硅氧烷、增塑劑和潤滑劑等多種物質聯合作用共同導致細胞毒性，因此，相關的體外生物安全性評價還需深入研究?？傊?，本研究為食品接觸硅膠制品以及其他FCMs的生物安全性評價提供了研究思路和科學依據。

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Cytotoxicity Evaluation of Food Contact Silicone Products Marketed in China

GUO Yi-fan, ZHANG Jing-wei, FAN Xiao-jie, WANG Wen-juan, FENG Di*

(School of Light Industry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The work aims to study the overall safety of food contact silicone products (FCSPs) by different in vitro cytotoxicity evaluation and test systems to study the difference of different in vitro cytotoxicity test methods. After the samples were simulated in 95% ethanol at 70 ℃ for 2 h, the cytotoxicity evaluation method of FCSPs migration was developed by systematically optimizing the experimental conditions. Four test systems including HeLa-NRU, HeLa-CCK-8, HepG2-NRU and HepG2-CCK-8 were used to evaluate the cytotoxicity of 19 FCSPs marketed in China. The samples showed different cytotoxicity results under different testing systems. Among them, 65% of the samples showed moderate cytotoxicity. The overall biological safety of FCSPs needs urgent attention and in-depth study. This study provides research ideas and scientific basis for the in vitro bioassay of food contact materials.

food contact silicone products; simulated migration; cytotoxicity

TB487；TS206.4

A

1001-3563(2023)19-0042-08

10.19554/j.cnki.1001-3563.2023.19.006

2023-04-15

國家自然科學基金面上項目（31871722）

責任編輯：曾鈺嬋