茉莉葉總黃酮不同提取方法比較及其抑菌活性研究

范麗麗林翠英林嘉琦梁瀅聶旭蓮陳儀新詹源菲

(1.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫濕病方藥理論與轉化重點實驗室，廣西 南寧 530200；3.農作物廢棄物功能成分研究協同創新中心，廣西 南寧 530200；4.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011；5.5.鄭州大學公共衛生學院，河南 鄭州 450001；6.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；7.廣西中醫藥大學學科建設辦公室，廣西 南寧 530200)

茉莉葉為木犀科素馨屬植物茉莉[Jasminum sambac(L.)Ait.]的葉，茉莉花是廣西區域特色藥材，廣西橫州市是我國茉莉花的主產地區。茉莉花的根、葉、花均有藥用價值。其中，茉莉葉性辛、涼，歸肺、胃經，具有清熱解表、消腫止痛功效，常被用于治療外感發熱、腹脹腹瀉、毒蟲蟄傷等病癥。茉莉葉含有多種化學成分，目前研究發現，主要包括三萜類、黃酮類、酚類等化學成分[1]，其中，黃酮類化合物更可能是其主要藥效成分。目前對茉莉葉總黃酮的研究主要在提取工藝的優化和其抗氧化作用方面，提取方法有乙醇浸提法[2]、超聲乙醇回流提取法[3]、超聲乙醇浸提法[4]，暫未見有超聲聯合酶解法來提取茉莉葉總黃酮。超聲聯合酶解法是近年來從植物中提取總黃酮中應用較為普遍的方法[5]。因此，本文以超聲提取法為實驗對照，比較超聲聯合酶解提取方法的總黃酮提取率，得出提取茉莉葉中總黃酮的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茉莉葉，采摘自廣西橫州市，經廣西中醫藥大學藥用植物教研室汝梅博士鑒定為正品；蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所；纖維素酶，河南萬邦化工科技有限公司；果膠酶，河南萬邦化工科技有限公司；一水合檸檬酸，分析純，成都金山化學試劑有限公司；硝酸鋁，分析純，天津市大茂化學試劑廠；檸檬酸三鈉二水，分析純，成都市科隆化學品有限公司；95%乙醇，成都市科隆化學品有限公司；亞硝酸鈉，分析純，天津博迪化工有限公司；氫氧化鈉，分析純，天津市大茂化學試劑廠；大豆蛋白胨，北京索萊寶科技有限公司；酵母膏，北京奧博星生物有限責任公司；葡萄糖，分析純，天津市永大化學試劑有限公司；硫酸慶大霉素注射液，河南潤弘制藥股份有限公司。

1.2 儀器與設備

超聲清洗機，YT1030型，深圳云奕科技股份有限公司；數顯恒溫水浴鍋，HH-4型，常州國華電器有限公司；粉碎機，QE-10型，浙江屹立工貿有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，DNG-905310型，上海精宏實驗設備有限公司；電子天平，BSA224S型，賽多利斯科學儀器；紫外可見分光光度計，759S型，上海儀電科學儀器股份有限公司；pH計，PHS-3E型，上海儀電科學儀器股份有限公司；循環水真空泵，SHZ-D(Ⅲ)型，邦西儀器科技(上海)有限公司；低速多管架自動平衡離心機，TDZ5-WS型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，YXQ-LS-50S11型，上海迅實實業有限公司醫療設備廠；恒溫培養振蕩器，ZWY-240型，上海智誠分析儀器制造有限公司；生化培養箱，LRH-250A型韶關市泰宏醫療器械有限公司；潔凈工作臺，SW-CJ-1F型，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 茉莉葉總黃酮提取工藝優化

選擇無破損的新鮮茉莉葉，放入鼓風式恒溫干燥箱，60℃下烘干2h，放入粉碎機進行粉碎成粉，過100目篩，存放于保鮮袋中。稱量1.0000g茉莉葉干粉于燒杯中，分別采用超聲提取法和超聲聯合酶解法按照正交設計對茉莉葉總黃酮進行單次提取，考察其提取率。采用硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 標準曲線的制作

精密吸取已經配制好的蘆丁對照液(0.10mg·mL-1)0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL于容量瓶中，加0.30mL 5%NaNO2溶液，靜置6min，加0.30mL 10%Al(NO3)3溶液，靜置6min，4.00mL 4%NaOH溶液，滴加60%乙醇至刻度搖勻，靜置12min，利用紫外分光光度計于510nm處測定其吸光度，每個平行測3次[4]。所得到的回歸方程：

y=10.98x-0.0133，R2=0.9996

式中，y為吸光度；x為蘆丁標準液濃度，mg·mL-1。

1.3.2.2 茉莉葉總黃酮的含量測定

精確吸取0.5mL離心后得到的上層清液于10mL容量瓶中，用相應體積分數的乙醇溶液定容。按照1.3.2.1標準曲線繪制項下的顯色方法，測量每個樣品的吸光度值，依據得到的標準曲線回歸方程計算樣品中的總黃酮含量，計算茉莉葉中總黃酮的提取率，公式：

總黃酮得率/%=(nCV/1000m)×100%[6]

式中，C為總黃酮質量濃度，mg·mL-1；n為提取液稀釋倍數；V為提取液的體積，mL；m為茉莉葉的質量，g。

1.3.2.3 單因素實驗設計

具體見表1～3。

表2 超聲提取法單因素實驗因素水平

表3 基于超聲提取法最優工藝聯合酶解單因素實驗因素水平

1.3.2.4 正交實驗設計

具體見表4、表5。

表4 超聲提取法正交實驗因素水平

表5 超聲提取法正交實驗因素水平

表6 基于超聲提取法最優工藝聯合酶解正交實驗因素水平

1.3.3 茉莉葉總黃酮抑菌活性實驗

1.3.3.1 最小抑菌濃度(MIC)測定

測定方法采用微量肉湯稀釋法，用排槍將液體培養基100μL加到96孔板A-D排的1～12孔，取茉莉葉總黃酮提取液100μL加到96孔板A～D排的第1孔，用移液槍連續吹打混勻后，再取100μL加入第2孔，反復進行2倍稀釋至第10孔，第10孔混勻后吸取100μL棄去。將菌懸液分別加到96孔板B-D排1～11孔，充分混合均勻加蓋，A排為陽性對照，B～D排為3組平行對照，只加提取液和培養基的第11孔作陽性對照，觀察該濃度的菌液在培養期間是否生長良好；加100μL培養基的第12孔作陰性對照，用以觀察培養基在實驗操作期間是否被污染；在37℃恒溫培養箱中培養24h，觀察實驗組和對照組菌液生長情況并計算MIC[7-10]。

1.3.3.2 紙片擴散法

紙片擴散法，將直徑為6mm的圓形藥敏紙片放入干凈的三角瓶用封口膜封上，在高壓蒸汽鍋中滅菌20min后烘干，分別浸入濃縮的茉莉葉總黃酮提取液、慶大霉素、無菌水中充分吸收；移液槍移取100μL菌懸液到固體培養基表面，用涂布棒均勻涂布，在平板底部分成4個區域并作標記；將含有茉莉葉總黃酮提取液的紙片貼于平板，用含有慶大霉素和無菌水的紙片分別作陽性對照和空白陰性對照，重復3組試驗，完成后將平板放置到4℃的冰箱中使之充分滲透2h后，取出倒置在恒溫培養箱中，37℃，培養24h，觀察結果并采用“十字交叉法”測量抑菌圈直徑[7]。

2 結果與分析

2.1 超聲提取法單因素實驗

具體見圖1。

圖1 超聲提取法單因素實驗

2.2 超聲聯合酶解法提取法單因素實驗

具體見圖2。

圖2 超聲聯合酶解法提取法單因素實驗

2.3 基于超聲提取法最優工藝聯合酶解單因素實驗

具體見圖3。

圖3 基于超聲提取法最優工藝聯合酶解單因素實驗

2.4 超聲提取法提取總黃酮的最佳工藝

在單因素實驗結果的基礎上，以料液比、乙醇體積分數和超聲時間為考察因素，在功率600W、頻率40kHz、60℃的條件進行超聲后，4000r·min-1離心10min，按照1.3.2.1的方法進行總黃酮含量測定。選擇L9(34)正交正交設計實驗，結果見表7，方差分析見表8。

表7 正交L9(34)實驗結果

表8 方差分析表

由表7可知，使用超聲提取法提取時，影響提取率的主次順序為C>B>A，最佳組合為A2B2C3，即最佳工藝條件為提取時間4.5h，料液比1∶45，乙醇體積分數為85%。由表8可知，A、B、C三者對實驗結果均有顯著性影響(P<0.05和P<0.01)，其中料液比和乙醇體積分數對本實驗結果影響有極顯著差異。

2.5 超聲聯合酶解法提取總黃酮的最佳工藝

在單因素實驗結果的基礎上，以酶解pH、料液比、乙醇體積分數和超聲時間為考察因素。在纖維素酶∶果膠酶=1∶1(添加量為8%)，50℃下酶解75min，使用超聲法進行提取，超聲功率為600W，頻率為40kHz，溫度為60℃，按照1.3.2.1的方法進行總黃酮含量測定。根據L9(34)正交表設計正交實驗，結果見表9，方差分析見表10。

表9 正交L9(34)實驗結果

表10 方差分析表

由表9可知，使用超聲聯合酶解法提取時，4個因素中影響提取率的主次順序為A>C>B>D，最佳組合為A3B3C2D1，即最佳提取工藝條件為酶解的pH為6，料液比為1∶50，乙醇體積分數75%，超聲1.5h。由表10可知，A、B、C、D 4個因素對本實驗均有顯著性影響(P<0.01)，其中酶解pH、料液比和乙醇體積分數對本實驗結果影響最大。

2.6 基于超聲提取法最優工藝聯合酶解正交實驗

在單因素實驗結果的基礎上，以2.4中超聲提取法的最優工藝為基礎條件，以酶用量、酶解時間、酶解溫度為考察因素，按照1.3.2.1的方法進行總黃酮含量測定。根據L9(34)正交表設計正交實驗，結果見表11。

表11 正交L9(34)實驗結果

2.7 提取方法比較

通過正交實驗優化的結果可以看出超聲提取法的最優組合A2B2C3，基于超聲最優條件下聯合酶解法的最優組合為A3B1C3，分別進行單次提取每組實驗重復3次，取平均值，結果見表12。

表12 茉莉葉總黃酮不同提取方法的提取率比較

表13 茉莉葉總黃酮的抑菌圈直徑

由表12可知，以超聲提取法和超聲聯合酶解法的提取率分別為1.80%和3.63%，即使用超聲提取法基礎上聯合酶解提取茉莉葉總黃酮得率較高。

2.8 茉莉葉總黃酮抑菌活性

茉莉葉總黃酮的MIC為2.30mg·mL-1。抑菌圈直徑的測量采用“十字交叉法”，每組抑菌試驗使用游標卡尺對其進行3次測量取平均值。判定標準：抑菌圈直徑≥20mm為高度敏感；10～19mm為中度敏感；10mm以下為不敏感。茉莉葉總黃酮含量為36.85mg·mL-1時的抑菌圈直徑為16.6±0.50mm，>10mm，故茉莉葉總黃酮含量為36.85mg·mL-1對金黃色葡萄球菌有中度敏感的抑制作用。

3 結論與結論

超聲提取法、超聲聯合酶解法和基于超聲提取法最優工藝聯合酶解法提取茉莉葉總黃酮的最佳工藝：超聲提取法，料液比1∶45，乙醇體積分數為85%，提取時間4.5h；超聲聯合酶解法，酶解pH為6，料液比為1∶50，乙醇體積分數75%，超聲時間1.5h；基于超聲提取法最優工藝聯合酶解法，酶用量為5%，酶解時間為90min，酶解溫度為65℃。超聲聯合酶解法與超聲提取法提取率相差不大，但超聲聯合酶解法提取率所用的提取時間相對更短，可節約成本。基于超聲提取法最優工藝聯合酶解法可使提取率從1.80%提升至3.63%，表明基于超聲提取法最優工藝聯合酶解法可提升茉莉葉總黃酮提取率。對茉莉葉總黃酮進行抑菌活性測定，其含量為36.85mg·mL-1時的抑菌圈直徑為16.6±0.50mm，MIC為2.30mg·mL-1，說明茉莉葉總黃酮具有一定的抑菌活性。

黃酮作為重要的植物天然活性成分，資源豐富易于提取，且具有廣泛的藥理活性，目前還有將黃酮添加進化妝品、健康食品等研究，茉莉花作為廣西區域特色藥材，資源豐富但茉莉葉利用率較低，常作為農作物廢棄物進行丟棄，造成大量資源浪費。本研究僅對茉莉葉總黃酮的提取工藝、抑菌活性進行了考察，后續還將進行黃酮成分鑒定，并結合體內實驗研究探尋其物質基礎和作用機制，為其在健康產品及醫藥行業的綜合開發利用奠定基礎。