蜂王漿主蛋白研究進(jìn)展

秦凱鑫,潘露霞,王子龍*

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所,南昌 330045; 2. 江西省蜜蜂生物學(xué)與飼養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌 330045)

蜂王漿是蜜蜂工蜂頭部咽下腺和上顎腺分泌的淡黃色漿狀物(Knecht and Kaatz, 1990)。只有蜂王和3 d內(nèi)的幼蟲被飼喂蜂王漿,因此,蜂王漿被認(rèn)為是影響雌性蜜蜂級(jí)型分化的主要因素(Buttstedtetal., 2014)。蜂王漿中含有60%～70%水,12.5%粗蛋白,10.16%糖,3%～6%脂類,2%～3%維生素、鹽和游離氨基酸等(Albertetal., 1999)。其中,王漿主蛋白是蜂王漿中水溶性蛋白,為蜂王漿中蛋白質(zhì)的主要成分,占總蛋白含量的46%～89%(Schmitzovetal., 1998)。MRJPs家族一共有9個(gè)成員,依次命名為MRJP1～MRJP9。本文主要對(duì)近幾年王漿主蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,為今后開展相關(guān)研究提供幫助。

1 MRJPs家族鑒定

對(duì)蜂王漿中蛋白的研究始于1960年,Patel等人通過電泳分析蜂王漿中的蛋白質(zhì),其目的是為了研究幼蟲食物中蛋白質(zhì)與接受食物時(shí)幼蟲的年齡和級(jí)型分化之間的關(guān)系,結(jié)果顯示,與1～3齡幼蟲相比,工蜂和雄蜂第4～6齡幼蟲食物缺少水溶性蛋白質(zhì)(Pateletal., 1960)。由于最初人們是通過分子量或者發(fā)現(xiàn)順序?qū)Ψ渫鯘{中蛋白質(zhì)命名的,這就導(dǎo)致相同的蛋白質(zhì)卻有不同的名字(Kuboetal., 1996; Scarsellietal., 2005)。1992年,imuith等人首次發(fā)現(xiàn)蜂王漿中分子量為57 kDa的蛋白質(zhì),該蛋白在蜂王漿中最為豐富,被命名為“MRJP”,后被命名為MRJP1(Hanes andimuith, 1992)。MRJP2～5是通過其cDNA的克隆測(cè)序鑒定的(Klaudinyetal., 1994; Schmitzovetal., 1998; Albertetal., 1999),而MRJP6～8是通過蜜蜂腦表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)文庫進(jìn)行同源搜索而檢測(cè)到的(Albert and Klaudiny, 2004)。之后人們將蜜蜂咽下腺和毒囊進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)一個(gè)蛋白水解片段,通過克隆測(cè)序證實(shí)是MRJP9(Albert and Klaudiny, 2007)。9個(gè)mrjps編碼基因均在蜜蜂11號(hào)染色體上(Honeybee Genome Sequencing Consortium, 2006),所有mrjps以串聯(lián)排列的形式位于一個(gè)大約60 kb的DNA片段上(Drapeauetal., 2006),各成員之間的核酸序列和氨基酸序列均具有較高的相似性(Helbingetal., 2017)。mrjp基因簇兩側(cè)是編碼YELLOW家族蛋白的5個(gè)基因,基因組區(qū)除了 9個(gè)轉(zhuǎn)錄的mrjps外,中間還有1個(gè)非轉(zhuǎn)錄的偽基因mrjp-ψ(Drapeauetal., 2006)。

2 MRJPs家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

成熟的MRJPs由400～578個(gè)氨基酸組成,其分子量在45～68 kDa之間(Buttstedtetal., 2014)。MRJP1～5富含10種必須氨基酸,且MRJP1～5是蜂王漿中最為豐富的蛋白質(zhì),占90%,說明MRJP1～5具有營(yíng)養(yǎng)作用(Schmitzovetal., 1998)。MRJPs家族各成員N端含有信號(hào)肽序列,因此被認(rèn)為是分泌蛋白(Klaudinyetal., 1994)。所有成員共享4個(gè)保守半胱氨酸殘基和幾個(gè)高度保守氨基酸區(qū)域,半胱氨酸殘基會(huì)形成二硫鍵(Buttstedtetal., 2014)。MRJPs剛合成時(shí)pH值為7.0,在飼喂幼蟲之前,工蜂會(huì)將其與上顎腺分泌的脂肪酸混合,使得蜂王漿pH值為4.0,MRJPs在酸性pH值中更穩(wěn)定,pH值為4.0～4.5時(shí)穩(wěn)定性最高(Murean and Buttstedt, 2019)。

MRJPs中具有重復(fù)區(qū)域。Su等人研究發(fā)現(xiàn),MRJP2的C端具有9個(gè)五肽重復(fù)區(qū)域(Suetal., 2005)。MRJP3在編碼區(qū)C端具有可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)區(qū)域,該區(qū)域被認(rèn)為是導(dǎo)致蛋白質(zhì)多態(tài)性的位點(diǎn)(tefanetal., 1999)。MRJP5在367和540氨基酸殘基之間具有廣泛重復(fù)區(qū)域,重復(fù)三肽基序共出現(xiàn)58次,其中MRJP3和MRJP5的兩個(gè)重復(fù)區(qū)域共同特征是帶正電的精氨酸/賴氨酸殘基和帶負(fù)電的天冬氨酸殘基有規(guī)律的出現(xiàn)(Albertetal., 1999)。由于MRJPs的重復(fù)區(qū)域中含有大量的富含氮的氨基酸,這顯著增加MRJPs中氮含量,因此重復(fù)區(qū)域也被認(rèn)為是生物加工形式儲(chǔ)存氮的結(jié)構(gòu)域(tefanetal., 1999)。

Klaudiny等人認(rèn)為MRJP3和MRJP4存在潛在的N端糖基化和磷酸化位點(diǎn),并首次提出MRJPs可能具有翻譯后修飾(Klaudinyetal., 1994)。Zhang等人通過雙向凝膠電泳(2-DE)、鳥槍法分析、高效液相色譜-電噴霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)蜂王漿的翻譯后修飾進(jìn)行分析,檢測(cè)到MRJP1和MRJP2具有磷酸化位點(diǎn),并且MRJP1～5還存在甲基化或脫酰胺化(Zhangetal., 2012)。此外,MRJP1和MRJP2都被檢測(cè)出具有糖基化位點(diǎn)(Bílikovetal., 2009; Kimuraetal., 2010)。如今,MRJP1～9被檢測(cè)出具有11～35個(gè)磷酸化和1～8個(gè)糖基化位點(diǎn)(Buttstedtetal., 2014)。如此多的數(shù)據(jù)證明MRJPs具有翻譯后修飾,形成許多MRJP的異構(gòu)體。

MRJP1的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有9.6%的α螺旋,38.3%的β折疊和20%的β轉(zhuǎn)角,并且是一種高度穩(wěn)定的蛋白質(zhì)(Cruzetal., 2011)。Watanabe等人將MRJP1溶解于磷酸鹽緩沖生理鹽水中,在不同溫度中加熱30 min,結(jié)果表明,60℃熱處理不會(huì)影響MRJP1的生長(zhǎng)刺激活性(Watanabeetal., 1998)。但是MRJP1是一種鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白(Calbriaetal., 2008),鈣離子會(huì)改變MRJP1構(gòu)象,使其易受溫度和pH值的影響(Cruzetal., 2011)。MRJP1具有獨(dú)特的六葉β螺旋折疊,即MRJP1被折疊成1個(gè)六葉β螺旋槳形狀,其中具有31條β鏈和11條α螺旋,中間還有一個(gè)通道(Tianetal., 2018)。六葉結(jié)構(gòu)里有3個(gè)二硫鍵,其中2個(gè)二硫鍵的半胱氨酸殘基在MRJPs家族成員中是保守的,這2個(gè)二硫鍵對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性至關(guān)重要(Tianetal., 2018)。MRJP1會(huì)與apisimin形成高濃度的長(zhǎng)脂蛋白纖維結(jié)構(gòu)(MRJP14-apisimin4-24-methylenecholesterol8),增加蜂王漿的粘度,使幼蟲不會(huì)從王臺(tái)中掉落(Buttstedtetal., 2018)。Apisimin是蜜蜂特有的一種富含絲氨酸-纈氨酸的多肽,具有形成寡聚體的傾向(Bílikovetal., 2002)。通過低溫電子顯微鏡可以觀察到這種纖維結(jié)構(gòu)是由4個(gè)MRJP1組成的外殼,內(nèi)部有4個(gè)apisimin,中間是8個(gè)被緊密包裹的脂質(zhì)(Matteietal., 2020),分子之間通過疏水作用和氫鍵鏈接,而apisimin分子是將復(fù)合物連接在一起的關(guān)鍵橋梁(Tianetal., 2018)。這種纖維結(jié)構(gòu)在pH值為4.0時(shí),各單元之間靜電斥力降低,使其更加穩(wěn)定,而另一方面是帶正電的His294與相鄰的Asp292之間可能具有靜電引力,因?yàn)锳sp292在pH值為4.0時(shí)部分帶負(fù)電荷(Matteietal., 2020)。雖然對(duì)MRJP1的二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定了解,但是MRJPs家族其他成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)研究卻少之又少。

3 MRJPs在蜂產(chǎn)品中分布

迄今為止,許多研究者對(duì)蜜蜂的蜂王漿進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析,所有MRJPs家族成員都能在蜂王漿中檢測(cè)出來(Schmitzovetal., 1998; Sanoetal., 2004; Santosetal., 2005; Sch?nlebenetal., 2007)。MRJPs家族各成員在蜂王漿中含量差異非常大,其中,MRJP1～5在蜂王漿中含量較多,尤其是MRJP1,其所占比例為31%(Hanesetal., 1992)。除此之外,MRJPs也可以在其他蜂產(chǎn)品中檢測(cè)到。Rossano等人在蜂蜜中檢測(cè)到MRJP1～3相對(duì)應(yīng)的多肽(Rossanoetal., 2012)。Silva等人用非靶向LC-ESI-Triple-TOF-MS/MS鑒定甘露蜜中MRJPs,通過LC-QqQ-MS/MS對(duì)蜂蜜中MRJPs標(biāo)記多肽進(jìn)行定量分析,結(jié)果表明,MRJP4中標(biāo)記肽(QNIDVVAR)的含量可以作為區(qū)分甘露蜜和花蜜的指標(biāo)(Silvaetal., 2020)。MRJP1和MRJP2也在蜜蜂粉脾中被檢測(cè)到(Scarsellietal., 2005)。MRJP8和MRJP9在蜜蜂毒液和假定的過敏原中被鑒定出來(Blanketal., 2012)。因此,不論是蜂王漿還是其他蜂產(chǎn)品都可以檢測(cè)到MRJPs。

4 mrjps家族的表達(dá)

4.1 mrjps在蜜蜂體內(nèi)的表達(dá)

mrjps在蜜蜂多個(gè)組織中均有表達(dá)。Dobritzsch等人通過qRT-PCR和定量質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),工蜂咽下腺和大腦中mrjp1～5和mrjp7的表達(dá)具有年齡依賴性,即mrjps的表達(dá)在哺育蜂時(shí)期上調(diào),而在采集蜂時(shí)期下調(diào),并且咽下腺中的相對(duì)豐度高于大腦(Dobritzschetal., 2019)。哺育蜂的任務(wù)是飼喂幼蟲,其咽下腺mrjps表達(dá)顯著高于采集蜂,從側(cè)面證明MRJPs具有營(yíng)養(yǎng)功能(Fengetal., 2009)。但是蜜蜂咽下腺細(xì)胞具有靈活性,隨著日齡增加,蜜蜂將不再哺育而是出門采集花粉、蜜和樹脂等,若蜂群需要,采集蜂將重新激活腺泡,合成與分泌MRJPs,哺育幼蟲(Ohashietal., 2000)。不僅僅是工蜂,mrjps在蜂王和雄蜂的頭部、胸部和腹部都有表達(dá),其中mrjp1～7在工蜂頭部表達(dá)更為顯著(Buttstedtetal., 2013)。李曉燕等人研究表明mrjp6在蜜蜂幼蟲和蛹期時(shí)表達(dá)量較低,而三型蜂中,蜂王與工蜂的表達(dá)量顯著高于雄蜂(李曉燕等,2016)。李江紅等人發(fā)現(xiàn)mrjp8在工蜂毒腺組織內(nèi)表達(dá)量高,而雄蜂體內(nèi)表達(dá)量最低,這可能暗示mrjp8與工蜂防御有關(guān)(李江紅等,2014)。有趣的是,mrjp9表達(dá)與其他的mrjps不同,其在蜂王和工蜂的頭部、胸部、腹部表達(dá)都很高,因此MRJP9被認(rèn)為是最古老的王漿主蛋白(Buttstedsetal., 2013)。

4.2 外界因素對(duì)mrjps表達(dá)的影響

mrjps及蛋白質(zhì)的表達(dá)會(huì)受到外界因素影響。在食物中添加20-羥基蛻皮酮(20E)后,蜜蜂中mrjp1～3表達(dá)下調(diào),其中mrjp3表達(dá)量最低(Winkleretal., 2018)。Fent等人將蜜蜂暴露不同的殺蟲劑中,結(jié)果顯示毒死蜱會(huì)使采集蜂大腦中mrjp2和mrjp3表達(dá)下調(diào),吡蟲啉會(huì)使采集蜂大腦中mrjp1表達(dá)下調(diào)(Fentetal., 2020)。Scharlaken等人研究表明,蜜蜂在感染大腸桿菌8 h之后,mrjp3在頭部的表達(dá)上調(diào),而mrjp4表達(dá)下調(diào)(Scharlakenetal., 2007)。蜜蜂幼蟲在感染類芽孢桿菌后,mrjp1～3在蜜蜂血淋巴中的表達(dá)下調(diào)(Chanetal., 2009)。多菌靈是一種殺菌劑,在多菌靈的刺激下,蜜蜂頭部中mrjp1～7和9的表達(dá)會(huì)下調(diào)(Wangetal., 2021)。因此,mrjps及蛋白質(zhì)的表達(dá)受激素、殺蟲劑和細(xì)菌的影響。

5 mrjps在其他膜翅目昆蟲中同源體

除了蜜蜂之外,mrjps在其他膜翅目中也存在同源體。在寄生蜂Nasoniavitripennis中鑒定出10個(gè)與蜜蜂mrjps類似的基因,分子證據(jù)表明,這兩組基因擁有一個(gè)共同祖先(Werrenetal., 2010)。Sumner等人研究表明,mrjps在群居型黃蜂Polistescanadensis的蜂王中表達(dá)(Sumneretal., 2015)。Tian等人的研究發(fā)現(xiàn),膜翅目蟻科的火蟻也會(huì)表達(dá)mrjps,并且認(rèn)為這與蟻后交配或繁殖行為有關(guān)(Tianetal., 2004)。在阿根廷螞蟻Linepithemahumile中也鑒定出10個(gè)yellow和10個(gè)mrjps(Smithetal., 2011)。或許mrjps在其他膜翅目昆蟲中具有重要的作用。

6 mrjps家族進(jìn)化

最初,Albert等人只鑒定出5種王漿主蛋白,即MRJP1～5,并且發(fā)現(xiàn)MRJPs與果蠅的YELLOW有著共同的進(jìn)化起源,MRJPs家族的分化可能導(dǎo)致該基因家族有新功能(Albertetal., 1999)。Drapeau等人不僅證實(shí)了Albert等人的研究,還認(rèn)為mrjp家族是由yellow-e3進(jìn)化而來(Drapeauetal., 2006)。Drapeau等人將內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)mrjps與yellow-e3內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)高度相似,通過微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)得出yellow-e3與mrjp功能上有共同之處(Drapeauetal., 2006)。Buttstedt等人認(rèn)為mrjp9是mrjps中的始祖基因,蜜蜂高拷貝數(shù)是由一個(gè)古老基因復(fù)制而導(dǎo)致的,mrjp9在蜂王和工蜂的頭部、胸部、腹部表達(dá)都很高,并且一些只分泌1種MRJP的物種(如熊蜂Bombusterrestris等)的mrjp與mrjp9相似度最高,因此mrjp9被認(rèn)為是最古老的基因(Buttstedtetal., 2013)。Kupke等人認(rèn)為熊蜂是一個(gè)過渡物種,熊蜂的王漿主蛋白稱為BtRJPL(B.terrestrisroyal jelly protein-like),將熊蜂BtRJPL基因簇與西方蜜蜂apismelliferamrjps的對(duì)比顯示,除了yellow-e3和yellow-h之間只有一個(gè)BtRJPL基因外,其基因排列順序相同,并且發(fā)現(xiàn)BtRJPL參與食物的消化(Kupkeetal., 2012)。寄生蜂中5個(gè)mrjps串聯(lián)排列在3號(hào)染色體上,兩側(cè)是yellow,在染色體遠(yuǎn)端還有1個(gè)mrjp,另外3個(gè)mrjps在4號(hào)染色體上,最后1個(gè)在Scaffold 1011上(Buttstedtetal., 2014)。寄生蜂是迄今為止在昆蟲中發(fā)現(xiàn)mrjps數(shù)量最多的,與蜜蜂mrjps具有一個(gè)共同起源(Werrenetal., 2010)。阿根廷螞蟻具有10個(gè)yellow和10個(gè)mrjps,其中8個(gè)yellow與黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的相似,可能為同源基因(Smithetal., 2011)。類似于西方蜜蜂和寄生蜂,阿根廷螞蟻基因組中mrjps獨(dú)立聚類為一類,這表明祖先基因在分化過程中可能出現(xiàn)復(fù)制,使mrjps有新的功能(Johnson and Linksvayer, 2010; Smithetal., 2011)。

7 MRJPs家族功能

MRJP1及其酶解產(chǎn)物具有多種生物學(xué)活性,其中最重要的功能是營(yíng)養(yǎng)功能。Kamakura研究表明,MRJP1單體(稱為royalactin)在延長(zhǎng)蜂王壽命中發(fā)揮重要作用,并且能誘導(dǎo)幼蟲分化為蜂王,是影響蜂王和工蜂級(jí)型分化的主要物質(zhì)(Kamakura, 2011)。然而,Buttstedt等人反駁了這個(gè)觀點(diǎn),他們認(rèn)為決定級(jí)型分化的主要因素是攝入的食物量,充足的攝入量會(huì)給幼蟲提供更多更均衡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而不是單一的化合物,MRJP1為蜂王幼蟲提供必須營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Buttstedtetal., 2016)。

MRJP1對(duì)人類骨髓細(xì)胞有生長(zhǎng)刺激作用(Watanabeetal., 1998)并且MRJP1單體與apisimin所組成的低聚物具有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用(Tamuraetal., 2009)。Kamakura等人通過研究表明MRJP1可以刺激原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞DNA的合成,從而促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖,在這一過程中MRJP1起著有絲分裂原的作用,而且這種刺激作用呈劑量依賴性(Kamakuraetal., 2001)。MRJP1還具有殺菌作用,Vezeteu等人研究發(fā)現(xiàn)MRJP1不僅可以抑制歐洲幼蟲腐臭病細(xì)菌生長(zhǎng),還能抑制其病原菌生長(zhǎng)(Vezeteuetal., 2016)。Brudzynski等人通過半定量徑向擴(kuò)散法和微量液稀釋法來評(píng)估多重耐藥菌對(duì)glps(一種包含MRJP1的糖蛋白)的敏感性,結(jié)果表明glps具有快速殺菌活性(Brudzynskietal., 2015)。Fan等人通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),MRJP1顯著降低血管平滑肌細(xì)胞收縮、遷移和增殖,表明MRJP1具有降血壓作用(Fanetal., 2016)。胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解MRJP1后得到11個(gè)血管緊張素I型轉(zhuǎn)化酶抑制肽,可有效地抑制人體血管緊縮素Ⅰ型轉(zhuǎn)化酶的活性(Matsuietal., 2002)。

低密度脂蛋白(LDL)與氧化修飾的低密度脂蛋白(Ox-LDL)是動(dòng)脈粥樣硬化病的主要成分,王漿素(Royalisin)和MRJP1、MRJP3的降解產(chǎn)物能與LDL和Ox-LDL結(jié)合,從而抑制巨噬細(xì)胞增值,減少斑塊信息,有助于治療動(dòng)脈粥樣硬化(Satoetal., 2021)。Okamoto等人研究表明,MRJP3可以抑制小鼠T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4(白細(xì)胞介素-4)、IL-2(白細(xì)胞介素-2)和IFN-γ,具有抗過敏作用(Okamotoetal., 2003)。Maori等人發(fā)現(xiàn),MRJP3是一種分泌的非序列特異性RNA結(jié)合蛋白,可以與多價(jià)RNA結(jié)合,使其轉(zhuǎn)變?yōu)閑RNP顆粒,該顆粒可以濃縮、保護(hù)、增強(qiáng)RNA的攝取,促進(jìn)RNA轉(zhuǎn)移(Maorietal., 2019)。MRJP3具有細(xì)胞增殖和傷口愈合的作用,Minegaki等人證明MRJP3羧基端串聯(lián)五肽重復(fù)序列能促進(jìn)細(xì)胞增殖(Minegakietal., 2020)。

MRJP4對(duì)細(xì)菌、真菌和酵母具有廣泛的抗菌作用(Kimetal., 2019)。蜂毒中含有MRJP8和MRJP9(Blanketal., 2012),Kim發(fā)現(xiàn)蜂毒處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞后會(huì)引起炎癥反應(yīng),而MRJP8可以調(diào)節(jié)細(xì)胞H2O2和促炎癥分子的產(chǎn)生,保護(hù)細(xì)胞,并且蜂毒中的MRJP8可以降低caspase-3的活性,具有抗凋亡作用(Kim, 2021)。

8 總結(jié)與展望

到目前為止,人們對(duì)MRJPs家族進(jìn)行了大量研究。從蜂王漿中蛋白質(zhì)的鑒定、MRJPs的表達(dá)與合成、mrjps家族進(jìn)化,到MRJPs的結(jié)構(gòu)與功能,如此多的研究數(shù)據(jù)讓科研人員不斷地深入了解MRJPs家族,但是仍然有許多地方不清楚。級(jí)型分化機(jī)制研究對(duì)于社會(huì)性昆蟲至關(guān)重要,MRJP1能影響蜜蜂的級(jí)型分化,但是其中的機(jī)理仍一無所知,這或許是今后的研究方向。mrjps存在于其他膜翅目昆蟲中,但是其功能我們還是不太了解。或許,在揭示mrjps功能時(shí),不應(yīng)該僅限于蜜蜂。