熱處理對牛乳中生物活性物質影響研究進展

寧淼，賀凱茹，楊慧，樸瑜瓊，李欣霏，姜北辰，包雨飛，武俊瑞,2

（1.沈陽農業大學食品學院，沈陽 110866；2.遼寧省食品發酵技術工程研究中心，沈陽市微生物發酵技術創新重點實驗室，沈陽 110866）

0 引 言

熱處理等手段被廣泛的應用于牛乳殺菌中。該殺菌工藝對于確保牛奶微生物安全和維持牛奶質量至關重要，但殺菌過程中伴隨著復雜的物理化學變化，會不可避免地對乳體系中活性成分的活性、結構產生不利影響。雖然之前已有研究證明添加保護劑可使一些特定物質保持生物活性并避免熱處理時失活，但加熱必然導致活性的變化，進而影響其對乳制品的功能作用[1]。因此，研究熱處理對乳中生物活性物質的影響具有重要的現實意義。

1 牛乳中的生物活性物質及其功能

1.1 乳鐵蛋白

乳鐵蛋白（lactoferrin, LF）由鐵和糖蛋白復合而成，當乳鐵蛋白含鐵量低于5%時，屬于缺鐵型乳鐵蛋白（apo-LF）；當乳鐵蛋白含鐵量高于85%時，則屬于鐵飽和乳鐵蛋白（holo-LF）。乳鐵蛋白作為功能性成分，常被用于酸奶，嬰兒配方奶粉以及膳食補充劑等多種食品中。乳鐵蛋白對許多致病菌表現出抑制作用，可與免疫球蛋白協同參與局部免疫調節，提高機體免疫力。醫藥上也有抗菌抗炎活性，抗病毒及抗癌等功效。乳鐵蛋白之所以具有廣譜抗菌活性，是因為它能螯合細菌在生長過程中需要的Fe，因而能破壞細菌細胞膜并有效抑制細菌生長。Soboleva 等[2]證實LF還具有磷酸酶、過氧化物酶和蛋白酶等活性。

1.2 免疫球蛋白

人們常常把免疫球蛋白和抗體混為一談，事實上兩者并非完全等同，免疫球蛋白包括抗體，但并不都是抗體。免疫球蛋白在常乳中占1%~2%[3]。常見的免疫球蛋白包括IgA、IgG、IgM 等，其中IgG 含量最高，占80%以上[4]。有研究認為，母乳中的IgG 可與抗原形成復合物，預防哮喘等過敏性疾病，而牛乳中IgG 是否具備上述功能還有待研究[5]。

1.3 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

在牛乳乳清蛋白中，α-乳白蛋白（α-lactalbumin,α-La）的含量占27%左右，是唯一能與Ca2+結合的營養成分[6]，其與Ca2+的結合，不僅能促進鈣的吸收，還增強了自身的穩定性。α-乳白蛋白在氨基酸比例、結構及功能特性方面與人乳非常相似，將其添加到母乳中有助于嬰兒的生長發育[7]。

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-Lg）含量約占乳清蛋白的50%，是氨基酸的重要來源，有利于蛋白質的合成。迄今為止，對β-乳球蛋白的研究主要集中在營養功能、分子結構、熱特性以及在保健食品開發中的應用等方面。隨著研究的不斷深入，β-乳球蛋白的價值將會被人們更好的挖掘利用。牛乳中生物活性蛋白的主要功能如表1 所示。

表1 生物活性蛋白的主要功能

1.4 乳過氧化物酶

乳過氧化酶（lactoperoxidase, LPO）可與過氧化氫、硫氰酸根形成乳過氧化物酶體系，參與宿主防御系統的構成，以抵抗微生物的侵害，延長乳制品的貨架期。LPO 具有廣譜抗菌性，可阻止過氧化物的累積，減少致癌物的產生，對免疫系統有一定的保護作用[9-10]。

1.5 不飽和脂肪酸

牛乳中含有少量不飽和脂肪酸，是機體不可缺少的營養成分，其含量與奶牛泌乳期和胎次有關[11]。包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、α-亞麻酸（αlinolenic acid, ALA）和共軛亞油酸（conjugated linoleic acid, CLA）等。影響牛乳中不飽和脂肪酸的因素及其功能如表2 所示。

表2 影響牛乳中不飽和脂肪酸的因素及其功能

1.6 生長因子

牛乳中的生長因子大多為多肽類物質，具有耐熱性。有些重要生長因子的化學成分與人乳中的相似。牛乳中的生長因子主要包括表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）、胰島素樣生長因子（insulin like growth factor, IGF）、轉化生長因子-β（transforming growth factor beta, TGF-β）和β細胞素（betacellulin,BTC）等，作用如表3 所示，其中表皮生長因子、胰島素樣生長因子-1（IGF-1) 以及轉化生成因子-β1（TGF-β1）含量較高。在奶牛產犢后的一個小時內，生長因子在牛初乳中的含量達到最高，之后會隨著產犢時間的增加而降低。

表3 牛乳中主要生長因子的作用

2 熱處理對牛乳中乳鐵蛋白的影響

乳鐵蛋白含量和活性的變化是加工過程中的一個主要問題[16]。通過對牛乳LF 在72～85 ℃變性一級反應動力學進行研究，發現apo-LF 較holo-LF 易變性，這可能是由于鐵離子的結合使LF 二硫化物發生結合從而阻止蛋白聚合所致，同時利用熱誘導的動力學參數證實，LF 在變性過程中受鐵結合狀態的影響，使apo-LF 與holo-LF 構象發生獨立擴展，apo-LF 在60 ℃左右時發生變性，其暴露的非共價鍵位點與二硫鍵形成非共價鍵聚合體。而含鐵量高的holo-LF 結構較穩定，在80 ℃條件下可與二硫鍵反應，生成可溶性聚合體，說明蛋白質一定程度上的變性會影響其構象穩定性，結果損失部分活性，或造成聚集，沉淀而失去作用[1]。

Franco 等[17]研究證明，巴氏殺菌不影響乳鐵蛋白與細菌之間的相互作用能力，并且對乳鐵蛋白的結構沒有產生影響；而超高溫瞬時殺菌（Ultra-high temperature instantaneous sterilization, UHT）處理可不同程度地降低乳鐵蛋白與細菌的相互作用能力。劉海燕[18]通過實驗得出，在90 ℃/15 s 熱處理條件下，乳鐵蛋白的檢出量極低；當熱處理溫度高于95 ℃時，乳鐵蛋白的降解率達到了100%。Liu 等[19]發現在巴式殺菌條件下，中國牛奶LF 的活性保留率低于新西蘭牛奶，可能是由于LF 鐵飽和度不足而造成的。

3 熱處理對牛乳中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的影響

3.1 熱處理導致的含量和活性的變化

β-乳球蛋白作為牛乳中對熱不穩定的一類營養物質，加熱過程中會發生一系列變化。Lan 等[20]認為，溫度決定著β-乳球蛋白的變性，牛乳經105 ℃/15 s熱處理后檢測到其含量僅為0.07 mg/mL，溫度升至115 ℃時，β-乳球蛋白已經完全變性。

β-乳球蛋白包括2 種變異體A 和B(β-LgA、β-LgB)。其中β-lgB 對熱最敏感，β-lgA 次之，α-乳白蛋白耐熱性最強。孫琦等[21]研究表明，隨著熱處理溫度的提高，ɑ-乳白蛋白、β-lgA 和β-lgB 含量逐漸降低，β-lgA 和β-lgB 分別在125 ℃、95 ℃時已無法檢出，而ɑ-乳白蛋白在UHT 滅菌溫度下依然存在。這也證實了Lan 等人的研究結果。此外，對比巴氏殺菌和UHT 殺菌處理方式發現，低溫長時間巴氏殺菌對β-Lg 和α-La 的熱損傷小于高溫短時間巴氏殺菌，且經巴氏殺菌后低溫存放的鮮牛奶能最大程度的保留α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，UHT 乳中α-La 和β-Lg 含量最低[22-24]。通過對比不同種類的乳發現牛乳中α-乳白蛋白的耐熱性不如駱駝奶，變性溫度也較低。在90 ℃，5 min 的處理條件下，駱駝奶中有33%的α-乳白蛋白變性，而牛乳中卻有95%的α-乳白蛋白變性[25]。

3.2 熱處理導致的聚合物的形成

對牛乳進行熱處理可導致乳清蛋白之間及乳清蛋白與酪蛋白之間發生聚合反應。當溫度為75 ℃時，巰基團因β-乳球蛋白的去折疊化而裸露，與具有二硫鍵的游離κ-酪蛋白發生巰基-二硫化物交換反應，形成β-乳球蛋白與κ-酪蛋白復合物。而且，活化的β-乳球蛋白可產生硫化氫，使牛乳具有“烹調味”而影響口感[22]。

α-La 熱變性的本質是蛋白結構的去折疊化，暴露出分子內部的二硫鍵。雖然α-乳白蛋白不含游離—SH，但其中的S—S 被破壞后會與含有游離—SH的β-乳球蛋白聚合形成復合物，具有與κ-酪蛋白反應的趨向，由于β-Lg 具有游離巰基，在很大程度上決定了乳清蛋白在牛乳中的熱變性和聚集，因此這種聚合以β-Lg 為主，α-La 為輔。α-La/β-Lg 聚集體形成后，具有活性—SH 的β-Lg 與κ-CN 結合，同時實現了α-La 與酪蛋白的反應。可見α-La、β-Lg 與酪蛋白膠束之間的聚集體形式，一種是β-Lg 聚集體與κ-CN 結合，另一種是α-La/β-Lg 聚合物與κ-CN結合[26]。

4 熱處理對乳中免疫球蛋白的影響

國內外研究學者對免疫球蛋白的熱穩定性展開了相關研究。發現免疫球蛋白的熱變性是一個展開又聚合的過程，對其肽鏈的展開及構象變化有不同程度的影響。在低溫下，三級結構可能發生展開，但一些展開的區域可能是可逆的。此外，研究發現在75~77 ℃條件下，溫度每升高1 ℃，免疫球蛋白損失15%~30%[27]。在探究牛初乳中IgG 在不同熱處理條件下的變化規律時，發現牛初乳經過55 ℃、30 min 的熱處理后，IgG 含量明顯下降，之后經一系列熱處理條件后，均低于牛初乳中的IgG 水平[28]。這可能是由于熱處理后IgG 分子變形或展開所致。與Fc 段相比，IgG 中Fab 段的CH區不穩定，容易展開，導致Fab 段結構改變，IgG 活性喪失。

楊紅等[29]曾在研究中闡述，IgG 的耐熱程度與IgG的純度密切相關，純度越低，耐熱性越好。而IgG 變性程度與加熱溫度和時間成正比，即熱處理溫度越高、時間越長，其變性程度越高。UHT 和加熱蒸發幾乎能完全破壞IgG 的活性，而HTST 殺菌和間歇式巴氏消毒處理后的IgG 活性僅損失0.5%~10%。任璐[30]在傳統高溫熱殺菌、蒸汽浸入式殺菌、膜過濾結合巴氏殺菌對ESL 牛乳品質的影響的實驗中表明，膜過濾結合72 ℃、15 s 的殺菌能更好地保留IgG。

5 熱處理對牛乳中乳過氧化物酶的影響

乳過氧化物酶的熱穩定性高于其他乳中的內源酶。Lorenzen 等[31]對乳過氧化物酶活性在不同溫度下的變化進行了研究，發現牛乳中的LPO 活性隨著溫度的升高而不斷下降，經過65 ℃、90 s 加熱后其活性約為原料乳的65%，原料乳經過75、85 ℃加熱90 s后，LPO 活性已不足原料乳的0.17%。

此外，也有一些研究通過測定牛乳中LPO 不同溫度下的D 值和Z 值來反映其活性，且結果存在一定差異。Tayefi-Nasrabadi 等[32]研究了熱處理對牛乳中LPO 的影響，用D 值和Z 值表示。研究發現，牛乳中LPO 活性在67、69、71 ℃和73 ℃的D 值依次降低，Z 值為4.7 ℃。Loredana 等[33]分析了牛乳中LPO在70~77 ℃條件下的活性變化。發現LPO 活性的D值隨著溫度的升高而逐漸降低，Z 值約為3.58 ℃。LPO 鈍化溫度的差異與牛乳樣品中的脂肪含量有關，也可能與酸度有關，因為LPO 在酸性條件下熱穩定性差，關于這一假設仍需要進一步驗證。

Wendie 等[34]報道經過72 ℃、15 s 的巴氏殺菌，LPO的活性為加熱前的70%，經過UHT 處理后LPO 沒有活性。純化分離的LPO 經70 ℃、15 min 殺菌后，LPO依然是穩定的，但在78 ℃、15 s 時完全失活。對乳過氧化物酶不同工藝下的活性進行研究，發現其在75 ℃、15 s 的條件下可檢測到較高的乳過氧化物酶活性[35]，而經85 ℃或125 ℃處理15 s 后基本檢測不出活性。

6 熱處理對牛乳中生長因子的影響

生長因子的熱變性變化與其分子結構有關，分子具有很強的疏水性，這有利于自身聚合和與其他蛋白質的非特異性相互作用。巴氏殺菌處理下，乳中的生長因子濃度較高，較高溫度下，生長因子多數與牛乳中高分子質量的蛋白質結合，并且以潛在的形式存在。

熱處理可以激活生長因子，Pia 等[36]發現，牛乳經過65 ℃和72 ℃加熱15 s 后，IGF-I 的濃度較原料乳高，當原料乳經過90 ℃、15 s 的熱處理后，IGF-I 的濃度急劇增加，而經過135 ℃、15 s 加熱后，IGF-I 活性降低，進而指出90 ℃加熱可以激活IGF-I。Kang 等[37]研究發現，在原料乳中添加凍干的初乳乳清粉能夠增加IGF-I 的水平，經過75 ℃和85 ℃加熱15 min 后，其濃度降低，分別為加熱前的45.05%和45.25%；經過121 ℃、15 min 的熱處理后牛乳中沒有檢測出IGF-I活性。Yun 等[38]研究表明，IGF-I 在UHT 乳中比一些生物活性蛋白的熱穩定性還要強。

7 熱處理對牛乳中不飽和脂肪酸的影響

熱處理決定乳中不飽和脂肪酸的濃度和氧化程度。研究發現HTST 和UHT 處理對牛乳中CLA 和ALA 的濃度沒有影響[39]。然而，Xu 等[40]人發現，與生牛乳相比，UHT 牛奶中的不飽和脂肪酸濃度降低了53%。Dias 等[41]研究中表明，HTST 和UHT 處理后的牛乳中亞油酸和a-亞麻酸的氧化產物濃度比它們在生牛乳中的氧化產物濃度低51%~64%，這是因為它們又生成了二級氧化產物。

8 展 望

目前，國內外研究者已對牛乳中生物活性物質的種類和功能進行了較為全面的研究。而本文對牛乳中生物活性化物質在熱處理后的變化進行了較為詳細的論述，為牛奶生物活性物質的應用提供了參考。但加熱過程中生物活性物質活性變化的分析與研究仍主要集中于活性的比較方面，同時對這些活性物質在熱處理后的生物可及性和生物利用度還沒有充分的了解和研究，在此基礎上還需要更多的體外和體內研究來了解牛乳的熱處理對人體健康的影響。此外，還可以對牛乳的熱處理方法進行創新，以生產具有豐富營養價值和生物活性成分的乳制品。