以外泌體為藥物遞送載體的研究進展

楊艷萍,陳加偉,林聯君,張姍姍

(陜西服裝工程學院 健康學院,西安 712046)

外泌體是內涵體來源,經由多泡體(MVBs)與質膜融合以后釋放到細胞外的膜性囊泡狀小體,內部分布著多種生物學大分子,有蛋白質、核酸和磷脂等,具有豐富的生物學功能,可作為細胞間物質和信號通信的重要途徑。目前已知的多種疾病發展過程中,外泌體在參與機體的多種生理和病理發展過程中發揮著相應的作用,均可見其蹤影[1]。外泌體載體綜合了細胞藥物遞送與納米技術的優勢,作為一種具有天然特性的新型藥物遞送載體,擁有可以穿過機體生物屏障的特性,因此利用外泌體作為載體能將藥物有效且安全地遞送至人體機體各大系統,從而成為疾病治療中一種可行的有效途徑且前景極佳。

1 外泌體的結構組成及其功能特征

外泌體是由機體細胞分泌的一種具有生物膜特性的細胞外囊泡結構,粒徑30～150 nm,機體相關的細胞均可以分泌對應的細胞類型外泌體,直徑在30～150 nm的細胞外囊泡具有磷脂雙分子層結構,能攜帶蛋白質、核酸(例如miRNA、lncRNA等)、脂質等多種重要的生物信息。由細胞膜組成的胞外小泡(如外泌體)可通過一系列表面黏附蛋白和載體配體(四肽、整合素、CD11b和CD18受體)附著到靶細胞上,并將其有效載荷傳遞給靶細胞。一些研究表明[2],胞外小泡,如外泌體,根據其特性和來源具有特定的細胞向性,可用于靶向疾病組織或器官。外泌體的形成過程包括細胞膜內陷,形成內吞小體,多個內吞小體融合為早期核內體,而早期核內體再次內陷,形成多泡體,多泡體與細胞膜嵌套融合,最后將形成的外泌體釋放到細胞外[3]。

外泌體載體綜合了細胞藥物遞送和納米技術優勢,幾乎所有細胞都能主動分泌外泌體,這個過程由多種細胞因子介導,選擇性地將特定生物活性分子分選到外泌體中。已有研究表明,外泌體是細胞與細胞之間發揮通信作用的關鍵組成,不僅可通過其表面配體分子直接識別并接觸和激活相應的受體細胞,還可以通過內吞作用將“貨物”轉移到受體細胞,從而發揮細胞間信號轉導作用[1,4]。這個過程依賴于外泌體膜表面的蛋白信號分子,這些分子與靶細胞表面的特定分子通過受體配體結合,引發內吞或膜融合,將外泌體中攜帶的信息物質傳遞給靶細胞,進而改變靶細胞的生理狀態。

2 外泌體的分離提純及鑒定

2.1 外泌體的分離提純方法

截至目前,還沒有任何一種有效的方法能同時保證外泌體的含量、 純度、 生物活性[5]。當前的研究主要集中在外泌體作為治療靶標、藥物或基因載體及作為疾病標志物的應用。鑒定外泌體的方法主要是根據外泌體的生物學性狀如形態學觀察,結合其所含蛋白質及核酸等物質進行分析。常見的外泌體分離提純方[5-6]法如表1。

表1 外泌體分離提純方法比較Tab.1 Comparison of methods for the separation and purification of exosomes

2.2 外泌體的鑒定方法

2014年國際細胞外囊泡學會 (ISEV) 提出,對于體外分離獲取的外泌體需要從三個層面進行鑒定[7]:WB檢測外泌體標志蛋白的表達情況,即外泌體囊泡膜上含有能夠運輸外泌體的跨膜蛋白家族(CD63/CD81/CD9、熱休克蛋白家族(HSP60/HSP70/HSPA5/CCT2/HSP90)和一些細胞特異性蛋白。外泌體形態結構鑒定采用透射電子顯微鏡,電鏡具有較高的分辨率,可通過直接觀察樣品鑒定外泌體形態。外泌體粒徑和濃度采用納米顆粒示蹤分析檢測技術進行檢測。納米顆粒示蹤分析檢測技術可快速且能夠精準地分析出外泌體的粒徑大小及濃度。YU M 等[8]研究經阿伐他汀預處理后的骨髓間充質干細胞(BMSC)外泌體是否具有促血管生成能力時,對 BMSC來源的外泌體進行了鑒定,透射電鏡觀察到各組外泌體的典型球形、膜狀結構。WB分析顯示,分離的顆粒中均檢測到外泌體標志蛋白TSG101和CD81。NTA結果表明,Exos和ATV-Exos 均在大約 80～120 nm處顯示單峰。

3 外泌體載藥

3.1 外泌體的載藥類型

外泌體的天然屬性使其成為非常有潛力的藥物遞送載體,可用于遞送各種化學物質、蛋白質、核酸等。外泌體的載藥類型主要分為三大類,即藥物遞送系統(doxorubicin, paclitaxel, curcumin, temozolomide)、核酸遞送系統(siRNA, miRNA, mRNA, DNA plasmid)、蛋白遞送系統(catalases)[9]。

3.2 外泌體的載藥方式

目前,將藥物等小分子物質載入外泌體的方式主要有兩種,即內源性裝載(Pre-loading)和外源性裝載(post-loading)。

第一種是對親本細胞進行修飾,使其分泌的外泌體載有功能分子即內源性裝載(Pre-loading)。在生物發生過程中,親本細胞產生外泌體之前就可以把治療分子在外泌體生成過程中整合到外泌體內,讓細胞成為載藥外泌體的活工廠,直接生成想要的外泌體。內源裝載思路是:在產生外泌體的細胞上做文章,根據外泌體產生的過程對細胞進行適當改造(通常涉及蛋白/多肽的融合表達、基因藥物的過表達等),讓其產生攜帶目標分子的外泌體。但與外源裝載相比,內源裝載的實驗難度更大,周期更長。內源性外泌體裝載機制研究尚不完全清楚。Ran等[10]為了檢測外泌體作為前肽遞送載體的可行性,構建編碼前肽抑制域的融合蛋白,將其插入至外泌體跨膜CD63的第二細胞外環當中,使得前肽可表達在外泌體的表面,轉導表達前肽的慢病毒(CD63-propeptide-expressing lentivirus)進入小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3),生成表達前肽的外泌體(EXOpro),通過小鼠腹腔注射表達前肽的外泌體的特異性與野生型小鼠血清中成熟的肌生成抑制素相結合,從而發揮相應的治療作用。Choi等[11]設計兩種蛋白表達載體,構建可以穩定表達CIBN-EGFP-CD9 和srIκB-mCherry-CRY2兩種重組蛋白的細胞株,利用460 nm的藍光照射,誘導細胞主動將抗炎性蛋白裝載至外泌體中,從而進行可控的蛋白互作。EXPLOR系統的優勢:可輕松攜帶需要的重組蛋白,不需分離純化;經基因改造的細胞可簡單便捷的生產目的外泌體,在外泌體蛋白治療商業化中有巨大潛力;可與個性化治療兼容,生產根據患者定制的藥物遞送系統,從而減少宿主免疫反應。Fu等[12]基于體內自組裝外泌體siRNA的策略,實現了siRNA從表達到裝載再到遞送的全體內自動化過程,體外構建可表達siRNA的基因環路,靈活的實現多個siRNA和靶向肽段的插入。核心環路:不帶靶向標簽,用于系統性siRNA的遞送。自組裝環路:帶靶向標簽,用于靶向性siRNA的遞送。可編輯基因環路的優勢:以宿主自身組織細胞分泌的外泌體為載體,解決了以siRNA作為器官或者組織細胞遞送載體所帶來的各種問題,如免疫源性高和細胞或組織器官毒性高等問題,對基因環路的靈活編輯,可同時傳輸多個siRNA,對疾病進行多靶點打擊,特異性的靶向肽段可高效的將siRNA輸送到特定的組織,克服血腦屏障等生物屏障的制約。

第二種是對新分離提取到的高質量的外泌體進行修飾,即外源性裝載(post-loading)。相比內源裝載,外源裝載操作更簡單,批次間的穩定性更高,更適合放大化生產。在分離天然外泌體后,對收集到的外泌體進行相應的藥物裝載,分為多種不同的裝載方式,見表2。

表2 外泌體藥物裝載方式比較Tab.2 Comparison of exosomal drug loading method

已有研究證實,抗癌藥物如紫杉醇(PTX)[13]和阿霉素(DOX)[14]能夠通過成功載入外泌體,進而用于抗腫瘤治療。通過利用外泌體運送紫杉醇到對應的腫瘤部位進行抗腫瘤的研究中,由于間充質干細胞(MSC)可自主歸巢至腫瘤微環境且不通過基因操作就能運輸紫杉醇,有效的輸送紫杉醇且不破壞其生物活性,小泡溶液蛋白質濃度較低時就可誘導腫瘤細胞凋亡。在體外對癌細胞的抑制效果方面,這種方式的抑制效果與單純使用紫杉醇的效果相比基本一致。應用外泌體在體外成功運輸紫杉醇的案例成為外泌體運載抗癌藥物進行體內腫瘤治療的重要證據。姜黃素是一種黃色色素,主要提取于姜黃的根莖中,具有抵抗炎癥、促進腸胃蠕動、抵抗惡性細胞增殖、疏風散寒、抗氧化、抗血管生成及保護肝臟、提高肝臟解毒能力等功效。與紫杉醇和阿霉素的作用功效類似,姜黃素在臨床應用方面也存在著眾多問題,如較低的水溶性、體內代謝速度快,因此在機體能被快速清除。外泌體作為包載姜黃素[15]和大黃素[16]的載體,可以天然提高姜黃素和大黃素在機體水環境中的溶解性、穩定性和生物利用度等。

3.3 外泌體的載藥優勢

目前,外泌體作為一種極有價值的天然藥物遞送載體逐漸得到廣泛深入地開發和研究。傳統藥物往往因為水溶性差、生物相容性差、易被人體機體排除、向細胞內滲透的能力低和體內分布不均等眾多缺陷性問題限制了其在臨床上的廣泛應用。外泌體作為具有納米級別的天然外囊泡,相比其他傳統的藥物遞送系統具有顯著地優勢:①釋放到細胞外的外泌體可以作為細胞間的天然信號傳遞信使,發揮細胞間通訊(尤其是遠距離通訊)作用。外泌體具有良好的生物相容性、無毒且免疫原性低。而人工合成的納米載體如在機體經多次給藥后就可誘發機體適應性免疫應答反應,進而被機體內免疫系統快速清除,并可能激發異常的免疫應答如過敏反應等不良的相關事件發生[1,17]。②外泌體天然的“回巢”能力說明其在體內外藥物遞送中可能存在潛在應用價值。外泌體通過特異性識別并結合到相應細胞,是借助細胞膜表面的表達受體或細胞外基質中相關的結合蛋白等眾多信號分子共同作用的結果,最終不同細胞來源的外泌體進行定向性或趨向性的細胞遷移,能靶向到特定的組織和器官,攝取協同的藥物載體,同時保護攜帶的治療分子(如miRNA等),減少其在體內的降解。③外泌體作為脂質包裹的小囊泡,能夠快捷有效地穿過生物膜,包括血腦屏障、血氣屏障、濾過膜和細胞質膜等在內的各種生物屏障,實現藥物遞送[9,18]。當然,對外泌體的研究還可進行工程化改造等。

4 結論

近年來,在癌癥治療中,將抗癌類藥物運輸到達癌癥部位成為癌癥治療的關鍵技術問題,引起了各領域研究者們的眾多關注。藥物載體種類較多,但目前在研究中使用比較廣泛的有兩類,一是以聚合物作為載體,另一是以脂質體作為載體。而這些藥物載體依然存在著穩定性差、在血液中駐留時間短、易被機體免疫系統清除、藥物靶向性較低等問題。藥物的靶向遞送一直是治療機體各個系統疾病急需解決的關鍵問題之一,因此需要一種新的、安全的、有效的藥物遞送載體[9,19]。

外泌體以細胞分泌納米級的小泡在細胞與細胞間及細胞內部的信息交流過程中發揮著重要作用,并因在人體內廣泛分布能順利穿過細胞膜且不會引起機體細胞的免疫反應,這也是其能夠成為藥物載體的獨特優勢,成為運輸基因、抗腫瘤、抗炎等類藥物的新途徑。目前,在臨床疾病治療中,已有使用外泌體進行安全性治療的臨床結果[1,20],但對外泌體在靶向藥物遞送過程中許多環節涉及到的重要技術尚不清楚,還有重多難題需要解決。外泌體是如何攜載“貨物”遞送至機體各個系統,這一機制還有待進一步的闡明。應用外泌體載藥遞送技術治療臨床疾病,外泌體的提純、質量、產量、產業化生產、載藥效率、存儲條件和載藥穩定性等都是其相關技術在臨床實踐過程中非常重要的評定因素[20]。如何解決以上系列問題、促進納米藥物載體的有效遞送系統從實驗室進入臨床應用,目前的技術條件仍相當有限,亟待更新技術克服這些困難。