復發性流產患者胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1表達及意義#

徐麗偉 張圓圓 康樂 王杉杉 趙青竹

（河南大學第一附屬醫院婦科，河南 開封 475100）

復發性流產（Recurrent spontaneous abortion，RSA）指連續發生率兩次及以上自然流產，其發生原因較復雜，可能與免疫、內分泌、遺傳等因素有關，RSA對孕婦生理及心理均造成較大影響，臨床需根據RSA患者情況準確判斷其RSA發生原因并及時采取應對、治療措施，降低流產風險，預防患者再次流產。

胎盤絨毛滋養細胞在胚泡侵襲子宮內膜、胎盤形成及孕期內分泌等存在重要作用，胎盤絨毛滋養細胞凋亡與胎盤生長發育密切相關。自噬為真核細胞基礎代謝反應之一，可維持細胞動態穩定，輔助物質、能量再利用，參與妊娠各個時期的生理及病理過程，正常自噬對妊娠存在促進作用，但自噬過度會破壞細胞穩定，導致胎盤組織細胞、內皮細胞等損傷甚至凋亡，引發胚胎死亡及流產。胎盤絨毛滋養細胞微管相關蛋白輕鏈3（Light chain，LC3）能靶向定位于自噬體膜，參與自噬過程。自噬相關蛋白Beclin-1為自噬體形成的必須分子之一，監測胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平可反應胎盤絨毛滋養細胞自噬水平。

目前臨床大多研究胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平與子癇前期的關系。因此，本次旨在分析RSA患者胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1表達及其意義，為臨床防治RSA、降低流產率提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2021年1月至2021年12月河南大學第一附屬醫院收治的50例RSA患者及50例胚胎發育正常行人工流產者的臨床資料。將RSA患者納入RSA組，將人工流產者納入人工流產組。

納入標準：RSA組患者均符合RSA診斷標準[1]；月經正常，無腫瘤、畸形等生殖系統疾病；無糖尿病等內分泌疾病；夫妻雙方染色體均正常；人工流產組均有正常妊娠、分娩史。排除標準：存在明確環境、遺傳因素導致流產；人工流產組存在不良妊娠、分娩史；高齡產婦。

RSA組中年齡22～31 歲，平均26.52±2.33 歲；流產次數2～4 次，平均3.12±0.46 次；早期流產29 例，晚期流產21 例。人工流產組中年齡21～33歲，平均26.89±2.41 歲；妊娠次數2～4 次，平均3.08±0.42 次；分娩次數1～3 次，平均1.97±0.43次。本次研究經我院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

RSA組及人工流產組均在其清宮術后采集其胎盤絨毛滋養細胞，并使用等滲生理鹽水漂洗其中血液，漂洗后放在凍存管內，放入-80 ℃環境下保存。

1.2.2 胎盤絨毛滋養細胞LC3檢測

取出凍存的絨毛組織，加入細胞裂解液，在4℃條件下以10000 r·min-1轉速離心10 min，取30 μL上層清液使用考馬斯亮藍法調整蛋白濃度，依次使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉膜至聚偏二氟乙烯膜、5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入鼠抗人LC3Ⅱ、LC3I一抗，在4 ℃條件下放置過夜，然后使用緩沖鹽水和洗滌劑洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，在室溫下放置1 h，再次洗滌，洗滌后使用增強化學發光法試劑盒進行顯影、定影，使用以色列DNR成像系統儀器分析蛋白條帶灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，以LC3Ⅱ/LC3I為LC3相對表達量。

1.2.3 胎盤絨毛滋養細胞Beclin-1水平檢測

檢測方法同胎盤絨毛滋養細胞Beclin-1水平檢測，測定其蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

所有數據采用SPSS 22.0進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±SD）表示，進行t檢驗；計數資料以例或率（n（%））表示，進行卡方檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。以Spearman分析模型分析相關性。組別賦值“RSA組”=1、“人工流產組”=0，計入二元Logistic回歸模型，以胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平為協變量，得出預測概率，以預測概率為聯合預測評估預測效能；將胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平及聯合預測錄入，繪制受試者工作曲線（Receiver operator characteristic，ROC），讀取曲線下面積（Area under the curve，AUC）、置信區間（Confidence interval，95%CI）、敏感度、特異度、截斷值。

2 結果

2.1 胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平

RSA組患者胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平顯著高于人工流產組（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平比較（± SD，n=50）

表1 胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平比較（± SD，n=50）

注：與人工流產組比較，*P＜0.05。

組別 LC3 Beclin-1 RSA組 1.43±0.31* 1.81±0.43*人工流產組 1.01±0.28 1.22±0.40

圖1 胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平

2.2 胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平與RSA發生的相關性分析

經Spearman分析模型分析，胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平與RSA發生呈正相關（r=0.783，P=0.003；r=0.825，P=0.002）。

2.3 胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平預測RSA發生的預測價值分析

ROC曲線中，胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平預測RSA發生的AUC分別為0.862、0.862，截斷值分別為1.29、1.43；聯合預測的AUC為0.942，敏感度為92.00 %，特異度為86.00 %，見圖2、表2。

表2 ROC曲線參數

圖2 ROC曲線

3 討論

RSA對孕婦身體造成較大傷害，且對孕婦及其家屬心理也造成較大心理壓力，RSA發生的影響因素較復雜，臨床需判斷RSA患者流產原因，并及時采取針對性治療等應對措施，降低流產率，因此需研究影響RSA患者流產的影響因素。

胎盤生長發育情況直接影響孕婦妊娠，胎盤絨毛滋養細胞是胎盤組織生長發育及妊娠期內分泌的重要作用細胞之一，當胎盤絨毛滋養細胞自噬活性升高，使胎盤絨毛滋養細胞侵襲能力下降，從而導致胎盤著床較淺，引發流產。胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1均為自噬過程重要參與因子，其水平直接影響到自噬活性[2]。

本研究結果顯示，RSA組患者胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平顯著高于人工流產組；經Spearman分析模型分析，胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平與RSA發生呈正相關，提示胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1語RSA發生存在明顯相關性。究其原因，Beclin-1蛋白為自噬發生的主要蛋白之一，可調節自噬前體的生成，引導其他相關蛋白轉移至自噬體膜，并平衡胎盤絨毛滋養細胞自噬和凋亡[3]。LC3為自噬雙膜蛋白，在前自噬泡、自噬泡膜表面均有存在，參與自噬體形成、生長過程，可反映自噬程度[4]。當胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平上升時，表示自噬程度升高，一方面過量自噬可能直接導致自噬性細胞死亡，另一方面過量自噬可降解生存素等抗凋亡因子的釋放，引發胎盤絨毛滋養細胞凋亡，導致胎盤著床淺，孕婦發生流產。

并且，本研究通過ROC曲線顯示，胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平預測RSA發生的AUC分別為0.862、0.862，截斷值分別為1.29、1.43；聯合預測的AUC為0.942，敏感度為92.00 %，特異度為86.00 %，說明當孕婦胎盤絨毛滋養細胞LC3≥1.29、胎盤絨毛滋養細胞Beclin-1水平≥1.43時，孕婦發生流產的風險極高。原因在于，當胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平異常升高時，發生病理性細胞凋亡，引起內皮細胞損傷，導致胎盤發育障礙以及內分泌等功能異常，引發流產[5]。因此臨床可將胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平納入篩選RSA早期診斷的靶向目標，及時采取針對性治療措施，降低流產發生風險。

綜上所述，胎盤絨毛滋養細胞LC3、Beclin-1水平與RSA發生存在明顯相關性，且其用于早期診斷RSA發生具有較高預測價值，為臨床防治RSA、降低流產率提供方向及參考依據。