刺梨多酚對NG-硝基-L-精氨酸甲酯誘導小鼠高血壓的影響及機制

徐 青，譚書明*，俞 露，袁 夢，譚蕓蕓，張麗群

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省刺梨研究院，貴州 貴陽 550025）

高血壓由動脈壓持續升高造成[1]，它是一種死亡率極高的心腦血管疾病[2]。全球范圍內高血壓患者約有11.3億 人，其中80%的患者未得到妥善的健康管理[3]。引發高血壓的主要原因大多歸結于遺傳、高脂高鹽膳食和心理因素，其發病機制復雜，并伴隨腦、心臟和腎臟等臟器損傷，發現不及時或治療不當可能導致心肌梗死、中風、腎功能衰竭甚至死亡[4]。目前常見的降血壓藥物大多是化學合成類藥物，不僅依賴性大且伴有副作用，這導致高血壓患者接受治療依從性差[5]。而從天然植物中提取的降血壓活性成分可代替合成類藥物用于高血壓的治療，并能減少副作用、增加安全性[6]。

刺梨是落葉灌木繅絲花（Rosa roxburghii，RR）的果實，又名刺莓果、送春歸，是一種功能性食品，它主要分布在云貴高原、湖南及四川西部高原，尤其在貴州省產量最為豐富[7]。刺梨果實營養豐富，富含多酚、黃酮、多糖等成分[8]。研究表明，植物多酚提取物具有降血壓作用[9-11]；王著等[12]研究發現石榴多酚能顯著降低高血壓大鼠收縮壓和舒張壓，其作用機制可能與改善血管舒張作用，上調NO、下調血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）和內皮素-1（endothelin-1，ET-1）水平有關。Moreno-Luna等[13]研究發現橄欖油多酚能提高NO的生物利用度，食用富含多酚的橄欖油可顯著降低血壓和改善內皮功能。Yuan Yao等[14]研究發現富含多酚的荔枝種子提取物可通過抑制炎癥、減少氧化應激和調節腸道菌群來降低血壓和改善高血壓引發的腎損傷。有研究表明，刺梨多酚（Rosa roxburghiifruit polyphenols，RRP）具有解酒護肝、改善高脂膳食小鼠脂代謝和預防糖尿病等功效[15-17]，但目前對RRP降血壓作用的研究欠缺，故本研究進一步探討刺梨多酚提取物對NG-硝基-L-精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）誘導的小鼠高血壓的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

50 只SPF級雄性KM小鼠（（35±2）g，生產許可證號：SCXK（湘）2019-0014），購自長沙市天勤生物技術有限公司。

刺梨（‘貴農5號’）由貴州宏財聚農投資有限公司提供；標準飼料與墊料購自重慶騰鑫生物技術有限公司。

沒食子酸標準品 上海麥克林生化科技有限公司；L-NAME 上海源葉生物科技有限公司；卡托普利貴州一樹藥業股份有限公司； 白細胞介素- 6（interleukin-6，IL-6）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒、ET-1試劑盒、Ang II試劑盒、腎素試劑盒、醛固酮（aldosterone，ALD）試劑盒 泉州市睿信生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BT-100-02恒流泵 蘇州辰傲電子科技有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；SpectraMax190酶標儀 美國Molecular Devices公司；UV9000S紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；BP-2010A智能無創血壓計 北京軟隆生物技術有限公司；H1-16KR高速冷凍離心機 湖南可成儀器設備有限公司；DY89-II勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 RRP的制備

取適量刺梨果剁碎真空冷凍干燥72 h，料理機高速研磨后得到刺梨粉若干待用。

RRP的提取與純化：參考文獻[18-20]的方法并稍作調整，稱取適量刺梨粉倒入燒杯，加入0.25%（以刺梨粉質量計）的纖維素酶粉末，按料液比1∶5加入純水攪拌均勻后40 ℃酶解2 h，隨后按料液比1∶15加入體積分數80%乙醇溶液攪拌均勻，在超聲條件下（溫度40 ℃、超聲時間50 min、超聲功率300 W）提取完成后經抽濾除去固體雜質，隨后在50 ℃條件下旋轉蒸發除去乙醇即得RRP粗提液。RRP粗提液在常溫下經AB-8大孔樹脂吸附10 h后解吸（80%乙醇、上樣量500 mL、洗脫液用量2 500 mL），洗脫液經旋轉蒸發、真空冷凍干燥后得RRP備用。

1.3.2 RRP中多酚純度的測定

參考劉祖望等[21]的方法略有修改，配制質量濃度0.1 mg/mL沒食子酸標準品溶液備用；分別吸取沒食子酸標準品溶液60、80、100、120、140、160、180、200、220 μL于5 mL棕色離心管中，純水定容至500 μL后加入500 μL福林-酚試劑，混勻后避光反應2 min，隨后再加入2 mL、質量分數10% Na2CO3溶液，最后加入1 mL純水，搖勻，40 ℃恒溫水浴30 min后于760 nm波長處檢測OD值。標準曲線方程為：y＝21.045x＋0.057 4，R2＝0.999，利用標準曲線方程計算可得RRP中多酚純度為68%。

1.3.3L-NAME誘導小鼠高血壓模型的建立與分組

小鼠適應性喂養1 周（（25±1）℃，12 h光暗循環）后，除空白組（n＝10）外其余組開始誘導建模（L-NAME，15 mg/（kgmb·d）腹腔注射4 周），每周用BP-2010A智能無創血壓儀測量清醒小鼠的收縮壓（systolic blood pressure，SBP），SBP連續3 d大于140 mm Hg并穩定則視為建模成功[22]。

將建模成功的小鼠分為4 組（n＝10）：模型組（9 g/L生理鹽水）、陽性組（50 mg/（kgmb·d）卡托普利）、RPP低劑量組（250 mg/（kgmb·d）RPP）、RPP高劑量組（500 mg/（kgmb·d）RPP），對各組小鼠進行灌胃，空白組灌胃生理鹽水（質量濃度9 g/L）[23]；持續干預4 周，每周測量血壓并記錄。第56天對小鼠進行末次血壓測量后禁食不禁水12 h。采用眼眶取血置于離心管中，高速冷凍離心（4 ℃、3 500 r/min、5 min），取上清液于-80 ℃冰箱中保存；解剖后摘取心、肝、腎稱質量并記錄（以其質量表征相應的臟器指數）；心臟和其中的一個腎臟放入4%多聚甲醛固定液中保存，用于病理學分析；肝臟均分為3 份后，與另一個腎臟用液氮暫存后轉入-80 ℃冰箱中保存。

1.3.4 生理指標測定

3.貧困人口獲得健康能力低下，直接降低了健康扶貧政策的實際績效。單純疾病治療缺乏可持續效果，貧困者自身不能在扶貧中發揮有效作用，這也是目前健康扶貧的突出問題。阿瑪蒂亞·森充分強調了個人可行能力的重要性，“僅僅關注人們如何實現功能性活動是不夠的，關注一個人是否有能力去實現功能性活動也是同等重要的”。［12］世界衛生組織《阿拉木圖宣言》也提出了初級衛生保健九個部分內容，健康教育，食品供給及適當的營養，安全飲用水，基本衛生設施，婦幼保健，免疫接種、地方性疾病預防，普通疾病和受傷的治療，基本藥物供給等，這些政策體現了以提升貧困者健康可行能力為基礎的整體性政策建構。

1.3.4.1 NO、ET-1、Ang II、腎素和ALD水平的測定

采用酶聯免疫吸附試驗（e n z y m e l i n k e d immunosorbent assay，ELISA）測定血清中NO、ET-1、Ang II、腎素和ALD水平，以上實驗均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.4.2 炎癥標志物和氧化應激標志物水平的測定

采用ELISA法測定血清中IL-6和TNF-α的質量濃度，采用生化法檢測小鼠腎臟和肝臟組織勻漿中SOD、GSH-Px和MDA水平，操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 腎臟和心臟組織切片病理學分析

采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法分別對心臟和腎臟組織進行染色，并在光學顯微鏡下觀察其結構，從而對其病理學變化進行評價。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 26.0軟件進行數據分析，實驗數據用平均值±標準差表示，組間顯著性差異采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示具有統計學意義。利用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 RRP對高血壓小鼠血壓和臟器指數的影響

2.1.1 RRP對高血壓小鼠血壓的影響

圖1 RRP對小鼠血壓的影響Fig.1 Effect of RRP on systolic blood pressure in mice

2.1.2 RRP對高血壓小鼠臟器指數的影響

心臟質量增加與高血壓引起的心肌肥大有關[24]，腎臟質量減輕與腎臟損傷和血壓升高密切相關[25]。如表1所示，與空白組相比，模型組心臟指數上升51.8%（P＜0.05），腎臟指數降低32.4%（P＜0.05）。與模型組相比，陽性組、RRP低劑量組、RRP高劑量組心臟指數分別降低30.5%、17.9%、24.8%（P＜0.05），腎臟指數分別上升25.0%、10.3%、18.9%（P＜0.05）。說明陽性藥物及卡托普利低、高劑量RRP均能顯著改善高血壓對心臟和腎臟帶來的不良影響，改善效果依次為陽性藥物＞高劑量RRP組＞低劑量RRP。

表1 RRP對小鼠臟器指數的影響Table 1 Effect of RRP on organ indexes of mice

2.2 RRP對高血壓小鼠血清NO、ET-1、Ang II、腎素和ALD水平的影響

NO的缺乏和ET-1水平的增加會導致血壓升高[26-27]。如表2所示，與空白組相比，模型組NO濃度降低53.0%，ET-1質量濃度上升51.7%（P＜0.05）。與模型組相比，陽性組、RRP低劑量組、RRP高劑量組NO濃度分別上升90.7%、47.0%、63.4%（P＜0.05），ET-1質量濃度分別降低25.2%、7.0%、15.9%（P＜0.05）。說明陽性藥物和低、高劑量RRP均能顯著改善NO和ET-1水平，改善效果依次為陽性組＞RRP高劑量組＞RRP低劑量組，這為RRP能改善血管收縮和內皮功能障礙提供了理論依據。

表2 RRP對高血壓小鼠血清中NO、ET-1、Ang II、腎素和ALD水平的影響Table 2 Effect of RRP on serum NO, ET-1, Ang II, renin and ALD levels

Ang II、腎素和ALD是腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin angiotensin aldosterone system，RAAS）的組成成分，在高血壓患者中通常表現為Ang II、腎素和ALD水平升高[28]。由表2可知，與空白組相比，模型組Ang II質量濃度升高63.2%（P＜0.05），腎素質量濃度升高56.6%（P＜0.05），ALD質量濃度升高74.5%（P＜0.05）。與模型組相比，陽性組Ang II、腎素和ALD質量濃度分別下降26.5%、29.86%、34.3%（P＜0.05）；RRP低劑量組上述指標分別下降6.5%、5.9%、9.7%（P＜0.05）；RRP高劑量組分別下降14.8%、13.3%、16.2%（P＜0.05）。說明陽性藥物和低、高劑量RRP均能顯著改善Ang II、腎素和ALD水平，改善效果依次為陽性藥物＞高劑量組RRP＞低劑量RRP。

2.3 RRP對高血壓小鼠血清炎癥標志物IL-6和TNF-α質量濃度的影響

如圖2所示，與空白組相比，模型組IL-6質量濃度升高55.0%，TNF-α質量濃度升高157.2%（P＜0.05）。與模型組相比，陽性組、RRP低劑量組、RRP高劑量組IL-6質量濃度分別降低22.3%、7.4%、13.3%，TNF-α質量濃度分別降低43.5%、15.8%、24.3%（P＜0.05）。說明陽性藥物及低、高劑量RRP均能顯著緩解高血壓小鼠炎癥，緩解效果依次為陽性藥物＞高劑量組RRP＞低劑量RRP。

圖2 RRP對血清炎癥標志物的影響Fig.2 Effect of RRP on inflammatory markers in serum

2.4 RRP對高血壓小鼠肝臟和腎臟氧化應激標志物的影響

如圖3 所示，與空白組相比，模型組腎臟組織中SOD、GSH-P x 活力分別降低71.3%、28.9%（P＜0.05），MDA水平上升112.5%（P＜0.05）；肝臟組織中SOD、GSH-Px活力分別降低65.1%、29.9%（P＜0.05），MDA水平上升117.0%（P＜0.05）。與模型組相比，陽性組腎臟組織中SOD、GSH-Px活力分別升高161.0%、30.2%（P＜0.05），MDA水平降低28.2%（P＜0.05）；肝臟組織中SOD、GSH-Px活力分別升高142.0%、32.4%（P＜0.05），MDA水平降低43.3%（P＜0.05）。與模型組相比，RRP低劑量組腎臟組織中SOD、GSH-Px活力分別升高10.2%、14.7%，MDA水平降低13.7%（P＜0.05）；肝臟組織中SOD、GSH-Px活力分別升高64.9%、8.4%（P＜0.05），MDA水平降低9.6%（P＜0.05）。與模型組相比，RRP高劑量組腎臟組織中SOD、GSH-Px活力分別升高33.5%、19.4%，MDA水平降低18.9%（P＜0.05）；肝臟組織中SOD、GSH-Px活力分別升高113%、18.4%（P＜0.05），MDA水平降低31.0%（P＜0.05）。說明陽性藥物及低、高劑量RRP均可顯著改善腎臟和肝臟中的脂質過氧化，減少氧化應激，改善效果依次為陽性藥物＞高劑量RRP＞低劑量RRP。

圖3 RRP對小鼠氧化應激標志物的影響Fig.3 Effect of RRP on biomarkers of oxidative stress in mice

2.5 腎臟和心臟組織切片病理學分析

2.5.1 腎臟組織病理學分析

由圖4可見，空白組腎小球、腎小管組織結構正常，形態結構完整，未見明顯病理損傷變化。模型組腎小管、腎小球囊壁的基膜增厚，腎臟組織壞死，出現藍染礦化灶和腎間質纖維細胞增生，伴有炎性細胞浸潤。經陽性藥物和RRP干預后病理癥狀明顯減輕，表現為陽性組僅少量腎小管上皮細胞見輕微腫脹，腎小管內可見有絲網狀蛋白沉積；RRP高劑量組腎小球結構正常，腎小管上皮細胞腫脹，腎小管內可見少量蛋白管型；RRP低劑量組可見纖維細胞增生，腎小管內可見均勻分布的蛋白管型、上皮細胞核空泡狀。說明RRP治療能顯著改善高血壓小鼠腎臟組織病理學表現、減少蛋白沉積。

圖4 L-NAME誘導的高血壓小鼠腎臟組織切片（×400）Fig.4 Renal tissue sections of mice with L-NAME-induced hypertension (× 400)

2.5.2 心臟組織病理學分析

由圖5可知，空白組心肌細胞排列整齊、結構完整，未見有明顯病理損傷改變。模型組心肌細胞排列紊亂，肌細胞梭形改變，心肌細胞腫大，組織內黑色素沉積。陽性組心臟細胞排列整齊，橫紋清晰可見，損傷不明顯。RRP高劑量組心肌細胞排列整齊，心肌組織內有較大空泡。RRP低劑量組局部心肌細胞纖細、排列緊密，染色效果較周圍心肌細胞淺。說明RRP治療能改善高血壓小鼠心臟組織病理癥狀、緩解心肌細胞腫大。

圖5 L-NAME誘導的高血壓小鼠心臟組織切片（×400）Fig.5 Heart tissue sections of mice with L-NAME-induced hypertension (× 400)

3 討 論

血壓升高是導致高血壓患者死亡率上升的重要因素，它會造成機體一系列靶器官受損，如心臟肥大、腎臟疾病和動脈粥樣硬化[29]等。改善高血壓最直接的辦法是降低血壓，從而減少心腦血管疾病的發生，本實驗結果表明RRP對高血壓小鼠血壓可起到顯著的改善作用。

NO是一種有效的血管擴張劑[30]，能介導血管舒張的最小氣態胞間信號分子，可維持血管內的正常張力[31]。NO缺乏會導致全身血管收縮和血壓升高；ET-1是人體作用最持久、最強的血管收縮肽和細胞增殖的驅動因子，會引起血管壁增生和狹窄，導致血管平滑肌肥大和增生[32]。本實驗結果顯示，與模型組相比，RRP處理能顯著提升NO濃度，顯著降低ET-1質量濃度，說明RRP處理能改善高血壓小鼠的內皮功能障礙。

RAAS的過度激活是導致血壓升高的重要原因之一[33]，在調節血壓和血管功能中至關重要，也是探究高血壓降壓機制和開發降血壓藥物的關鍵靶點。腎素裂解血管緊張素原的N端形成Ang I，Ang I在內皮細胞中血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的作用下轉化為Ang II；Ang II是RAAS的主要效應物，它能收縮血管引發高血壓、激活結締組織生長因子和刺激腎上腺ALD的分泌。血清中Ang II水平降低代表著血管收縮劑活性下降，從而導致ALD分泌減少、血壓降低[34]。而ALD水平過高會導致內皮功能障礙，它與血管平滑肌的增殖、血管外基質沉積、纖維細胞活化有關[35]。總地來說，抑制Ang II、腎素和ALD的產生能避免RAAS的過度激活，從而降低血壓和保護心血管器官[36]。本研究結果顯示，與模型組相比，高、低劑量RRP能顯著降低Ang II、腎素和ALD質量濃度。從腎臟和心臟的組織切片可看出，高劑量RRP可改善腎臟組織纖維細胞增生和蛋白沉積，緩解心肌細胞腫大等病理癥狀，這可能與RRP降低了Ang II、ALD和ET-1水平相關。降血壓效果由高到低分別為陽性藥物＞高劑量RRP＞低劑量RRP，說明RRP能抑制L-NAME引起的RAAS過度激活，一定程度上緩解高血壓導致的膠原沉積和纖維化。RRP對NO和ET-1水平的改善程度明顯優于RASS，由此可知，RRP主要通過提高NO水平、改善內皮功能障礙來降低L-NAME誘導的血壓升高；此外，RRP能抑制RAAS過度激活，減少靶器官損傷。

高血壓常伴有低程度的炎性反應，血液的炎癥反應會增加誘發高血壓的可能性[37]。IL-6和TNF-α是尤為關鍵的兩種炎癥因子，過量表達會增加血液中的阻力，使血壓升高。IL-6是具有多種作用的細胞因子，它可以降低內皮細胞中前列環素的含量，提高Ca2＋的滲入和濃度，同時也會引起動脈學管收縮和血壓的上升[38]。TNF-α是造成人體炎癥的最主要因子，其主要作用是促進IL-6的產生，從而促進血小板源生長因子的分泌、細胞的纖維化和血管平滑肌細胞的增殖，造成血管壁直徑減小、血管阻力增大，最終導致血壓上升[39]。本實驗結果顯示，高、低劑量RRP均可顯著降低高血壓小鼠IL-6和TNF-α水平（P＜0.05），減輕高血壓小鼠機體炎癥。此外，IL-6和TNF-α水平的升高會增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，而ROS過量產生引起的氧化應激在高血壓的發病機制中發揮關鍵作用，氧化應激或受損的內皮細胞會激活免疫系統的促炎狀態，而炎癥會導致內皮功能障礙[40]。本研究結果顯示，高、低劑量RRP均能顯著改善高血壓小鼠腎臟和肝臟中SOD、MDA、GSH-Px水平（P＜0.05），表明RRP能減輕高血壓小鼠氧化應激反應。

綜上，RRP能降低高血壓小鼠血壓，提高NO含量，降低ET-1、AngII、腎素和ALD質量濃度，這與王著等[12]對石榴多酚的降血壓作用研究結果一致，且對比得出RRP對NO水平的改善效果突出；同時，RRP能減輕伴隨血壓升高出現的炎癥和氧化應激，保護高血壓小鼠心臟和腎臟，緩解其臟器損傷。本研究結果表明，RRP具有降血壓效果，這主要與RRP能夠提高高血壓小鼠NO水平、改善內皮細胞功能、抑制RAAS過度激活有關，RRP降血壓作用的確切單體成分以及具體作用通路有待進一步研究。