蒙古族木桶發(fā)酵奶酪成熟階段風(fēng)味變化研究

林佳衛(wèi)，焦昱瑋，劉敏，杜浩月

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014109；2.寧夏大學(xué)，銀川 750000）

0 引 言

蒙古族牧民采用木桶發(fā)酵制作奶酪制品，木桶由于歷經(jīng)多年使用，具有非常獨(dú)特的菌群結(jié)構(gòu)，通過(guò)木桶發(fā)酵的奶酪產(chǎn)品深受牧民的喜愛(ài)。奶酪品質(zhì)好壞主要受風(fēng)味物質(zhì)的影響[1]，因而對(duì)木桶發(fā)酵奶酪中風(fēng)味物質(zhì)的研究具有重要意義。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于西方奶酪的研究主要針對(duì)其諸多影響因素以及成熟過(guò)程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[2]，國(guó)內(nèi)的研究多數(shù)是以奶酪加工工藝和發(fā)酵劑對(duì)奶酪風(fēng)味的影響為主[3-7]，對(duì)不同成熟時(shí)期奶酪中揮發(fā)性風(fēng)味成分的差異較少報(bào)道。

奶酪中的香氣成分多種多樣，結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，萃取技術(shù)是奶酪風(fēng)味分析的前期關(guān)鍵技術(shù)。通常將SPME 萃取裝置與GC-MS 等儀器結(jié)合使用進(jìn)行風(fēng)味檢測(cè)與分析[8]，其已廣泛應(yīng)用于食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)中。食品風(fēng)味物質(zhì)分析和測(cè)定中廣泛采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS），在揮發(fā)性和半揮發(fā)性樣品中檢測(cè)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)應(yīng)用較多。目前頂空固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME/GC-MS）主要應(yīng)用于普洱茶、奶酪、啤酒、黃酒、白酒風(fēng)味物質(zhì)的分析檢測(cè)中[9-11]。

本研究以不同成熟階段蒙古族木桶發(fā)酵奶酪作為研究對(duì)象，釆用頂空固相微萃取（solid phase microextraction, SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatograph-mass spectrometer, GC-MS），將不同成熟時(shí)間段奶酪中的揮發(fā)性風(fēng)味組分物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，并采用主成分分析（principal component analysis，PCA）方法對(duì)風(fēng)味組分進(jìn)行分析，從而進(jìn)一步闡明蒙古族木桶發(fā)酵奶酪在不同成熟時(shí)間風(fēng)味物質(zhì)的變化情況，從而為制備適合我國(guó)消費(fèi)者喜愛(ài)的傳統(tǒng)酸凝奶酪提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及設(shè)備

采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟西烏珠穆沁旗牧民木桶制作奶酪(成熟0、10、20 和30 d)。

安捷倫6890N-5973 氣相色譜-質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent 公司；75 μm CAR/PDMS 的固相微萃取頭，美國(guó)Supelco 公司；B15-3 智能恒溫?cái)?shù)顯定時(shí)磁力攪拌器（10 L，1 500 r/min，上海司樂(lè)儀器有限公司；LG10-2.4A 管式離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 干酪游離氨基酸含量測(cè)定

參照 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定GB 5009.124-2016[12]。

1.2.2 干酪基本成分的測(cè)定

水分含量的測(cè)定：參照GB5009.3—2016[13]。脂肪含量的測(cè)定：參照GB5009.6—2016[14]。干酪的蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用凱氏定氮法，參照GB5009.5—2016[15]。

測(cè)量pH 值，取每個(gè)奶酪樣品5 g 進(jìn)行研磨，與10 mL 無(wú)二氧化碳的蒸餾水混合，然后使用校準(zhǔn)的pHS-3C 型精密pH 計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

1.2.3.1 固相微萃取[16]

將保存好的干酪，分別抽取成熟0、10、20 和30 d樣品2.0 g 放入15 mL 萃取瓶中，放置于60 ℃恒溫水浴鍋中保持30 min，將老化好的萃取針頭插入到萃取瓶中進(jìn)行萃取，萃取完成后，取出纖維頭插入到氣相色譜（汽化室）中進(jìn)行GC-MS 分析，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)行3 次分析。

1.2.3.2 GC 條件

色譜柱升溫程序?yàn)椋浩鹗贾鶞貫?0 ℃，保持4 min后，以4 ℃/min 速度升到100 ℃，保持2 min，然后升到150 ℃，以6 ℃/min 的速度，最后以5 ℃/min 速度升到230 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度設(shè)置為250 ℃，無(wú)分流進(jìn)樣處理。采用30 m×0.25 mm×0.25 μm Agilent DB-WAX 聚乙二醇（PEG）氣相毛細(xì)管柱，流速為1 mL/min，載氣為氦。

1.2.3.3 質(zhì)譜條件

電離能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，接口溫度250 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，檢測(cè)器溫度為280 ℃，掃描模式為全掃描，質(zhì)量檢測(cè)范圍為20～350 amu。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用軟件方差分析（ANOVA）進(jìn)行理化性質(zhì)(水分、蛋白質(zhì)、脂肪和pH）和風(fēng)味有關(guān)的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)P<0.05 認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；并采用Origin (OriginLab 公司出品)軟件對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行主成分分析(PCA)、相關(guān)性和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木桶發(fā)酵奶酪成熟期間游離氨基酸含量分析

木桶發(fā)酵奶酪在不同成熟時(shí)間（0、10、20、30 d)測(cè)定的氨基酸含量動(dòng)態(tài)變化如圖1 所示。

圖1 不同成熟階段干酪游離氨基酸含量

木桶發(fā)酵奶酪中共檢測(cè)到18 種游離氨基酸。當(dāng)奶酪成熟到第10 d，多數(shù)游離氨基酸含量下降，這一因素的發(fā)生，可能與大量酯類物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。隨著干酪成熟時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，游離氨基酸含量顯著增加（P<0.05），20 d 時(shí)氨基酸含量達(dá)到最大，30 d 時(shí)大多數(shù)開(kāi)始下降。20 d 時(shí)開(kāi)始增加的游離氨基酸是天冬氨酸（Asp）、絲氨酸(Ser）、異亮氨酸（Ile）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）、纈氨酸(Val）、亮氨酸（Leu)、賴氨酸（Lys）和脯氨酸（Pro），其中Asp、Leu、Glu和Pro 呈顯著增加（P<0.05）；亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）和賴氨酸(Lys）這4 類氨基酸常被用作衡量西方（切達(dá)）干酪成熟度的標(biāo)志[17]。支鏈氨基酸亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）和纈氨酸（Val）、芳香族氨基酸苯丙氨酸（Phe），酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）是風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)，對(duì)干酪風(fēng)味的形成起主要作用[18]。生成含量最多的支鏈氨基酸Leu 經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)氨酶生物合成及Strecker 降解，經(jīng)轉(zhuǎn)氨、脫羧、還原形成3-甲基-1-丁醇，賦予木桶奶酪特殊的風(fēng)味，但隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量在逐漸消失，降低的原因推測(cè)是合成相應(yīng)的酯類如乙酸苯乙酯和辛酸異丁酯等物質(zhì)導(dǎo)致。苯乙醇是由苯丙氨酸經(jīng)酵母菌作用Strecker 降解代謝形成[19]，賦予奶酪玫瑰和發(fā)酵香氣，有澀感和苦味。脯氨酸，絲氨酸和天冬酰胺隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)大量生成，可能與木桶奶酪甜味生成有關(guān)。

2.2 木桶發(fā)酵奶酪基本成分分析

蒙古族木桶奶酪在不同成熟期(0、10、20、30 d) 的相關(guān)理化指標(biāo)（水分、蛋白質(zhì)、脂肪和pH 值）測(cè)定結(jié)果如表1 所示。

表1 木桶奶酪成熟期間理化指標(biāo)的變化

由表1 可知，不同成熟期間水分、脂肪含量、pH值和蛋白質(zhì)含量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)，水分含量逐漸減少；脂肪水解量前期降低，30 d 時(shí)開(kāi)始上升；蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)；成熟前期由于乳酸菌活力較高，大量乳糖分解，從而導(dǎo)致乳酸呈上升趨勢(shì)，所以在成熟0～20 d 時(shí)pH 值較低，隨著成熟時(shí)間延長(zhǎng)到30 d 時(shí)，乳糖水解能力逐漸減弱，蛋白質(zhì)水解加劇，此時(shí)，pH 值逐漸上升；總體來(lái)看，由于成熟期間水分大幅降低，導(dǎo)致脂肪與蛋白質(zhì)含量趨于增大狀態(tài)。

2.3 木桶發(fā)酵奶酪成熟期間揮發(fā)性成分變化的比較分析

成熟期(0、10、20、30 d)的蒙古族木桶發(fā)酵奶酪的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果如表2 所示。共檢測(cè)出56種風(fēng)味物質(zhì)，主要包括酸類、醇類、酯類、酮類、醛類和其他類( 烯類、酚類和呋喃化合物) ，共計(jì)8 大類風(fēng)味物質(zhì)。成熟期在20 d 時(shí)，蛋白質(zhì)的水解引起揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類增加，這種變化趨勢(shì)與游離氨基酸變化情況相一致。

表2 不同成熟期木桶奶酪揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

酸類化合物是奶酪成熟過(guò)程中脂類降解、蛋白質(zhì)水解和乳糖發(fā)酵生成[20]。在不同成熟階段，對(duì)木桶發(fā)酵奶酪風(fēng)味產(chǎn)生重大影響的物質(zhì)是乙酸、丁酸、月桂酸、甲基丙二酸、辛酸、順-5-十二碳烯酸這6 種酸類化合物。其中丁酸和辛酸的風(fēng)味閾值較低，在高濃度下產(chǎn)生令人不悅的風(fēng)味給奶酪風(fēng)味品質(zhì)帶來(lái)不利影響[21]。醇類物質(zhì)是干酪中重要風(fēng)味化合物，從表2 中可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，成熟10 d 時(shí)，醇類化合物種類減少，可能是醇類物質(zhì)與酸發(fā)生反應(yīng)生成酯類，大量生成的酯類物質(zhì)可削弱由于脂肪酸產(chǎn)生的刺激味和氨基產(chǎn)生的苦味[22]。其中黃油酯包含丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯，常溫易揮發(fā)，憑借此特點(diǎn)這類物質(zhì)可對(duì)風(fēng)味產(chǎn)生較大貢獻(xiàn)[23]，是乳制品中特征風(fēng)味組分物質(zhì)，賦予奶酪香氣輪廓中的花果味，在不同成熟期木桶發(fā)酵奶酪中己酸乙酯的含量差異顯著（P<0.05），隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，己酸乙酯的含量增加。2-庚酮和2-壬酮含量差異顯著（P<0.05），2-壬酮使奶酪具有花香味、水果味和桃子味[24]；2-庚酮使奶酪呈現(xiàn)甜味，壬醛呈玫瑰香味，閾值較低，對(duì)木桶發(fā)酵奶酪的風(fēng)味有很好的修飾作用。成熟20 d 時(shí)，2-庚酮和2-壬酮的含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，對(duì)風(fēng)味的形成起到關(guān)徤作用。香茅烯在0 d 時(shí)檢測(cè)到，其主要是牛食用香草產(chǎn)生，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，在奶酪中沒(méi)有檢測(cè)到。酚類和呋喃類物質(zhì)使奶酪具有特殊的奶油香味，在成熟過(guò)程中均有檢測(cè)到。

采用主成分分析 ( principal component analysis，PCA)方法，對(duì)木桶發(fā)酵奶酪中風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量進(jìn)行分析，進(jìn)而確定其在不同成熟階段的主要風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果如圖2、圖3、圖4 所示。由圖2 可知，PC1 的貢獻(xiàn)率為34.9%，PC2 的貢獻(xiàn)率為26.9%。4 個(gè)時(shí)間段樣品中0 d 和10 d 的距離相對(duì)較遠(yuǎn)，比較分散表明樣品之間的揮發(fā)性成分存在一定的差異，20 d 和30 d 的距離相對(duì)較近，說(shuō)明這個(gè)階段的揮發(fā)性風(fēng)味基本相似。

圖2 樣品按照主成分1、主成分2 分類

圖3 木桶奶酪發(fā)酵揮發(fā)性風(fēng)味成分的負(fù)載

圖4 揮發(fā)性化合物與理化指標(biāo)的相關(guān)分析系數(shù)

對(duì)不同成熟階段的揮發(fā)性風(fēng)味化合物和理化指標(biāo)進(jìn)行了區(qū)分如圖3 所示。風(fēng)味物質(zhì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。蛋白質(zhì)、脂肪和pH 值成分在PCA 圖中橫坐標(biāo)PC1 上具有較高的載荷，說(shuō)明在成熟20～30 d 時(shí)，蛋白質(zhì)、脂肪和pH 值變化存在顯著差異。水分位于主成分PC2 的負(fù)側(cè)，說(shuō)明在0 d 時(shí)其差異顯著。作為主要風(fēng)味物質(zhì)的苯乙醇、乙酸苯乙酯、乙酸苯乙酯、肉豆蔻酸乙酯和乙酸異戊酯在20～30 d 差異顯著。10 d 時(shí)差異顯著的物質(zhì)是酯類化合物辛酸丙酯、十一酸乙酯、十三酸乙酯、棕櫚酸乙酯和辛酸異丁酯。0 d 時(shí)差異顯著的物質(zhì)是乙酸、甲基丙二酸、3-甲基-1-丁醇、2-壬醇和香茅烯。

圖4 顯示了理化指標(biāo)水分（Moisture)、蛋白質(zhì)(Protein)、脂肪(Fat)和pH 值和風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性。結(jié)果表明，水分（Moisture)含量與風(fēng)味物質(zhì)9-癸烯酸、月桂酸、3-甲基-1-丁醇、正己酸乙酯、反油酸乙酯、甲基壬基甲酮、4-甲基苯酚呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。蛋白質(zhì)(Protein)、脂肪(Fat)和風(fēng)味物質(zhì)（正己酸、辛酸、肉豆蔻油酸、丁酸、正癸酸、乳酸、異戊酸和壬酸乙酯）呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。pH 值與正己酸呈正相關(guān)（P<0.05）。

圖5 結(jié)果直觀地呈現(xiàn)了不同成熟時(shí)間段木桶發(fā)酵奶酪中56 種風(fēng)味化合物變化如圖3 所示，從圖5可知，在0 d 時(shí)，生成較多的酸類、醇類和少量酯類、酮類及其它物質(zhì)（乙酸、甲基丙二酸、甲基丙二酸、正辛酸、3-甲基-1-丁醇、2-庚醇苯乙醇、2-壬醇、乙酸壬酯、乙酸苯乙酯、十四酸乙酯、乙酸乙酯、甲基壬基甲酮、2-十三烷酮、香茅烯和4-甲基苯酚），風(fēng)味物質(zhì)呈現(xiàn)多樣化。當(dāng)成熟到第10 d 時(shí)，大量的脂類（辛酸乙酯、辛酸丙酯、壬酸乙酯、十一酸乙酯、月桂酸乙酯、十五酸乙酯、反油酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、十三酸乙酯和棕櫚酸乙酯）物質(zhì)生成，大多數(shù)酯類物質(zhì)帶有特有的花香味、濃烈的水果味以及酵母發(fā)酵香味(酒香)，其中乙酯類物質(zhì)被公認(rèn)為干酪中水果味重要的來(lái)源[25]，對(duì)干酪風(fēng)味起到了重要作用。20 d 時(shí)主要生成酸類、醇類、酯類和酮類物質(zhì)（辛酸、肉豆蔻、油酸丁酸、氧化肉桂酸、異戊酸(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇、1-壬醇、異戊醇、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、2-庚酮、2-壬酮、2-戊酮、仲辛酮），此時(shí)，會(huì)有少量香味物質(zhì)產(chǎn)生[26]。30 d 與20 d 成熟奶酪揮發(fā)性成分分布沒(méi)有顯著差異，這與兩者具有較接近的酸與酮類物質(zhì)有關(guān)。并且隨著水分的大量減少，風(fēng)味物質(zhì)含量不斷下降。由此可知：成熟時(shí)間在0 d 時(shí)食用風(fēng)味較好，20 d 時(shí)風(fēng)味物質(zhì)種類較多，此時(shí)奶酪風(fēng)味最佳，達(dá)到最佳食用狀態(tài)。

圖5 木桶奶酪各品質(zhì)指標(biāo)聚類熱圖

3 結(jié) 論

木桶發(fā)酵奶酪在成熟過(guò)程中，20 d 時(shí)游離氨基酸Asp、leu、Glu 和Pro 呈顯著增加（P<0.05），隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)含量開(kāi)始逐漸下降。水分和脂肪隨著成熟度的升高逐漸出現(xiàn)下降趨勢(shì)，蛋白質(zhì)和pH 隨著成熟度的升高逐漸出現(xiàn)上升趨勢(shì)。通過(guò)PCA 分析可知：在成熟20～30 d 時(shí)，蛋白質(zhì)、脂肪和pH 值變化存在顯著差異。水分在0 d 時(shí)差異顯著。

通過(guò)理化指標(biāo)與風(fēng)味相關(guān)性分析可知：水分（Moisture)含量與風(fēng)味物質(zhì)（9-癸烯酸、月桂酸、3-甲基-1-丁醇、正己酸乙酯、反油酸乙酯、甲基壬基甲酮、4-甲基苯酚） 呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。蛋白質(zhì)（Protein）、脂肪（Fat）和風(fēng)味物質(zhì)（正己酸、辛酸、肉豆蔻油酸、丁酸、正癸酸、乳酸、異戊酸和壬酸乙酯）呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。pH 值與正己酸呈正相關(guān)（P<0.05）。

在不同成熟時(shí)間木桶發(fā)酵奶酪共檢測(cè)出56 種風(fēng)味物質(zhì)。在0 d 時(shí)，生成較多的酸類、醇類和少量酯類、酮類及其它物質(zhì)，此時(shí)風(fēng)味較好。當(dāng)成熟到第10 d 時(shí)，大量的脂類物質(zhì)生成。20 d 時(shí)，奶酪風(fēng)味最佳，這與該時(shí)間段產(chǎn)生的酸類、醇類、酯類和酮類物質(zhì)息息相關(guān)。成熟20 d 和30 d 時(shí)揮發(fā)性成分分布沒(méi)有顯著差異，并且隨著水分的大量減少，風(fēng)味物質(zhì)含量不斷下降。