食品中常見真菌毒素的表面增強拉曼光譜檢測研究進展

朱家驥，榮雅文*，焦天慧，郭志明*

（1.鹽城工學院電氣工程學院，江蘇 鹽城 224051；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；3.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021）

真菌毒素是曲霉屬（Aspergillus）、青霉菌屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusarium）和鏈格孢屬（Alternaria）等真菌自然產生的小分子次級代謝產物[1]。真菌毒素作為天然污染物廣泛存在于花生、玉米、小麥、堅果、油籽、水果和蔬菜等食品中，尤其是在食品加工、儲存和運輸過程中，真菌毒素很容易在適宜的溫度和濕度環境下產生。據聯合國糧農組織估計，全球約25%的食品受到真菌毒素的污染，約45～50億人口面臨接觸真菌毒素的風險[2]。因此，真菌毒素污染已成為世界范圍內關注的重要的食品安全問題。近年來，隨著分析技術的發展以及越來越多的真菌被分離，已有超過400 種真菌毒素被發現和鑒定[3]。其中，食品中最常見的真菌毒素包括黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、伏馬毒素（fumonisins，FBs）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）等[4]。食用受真菌毒素污染的食品會對生物體造成嚴重的毒理學影響，包括中毒性肝炎、出血、水腫、免疫抑制、肝癌、食管癌和腎衰竭等[5]。然而，大多數真菌毒素具有耐物理化學處理的特性，使其在食品加工過程中很難被清除[6]。因此，針對食品中真菌毒素污染嚴重的問題，加大對食品中真菌毒素的檢測力度，防止重大食品安全問題的發生已成為當務之急。

目前，真菌毒素的常規檢測方法主要包括以下兩類：1）儀器理化分析法，主要包括氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法和液相色譜-質譜聯用法等[7-9]；2）免疫分析法，主要包括酶聯免疫吸附分析、熒光免疫分析、放射免疫分析和化學發光免疫分析等[10-12]。儀器理化分析法雖然具有結果準確可靠的優點，但是此類方法通常需要結合復雜的樣本前處理，且依賴于昂貴的儀器設備，并需要訓練有素的專業技術人員進行操作。免疫分析法雖然具備高通量、現場快速篩查的優勢，但是該方法中的抗原抗體的制備費時費力、成本較高，且抗干擾能力較差、假陽率偏高，往往需要精確的儀器理化分析法進行驗證。顯然，上述兩類常規檢測方法難以滿足食品加工與流通過程中現場快速檢測的需求。因此，開發一種快速、高精度的真菌毒素檢測方法，以應對快速、多變的市場需求，對于保障食品安全、維護消費者健康有著重要的意義。

拉曼散射是一種光的非彈性散射現象，入射光子與物質分子發生碰撞，使得散射光攜帶了物質的結構信息，即能夠提供物質分子的特異性“指紋圖譜”[13]。因此，拉曼散射研究受到了廣泛的關注，并逐漸形成了一項新的分析技術——拉曼光譜分析技術。但是，由于拉曼散射信號非常微弱（約為入射光強度的1/106）等因素，拉曼光譜分析技術的實用性受到了很大的限制。20世紀70年代，研究發現貴金屬（如金、銀、銅等）表面納米結構是造成拉曼散射信號顯著增強的主要原因，由這種增強效應所獲得的拉曼光譜被稱為表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）[14-15]。目前，SERS技術作為一種新型的快速檢測分析技術，既承載了豐富的分子“指紋圖譜”信息，又具有靈敏度高（增強因子可達106～1010）、檢測速度快、操作簡單、不受水分子干擾等優點。基于上述特點，SERS技術已被廣泛應用于食品安全、化學分析、生物醫學、環境監測以及刑偵科學等領域[16-19]。

本文介紹了SERS信號的增強機理、檢測模式，重點綜述了SERS在食品常見真菌毒素檢測中的應用研究進展，并對目前存在的問題和今后的研究趨勢進行了總結和展望。

1 SERS信號增強機理

雖然SERS技術已在多個領域獲得了成功應用，但其復雜的增強機理至今尚未完全清楚。目前，科學界的主流觀點認為SERS信號增強主要有兩種機理——物理增強機理和化學增強機理。

物理增強也被稱為電磁場增強，通常發生在金屬納米結構表面，由金屬納米結構表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）所介導（圖1），物理增強產生的增強因子可達108甚至更高[20]。物理增強效應與具有SERS效應的金屬納米材料的種類、結構、尺寸、間隙等多種因素密切相關。

圖1 SPR模型示意圖Fig.1 Schematic diagram of SPR model

化學增強是由于被吸附的分子與金屬納米結構表面之間復雜的相互作用增大了體系的極化率，化學增強產生的增強因子約為102[21]。圖2為化學增強機理示意圖，當一定波長的激光照射在金屬納米結構表面時，電子從金屬的費米能級附近躍遷到吸附分子上或者從吸附分子上共振躍遷到金屬上，使得體系的極化率增大，從而產生SERS增強效應。

圖2 化學增強機理示意圖Fig.2 Schematic diagram of chemical enhancement mechanism

2 SERS檢測模式

2.1 SERS直接檢測技術

SERS直接檢測技術也被稱為SERS非標記檢測技術，其原理是將SERS增強基底與目標分析物緊密結合，待目標分析物接近或吸附于SERS增強基底表面時，可獲得其SERS信號，根據SERS信號所提供豐富的分子“指紋圖譜”信息實現對目標分析物的檢測與分析（圖3A）[22]。在SERS直接檢測技術中，常用的SERS增強基底包括銀納米管（Ag nanorods，Ag NRs）、銀納米球（Ag nanospheres，Ag NSs）、金納米顆粒（Au nanoparticles，Au NPs）和金銀核殼納米顆粒（Au@Ag NPs）等[23-25]。SERS直接檢測技術的優點在于SERS增強基底制備簡單、成本低、可直接獲得目標分析物的SERS信號。但是，SERS直接檢測技術的缺陷也比較明顯，包括SERS信號偏弱、復現性較差、易受到食品中復雜基質的干擾等。因此，研究者在實際應用中通過引入SERS增強基底表面改性技術、簡單的樣本前處理技術和化學計量學方法很大程度上提高了SERS直接檢測技術的性能。

圖3 SERS直接檢測（A）和間接檢測（B）技術示意圖Fig.3 Schematic diagrams of label-free (A) and labeled (B) SERS methods

2.2 SERS間接檢測技術

SERS間接檢測技術又被稱為SERS標記檢測技術，其原理是利用特殊的SERS探針來示蹤，通過對探針上標記物的檢測和分析，實現對目標分析物的定性或定量分析（圖3B）[26]。通常，SERS探針由SERS增強基底、拉曼信號分子、保護層和識別元件組成[27]。將具有散射截面大、金屬親和力強的拉曼信號分子修飾到SERS增強基底表面，能夠產生靈敏度高、穩定性強的SERS信號。目前，一些有機小分子物質如4-巰基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid，4-MBA）、4-硝基硫酚（4-nitrothiophenol，4-NTP）、5,5’-二硫代雙-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、4-氨基苯硫酚（4-aminothiophenol，4-ATP）和孔雀石綠異硫氰酸酯（malachite green isothiocyanate，MGITC）等已被成功用作拉曼信號分子[28-30]。在檢測過程中，SERS增強基底容易受到各種因素的干擾，使得SERS信號不穩定，所以常在SERS增強基底表面包裹保護層以提高其穩定性，常用的保護層主要有硅層和多聚物等物質。此外，抗體和適配體作為識別元件賦予了SERS探針特異性識別的性能。與適配體相比，抗體更昂貴且不穩定，容易產生假陽性結果，但由于其制備技術成熟，仍是SERS標記檢測中具有競爭力的識別元件[31]。另一方面，適配體因其成本低、易于合成、對目標分子具有良好的特異性和穩定性，已逐漸成為抗體的替代選擇[32]。SERS標記檢測機制可分為競爭性機制和非競爭性機制，前者適用于檢測只有一個結合位點的目標分子，而后者適用于分析具有兩個或多個位點的大分子。在競爭性免疫分析中，目標分子和SERS探針相互競爭與抗體結合，因此，SERS信號強度與目標分子的濃度呈負相關。

無論是SERS直接檢測技術還是間接檢測技術都有其固有的優點和局限性，了解這些優點和局限性有助于更好地利用它們。因此，表1對比了兩種SERS檢測技術的優點與缺陷。

3 SERS在食品常見真菌毒素檢測中的應用

3.1 SERS檢測食品中AFs的應用

AFs是由多種曲霉屬真菌產生的一系列劇毒、穩定的次級代謝產物，其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）毒性最強，對人和動物具有嚴重、慢性的毒性[41]。目前，國際癌癥研究機構已將AFs認定為1級致癌物質，長期接觸AFs可誘發突變、畸形、膽管增生和肝癌等疾病[42]。因此，各個國家和國際機構都發布了嚴格的監管指導方針，中國和歐盟規定的AFs的最大限量范圍分別為0.5～20.0 μg/kg和0.1～15.0 μg/kg[43-44]，美國食品藥品管理局規定AFs限量小于20 μg/kg[45]。

近年來，大量的研究報道了利用SERS直接檢測技術檢測食品中AFs的方法（表2）。例如，Lee等[46]合成Ag NSs作為SERS增強基底，然后結合化學計量學方法，建立了玉米中AFs的分類模型和定量檢測模型。在分類模型中，K最近鄰模型（K nearest neighbor，KNN）顯示出最優的準確判別率；在定量檢測模型中，多元線性回歸模型（multivariate linear regression，MLR）展現出最佳的預測性能，檢測限（limit of detection，LOD）為13 μg/kg，定量限（limit of quantification，LOQ）為44 μg/kg。Lin Bingyong等[47]通過自組裝方法在陽極氧化鋁模板的納米孔洞中嵌入金納米金字塔（Au nanobipyramids into the nanoholes of anodic aluminum oxide，Au NBPs@AAO）作為SERS增強基底，并且該SERS增強基底對拉曼信號分子4-ATP的平均增強因子可達1.0×108，將其用于花生樣本中AFB1的檢測，檢測限為0.5 μg/L（0.5 μg/kg），檢測時間為1 min，與傳統的酶聯免疫吸附分析法（檢測時間約為30 min）相比，該方法更為高效。Kutsanedzie等[48]合成Ag NPs作為SERS增強基底，且通過優化其pH值獲得了最大的增強因子（當pH值為11時，增強因子可達1.45×108），結合化學計量學方法競爭性自適應重加權采樣-偏最小二乘回歸（competitive adaptive reweighted sampling-partial least squares，CARS-PLS）和遺傳算法-偏最小二乘回歸（genetic algorithm-partial least squares，GA-PLS）用于可可豆中AFB1的加標檢測，檢測限為4.15 pg/mL（4.15×10-3μg/kg），加標回收率為98.58%～108.44%。除化學計量學方法外，SERS直接檢測技術也通常與簡單的樣本前處理技術以及表面改性技術等方法結合以提高其檢測性能。例如，Qu Lulu等[49]合成Au NPs作為SERS增強基底，并且結合薄層色譜法用于霉變花生中AFB1、黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）和黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）的檢測，檢測限分別為1.5×10-6、1.1×10-5、1.2×10-6mol/L和6.0×10-7mol/L（469、3 460、390 μg/kg和198 μg/kg），說明該方法可用于4 種AFs的分離檢測，在食品現場快速篩選中具有良好的應用前景。Szlag等[50]合成金納米薄膜（Au nanofilm，Au NF）作為SERS增強基底，并在其表面包裹聚合物親和劑（polyN-acryloyl glycinamide，pNAGA）用于吸附AFB1分子，將該方法可用于水中AFB1的檢測，檢測限為10 μg/L（10 μg/kg）。

表2 SERS直接檢測技術檢測食品中AFs的方法Table 2 Label-free SERS methods for detecting AFs in foods

除SERS直接檢測技術外，采用SERS間接檢測技術檢測食品中AFs的方法也有廣泛報道（表3）。在SERS間接檢測中，由于抗體制造技術已較為成熟，因此其成為應用最廣泛的識別元件。例如，Ko等[52]構建了基于SERS的免疫檢測平臺，以二氧化硅包裹中空金納米顆粒（silica-encapsulated hollow gold nanoparticles，SEHGNs）作為SERS增強基底，并在其表面修飾拉曼信號分子MGITC與AFB1的抗體Anti-AFB1構成組裝體SEHGNs-MGITC-Anti-AFB1作為SERS探針，同時將表面修飾抗體Anti-ATB1的磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）用作負載免疫復合物的支撐基底，借助磁分離與競爭性免疫分析手段實現了對水中AFB1的定量分析（圖4A），檢測限為0.1 ng/mL（0.1 μg/kg），該方法檢測速度快（短于30 min）、靈敏度高、重現性好，有望成為多種真菌毒素痕量檢測的一種新方法。

表3 SERS間接檢測技術檢測食品中AFs的方法Table 3 Labeled SERS methods for detecting AFs in foods

圖4 SERS間接檢測原理示意圖Fig.4 Schematic diagrams of the principle of labeled SERS detection

Fang Congwei等[53]合成了金包裹鎳納米顆粒（Ni@Au NPs）作為SERS增強基底，并在其表面修飾AFB1抗原，同時合成Au NPs，并在其表面修飾拉曼信號分子4-MBA與AFB1抗體構成組裝體Au NPs-4-MBA-抗體作為SERS探針。當不存在自由AFB1分子時，在抗原-抗體相互作用下，修飾抗原的SERS增強基底與SERS探針結合成一個復合物，此時4-MBA的拉曼信號非常強。當存在自由AFB1分子時，修飾抗原的SERS增強基底將優先與AFB1結合，從而脫離SERS探針，通過磁分離之后4-MBA的拉曼信號顯著衰減（圖4B），該方法對AFB1的檢測限為0.05 fg/mL（0.5×10-7μg/kg），將該方法用于玉米中AFB1的加標檢測，加標回收率為87.4%～111.7%，與標準檢測方法液相色譜-質譜聯用法相比，該方法具有靈敏度高的明顯優勢。

除抗體之外，適配體因其成本低、易于合成、對目標分子具有良好的特異性和穩定性，逐漸成為抗體的替代選擇，在SERS間接檢測中獲得廣泛應用。例如，Li Aike等[54]合成金納米星（gold nanostar，Au NS）作為SERS增強基底，并在其表面修飾AFB1適配體（DNA1），同時合成Ag NPs，并在其表面修飾拉曼信號分子4-ATP與適配體互補鏈（DNA2）構成組裝體Ag NPs-4-ATP-DNA2作為SERS探針。當不存在自由AFB1分子時，在DNA1與互補鏈DNA2的相互作用下，修飾DNA1的SERS增強基底與SERS探針形成一個復合物，此時4-ATP的拉曼信號非常強。當存在自由AFB1分子時，修飾DNA1的SERS增強基底將優先與AFB1結合，將DNA2釋放出來，通過清洗分離后4-ATP的拉曼信號顯著衰減（圖4C），該方法對AFB1的檢測限為0.48 pg/mL（4.8×10-4μg/kg），將該方法用于花生牛奶中AFB1的加標檢測，加標回收率為88.33%～103.66%。

Yang Mingxiu等[55]合成金銀核殼納米三角（Au@Ag nanotriangles，Au@Ag NTs）作為SERS增強基底，并在其表面修飾拉曼信號分子DTNB與AFB1適配體，構成組裝體Au@Ag NTs-DTNB-適配體作為SERS探針，同時合成殼聚糖（chitosan，CS）包裹的四氧化三鐵磁性材料（CS-Fe3O4），并在其表面也修飾AFB1適配體作為磁性富集探針，當存在自由AFB1分子時，SERS探針與磁性富集探針將共同捕獲AFB1分子形成三明治結構復合物，此時將增強DTNB的拉曼信號（圖4D），該方法對AFB1的檢測限為0.54 pg/mL（5.4×10-4μg/kg），將該方法用于花生油中AFB1的加標檢測，加標回收率為94.7%～109.0%。

3.2 SERS檢測食品中OTA的應用

赭曲霉毒素（ochratoxins，OTs）是曲霉屬真菌和青霉屬真菌產生的次級代謝產物，在已經被發現的多種OTs中，OTA是各類食品中毒性較大、最常見的一種真菌毒素，國際癌癥研究機構已將其認定為2B級致癌物質[62]。中國和歐盟規定的OTA的最大限量范圍分別為低于5 μg/kg和0.5～10.0 μg/kg[43-44]。

目前，SERS直接檢測技術已被廣泛應用于食品中OTA的檢測（表4）。例如，Galarreta等[63]首次將SERS技術應用于OTA的檢測研究，他們通過納米技術研制了一款管道中嵌有金納米結構（Au nanostructure，Au NSTR）的聚二甲基硅氧烷微流控芯片作為SERS檢測平臺，用于水中OTA的檢測，檢測限為50 nmol/L（0.2×102μg/kg）。Gillibert等[64]合成粗糙的Au NF作為SERS增強基底，同時借助PLS和PCA等化學計量學方法實現了水中OTA的定量檢測，檢測限為10 pmol/L（4.0×10-3μg/kg）。Rostami等[65]開發了一種新型的SERS檢測平臺，首先合成二氧化硅包覆的銀納米柱（Ag-capped silicon nanopillars，Ag NPILs@SiO2）作為SERS增強基底，然后通過結合高通量支持液膜法實現了白酒中OTA的定量檢測，檢測限為0.12×10-3g/L（120 μg/kg）。

表4 SERS直接檢測技術檢測食品中OTA的方法Table 4 Label-free SERS methods for detecting OTA in foods

除SERS直接檢測技術外，SERS間接檢測技術也被廣泛應用于食品中OTA的檢測。例如，Ganbold等[66]合成Ag NPs作為SERS增強基底，將由染料分子Cy5標記的OTA適配體作為SERS探針。當不存在自由OTA分子時，在絮凝劑的作用下，SERS探針將吸附在SERS增強基底表面，此時Cy5的拉曼信號獲得了極大的增強。當存在自由OTA分子時，SERS探針將從SERS增強基底表面脫落，然后與OTA結合，通過清洗分離后Cy5拉曼信號顯著衰減（圖5A），該方法可實現水中OTA的定量檢測，檢測限為0.1 nmol/L（4.0×10-2μg/kg），該方法也為實現低成本、快速痕量檢測真菌毒素提供了一種新思路。

圖5 SERS間接檢測原理示意圖Fig.5 Schematic diagram of the principle of labeled SERS detection

Shao Baoyi等[67]合成了一種帶有納米內隙的金核金銀合金殼結構（Au@Au-Ag nanogapped nanostructures，Au@Au-Ag NNSs）作為SERS增強基底，并在其表面修飾拉曼信號分子4-MBA和OTA適配體互補鏈，構成組裝體Au@Au-Ag NNSs-4-MBA-適配體互補鏈作為SERS探針，同時合成Fe3O4MNPs，并在其表面修飾OTA適配體。當不存在自由OTA分子時，在適配體與其互補鏈的相互作用下，SERS探針與Fe3O4MNPs結合成一個復合物，此時4-MBA拉曼信號得到顯著增強。當存在自由OTA分子時，Fe3O4MNPs將優先與OTA結合，從而脫離SERS探針，通過磁分離之后4-MBA拉曼信號明顯衰減（圖5B），該方法對OTA的檢測限為0.004 ng/mL（0.4×10-2μg/kg），將該方法用于紅酒中OTA的加標檢測，加標回收率為92%～112%，與傳統的酶聯免疫吸附分析法相比，該方法更具優越性。

Song Dan等[68]合成Au@Ag NPs作為SERS增強基底，并在其表面修飾拉曼信號分子DTNB和OTA適配體，構成組裝體Au@Ag NPs-DTNB-適配體作為SERS探針，同時合成Fe3O4@Au MNPs，并在其表面修飾OTA適配體互補鏈。當不存在自由OTA分子時，在適配體與其互補鏈的相互作用下，S E R S 探針與F e3O4@Au MNPs結合成一個復合物，此時DTNB拉曼信號獲得顯著增強。當存在自由OTA分子時，SERS探針將釋放Fe3O4@Au MNPs，從而與OTA結合，通過磁分離之后DTNB拉曼信號明顯衰減（圖5C），該方法對OTA的檢測限為0.48 pg/mL（4.8×10-4μg/kg），將該方法用于紅酒、咖啡中OTA的加標檢測，加標回收率分別為88%～104%和86%～107%。

近年來，實現多種真菌毒素的同步檢測既是現實需求，也是一種挑戰與發展趨勢。Zhao Yuan等[69]開發了一種基于SERS的同步檢測OTA和AFB1的新方法，合成Ag@Au NPs作為SERS增強基底，在一部分SERS增強基底表面修飾拉曼信號分子4-ATP和OTA適配體，構成組裝體Ag@Au NPs-4-ATP-適配體1作為SERS探針1（針對OTA），在另一部分SERS增強基底表面修飾拉曼信號分子4-NTP和AFB1適配體，構成組裝體Ag@Au NPs-4-NTP-適配體2作為SERS探針2（針對AFB1）。同時在合成的MNPs表面分別修飾OTA適配體互補鏈和AFB1適配體互補鏈。當不存在自由OTA和AFB1分子時，在適配體與其互補鏈的相互作用下，SERS探針1、SERS探針2與MNPs結合成一個復合物，此時4-ATP與4-NTP的拉曼信號非常強。當存在自由OTA與AFB1分子時，SERS探針1將優先與OTA結合，SERS探針2將優先與AFB1結合，通過磁分離之后4-ATP與4-NTP的拉曼信號明顯衰減（圖5D），該方法對OTA的檢測限為0.006 ng/mL（0.6×10-2μg/kg），對AFB1的檢測限為0.03 ng/mL（0.3×10-1μg/kg），將該方法用于玉米粉中OTA與AFB1的同步加標檢測，加標回收率分別為（95.00±3.08）%～（99.48±3.79）%和（95.00±3.35）%～（99.65±3.95）%，該方法啟發了基于不同長度適配體、抗體或其他識別元件的多種真菌毒素同步檢測新思路。

SERS間接檢測技術在食品中OTA檢測方面的應用如表5所示。

表5 SERS間接檢測技術檢測食品中OTA的方法Table 5 Labeled SERS methods for detecting OTA in foods

3.3 SERS檢測食品中FBs、ZEN和DON的應用

FBs、ZEN和DON均為鐮刀菌屬產生的次級代謝產物。FBs具有多種類型，其中FB1、FB2和FB3為最主要的3 種類型，FBs主要對人和動物產生肝臟和腎臟毒性[73]。ZEN主要與雌激素活性有關，同時也具有免疫毒素、基因毒性、肝臟毒性和腎臟毒性；DON主要引起人和動物的消化系統疾病，包括惡心、嘔吐、腹瀉和腸出血等[74-75]。目前，國際癌癥研究機構已將FBs和ZEN認定為2B級致癌物質[76]。因此，各個國家、地區和國際機構發布了嚴格的監管指導方針：1）中國、美國和歐盟規定的FBs最大限量范圍分別為200～4 000 μg/kg、2 000～4 000 μg/kg和200～4 000 μg/kg[43-44,77]；2）中國和歐盟規定的ZEN最大限量范圍分別為低于60 μg/kg和20～350 μg/kg[43-44]；3）中國、美國和歐盟規定的DON最大限量范圍分別為低于1 000 μg/kg、低于1 000 μg/kg和200～1 750 μg/kg[43-44,78]。

目前，SERS直接檢測技術已被廣泛應用于食品中FBs、ZEN和DON的檢測（表6）。隨著納米合成技術的發展，3D SERS增強基底因其穩定性好、靈敏度高等優點已獲得了廣泛應用。例如，Lee等[79]合成銀枝晶（Ag dendrites，Ag Ds）作為3D SERS增強基底，然后結合化學計量學方法，建立了玉米中FBs的不同污染程度的分類模型和定量檢測模型。在分類模型中，在一階導數光譜預處理的基礎上，KNN顯示出最優的準確判別率；在定量檢測模型中，在一階導數光譜預處理的基礎上，MLR展現出最佳的預測性能，定量限為1.25 mg/kg。Li Jinjie等[80]提出了一種基于SERS的同時檢測AFB1、DON和ZEN的新方法，首先在聚二甲基硅氧烷涂層的陽極氧化鋁（polydimethylsiloxane coated anodic aluminum oxide，PDMS@AAO）復合襯底表面濺射Au NPs得到3D SERS增強基底Au NPs-PDMS@AAO，該SERS增強基底對拉曼信號分子4-MBA的增強因子可達2.2×106，然后結合化學計量學方法構建了AFB1、DON和ZEN的定量檢測模型，檢測限分別為1.8、24.8 ng/mL和47.7 ng/mL（1.8、24.8 μg/kg和47.7 μg/kg），將該方法用于玉米中AFB1、DON和ZEN加標同步檢測，加標回收率為94%～110%。Liu Qing等[81]通過雙光子聚合法構筑了金納米柱陣列（Au nanopillar arrays，Au NPILAs）作為3D SERS增強基底，并采用時域有限差分法（finite-difference time-domain，FDTD）模擬其周圍的電磁場增強以獲得最佳的SERS增強效果，同時結合化學計量學方法實現了DON和FB1的定量檢測。Yuan Jing等[82]合成Ag NPs作為SERS增強基底，在絮凝劑的作用下可實現DON標準溶液的高精度檢測，將該方法用于玉米、菜豆和燕麥中DON的加標檢測，檢測限分別為10-6、10-6mol/L和10-4mol/L（3.0×102、3.0×102μg/kg和3.0×104μg/kg）。

表6 SERS直接檢測技術檢測食品中FBs、ZEN和DON的方法Table 6 Label-free SERS methods for detecting FBs, ZEN, and DON in foods

除SERS直接檢測技術外，SERS間接檢測技術也被廣泛應用于食品中FBs、ZEN和DON的檢測。例如，Liu Jianzhi等[83]合成了Au NPs作為SERS增強基底，并在其表面修飾拉曼信號分子4,4’-聯吡啶和ZEN抗體構成組裝體Au NPs-4,4’-聯吡啶-抗體作為SERS探針，同時在載玻片上修飾牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和ZEN抗原作為捕獲基底。當不存在ZEN自由分子時，在抗原-抗體相互作用下，SERS探針與捕獲基底結合成一個復合物，此時4,4’-聯吡啶拉曼信號獲得了增強。當存在自由ZEN分子時，SERS探針將脫離捕獲基底，從而與ZEN分子結合，通過清洗分離后4,4’-聯吡啶拉曼信號大幅衰減（圖6A）。因此，該基于SERS的競爭性免疫分析方法可實現ZEN的高精度檢測，檢測限為1.0 pg/mL（1.0×10-3μg/kg），將該方法用于對玉米中ZEN的加標檢測，加標回收率為99.0%～105.2%，該方法還可以進一步應用于多種被ZEN污染的天然谷物樣本的分析，具有很大的實際樣品檢測潛力。

圖6 SERS間接檢測不同真菌毒素原理示意圖Fig.6 Schematic diagram of the principle of labeled SERS detection for different mycotoxin

Wang Xiaokun等[84]開發了基于SERS的高靈敏檢測多種真菌毒素的競爭性免疫分析平臺，一方面構筑Au NPILAs作為3D SERS增強基底，首先在其表面固定羧酸自組裝單層形成親水表面，然后采用1-乙基-3-(3-(二甲氨基)-丙氨基)碳二亞胺（1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl) carodiimide，EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）激活羧酸基團，最后在SERS增強基底表面修飾真菌毒素-BSA；另一方面合成Au NPs，并在其表面修飾拉曼信號分子MGITC和次級抗體，構成組裝體Au NPs-MGITC-次級抗體作為SERS探針。當不存在自由目標真菌毒素分子時，在抗原-抗體相互作用下，真菌毒素抗體將與SERS增強基底表面的真菌毒素結合，從而固定在其表面，然后在抗體-抗體相互作用下，真菌毒素抗體將與次級抗體相結合，從而形成SERS增強基底-真菌毒素抗體-SERS探針三明治結構復合物，此時將極大增強MGITC拉曼信號。當存在自由目標真菌毒素分子時，真菌毒素抗體將優先與目標真菌毒素分子相結合，從而SERS探針將脫離SERS增強基底，通過清洗分離后MGITC拉曼信號顯著衰減（圖6B）。因此，該方法可實現OTA、FBs和AFB1的高精度檢測，檢測限分別為5.09、5.11 pg/mL和6.07 pg/mL（5.09×10-3、5.11×10-3μg/kg和6.07×10-3μg/kg），該方法的靈敏度比傳統的酶聯免疫吸附法高兩個數量級。

Zhang Wanjun等[85]開發了基于SERS的高靈敏檢測多種真菌毒素的側流競爭免疫分析平臺，首先合成Au@Ag NPs作為SERS增強基底，將一部分SERS增強基底表面修飾拉曼信號分子4-MBA，然后分別在其表面修飾ZEN抗體構成組裝體Au@Ag NPs-4-MBA-抗體1作為SERS探針1，修飾DON抗體構成組裝體Au@Ag NPs-4-MBA-抗體2作為SERS探針2，修飾T-2抗體構成組裝體Au@Ag NPs-4-MBA-抗體3作為SERS探針3；其次，將另一部分SERS增強基底表面修飾拉曼信號分子DTNB，然后分別在其表面修飾AFB1抗體構成組裝體Au@Ag NPs-DTNB-抗體4作為SERS探針4，修飾FB1抗體構成組裝體Au@Ag NPs-DTNB-抗體5作為SERS探針5，修飾OTA抗體構成組裝體Au@Ag NPs-DTNB-抗體6作為SERS探針6。將AFB1-BSA和ZEN-BSA混合作為捕獲抗原并設置于側流競爭免疫分析平臺檢測區1，將FB1-BSA和DON-BSA混合作為捕獲抗原并設置于側流競爭免疫分析平臺檢測區2，將OTA-BSA和T-2-BSA混合作為捕獲抗原并設置于側流競爭免疫分析平臺檢測區3。當不存在自由真菌毒素分子時，在抗原-抗體相互作用下，SERS探針1和SERS探針4將固定于檢測區1，SERS探針2和SERS探針5將固定于檢測區2，SERS探針3和SERS探針6將固定于檢測區3，此時3 個檢測區域的4-MBA和DTNB拉曼信號均非常強烈。當存在自由真菌毒素分子時，抗體將優先與目標真菌毒素分子相結合，從而脫離相應的SERS探針，經過清洗分離后4-MBA和DTNB拉曼信號顯著衰減（圖6C）。因此，該方法可實現6 種真菌毒素（AFB1、ZEN、FB1、DON、OTA和T-2）的高精度同步檢測，檢測限分別為9.6×10-4、6.2×10-3、0.26、0.11、1.57×10-2μg/kg和8.6×10-3μg/kg，將該方法用于玉米中AFB1、ZEN、FB1、DON、OTA和T-2的加標檢測，加標回收率分別為83.2%～106.2%、78.9%～97.3%、81.1%～104.5%、79.5%～102.3%、82.7%～97.7%和81.3%～100.5%，該方法檢測速度快（小于20 min），檢測精度可與液相色譜-質譜聯用法相媲美，故該方法是一種很有應用前景的多種真菌毒素同步檢測方法。

He Deyun等[86]合成了Au NR作為SERS增強基底，并在其表面修飾FB1適配體互補鏈作為SERS探針，同時在FB1適配體上修飾拉曼信號分子Cy5.5。當不存在FB1自由分子時，在適配體與其互補鏈的相互作用下，SERS探針與修飾Cy5.5的FB1適配體結合成一個復合物，此時Cy5.5拉曼信號非常強烈。當存在FB1自由分子時，修飾Cy5.5的FB1適配體優先與FB1分子結合，從而與SERS探針脫離，經過清洗分離后Cy5.5拉曼信號顯著衰減（圖6D）。因此，該方法可實現FB1的高精度檢測，檢測限為3.0 pg/mL（3.0×10-3μg/kg），將該方法用于玉米中FB1的加標檢測，加標回收率為92%～107%，該方法檢測精度可與液相色譜-質譜串聯法相媲美。

SERS間接檢測技術在食品中檢測FBs、ZEN和DON的應用如表7所示。

表7 SERS間接檢測技術檢測食品中FBs、ZEN和DON的方法Table 7 Labeled SERS methods for detecting FBs, ZEN, and DON in foods

4 結 語

作為一種新興的檢測分析技術，SERS能夠提供豐富的分子“指紋圖譜”信息，且具有靈敏度高、檢測速度快、操作簡單、不受水分子干擾等優點，目前已成為食品安全檢測領域的研究熱點。本文重點介紹了近年來SERS技術在食品常見真菌毒素（AFs、OTA、ZEN、FBs和DON等）檢測中的應用情況，且SERS技術在真實樣本中的分析能力和準確性在已這些研究中獲得了證實。然而，將SERS技術真正應用于現場分析仍存在許多問題亟待解決：1）SERS增強基底在SERS檢測中發揮著至關重要的作用，然而大規模制備具有均勻SERS活性的基底仍然是一個重大挑戰。因此，在未來的研究中需要進行更嚴格的試驗來探究批量制備之間的差異和大規模制備的可行性，同時將半導體材料引入貴金屬SERS增強基底以獲得更好的性能。2）目前已廣泛應用的抗體和適配體僅能特異性識別常見的真菌毒素，很大程度上限制了SERS技術的檢測范圍。因此，在未來的研究中有必要將識別元件的范圍進一步擴展到其他親和劑，如分子受體、聚合物和多肽等，而不是僅局限于抗體和適配體，這將有助于拓寬真菌毒素的檢測范圍。3）食品中的復雜基質對目標真菌毒素分子SERS信號的嚴重干擾，是SERS技術從實驗室走向現場分析的又一大障礙。因此，在未來的研究中需要開發高性能的化學計量學算法，以實現從復雜、海量的光譜數據中提取關鍵信息，從而提高定性與定量分析模型的精度。4）目前尚未建立食品中真菌毒素的拉曼光譜“指紋圖譜”數據庫，這為SERS現場快速檢測帶來了較大的困難。因此，在未來的工作中需要廣泛地收集和匯總真菌毒素的拉曼光譜“指紋圖譜”，建立可搜索、可操作的數據庫和網絡平臺，打破時間和區域的界限，實現研究機構資源共享，賦能真菌毒素現場快速檢測技術。