南海冷泉區深海沉積物來源放線菌的分離培養及其抑菌活性

陳以秋，韓梅桂，韓 壯，唐 敏

（1. 海南大學 生態與環境學院，海口 570228; 2. 中國科學院 深海科學與工程研究所，三亞 572000）

放線菌具有重要的生態學意義，也是很多生物活性物質的來源之一[1]。放線菌種類繁多，在陸地和水域生態系統中都有廣泛分布。國內外的研究者在陸源放線菌及其活性物質方面已開展了較充分的研究，從相關菌株中也發現了許多結構新穎的活性化合物。目前對海洋環境中放線菌的研究還需進一步加強，特別是對深海區域放線菌的探索和開發尚處于起步階段。地球表面約71%的面積是海洋，其中95%的海域深度超過1 000 m[2]，深海環境具有高壓、低溫、黑暗、寡營養等特征，生活在其中的生物也具備相應獨特的適應能力，這些適應能力通常伴隨著對基因、初級及次級代謝途徑的調控[3]。研究發現在長期的進化過程中，深海放線菌等生物體內常產生有獨特結構的次生代謝物，且具有一定的生物活性[4-5]，而且這些活性物質具有是陸源微生物中未被發現過的新穎化合物結構[6]，具有重要的研究價值。可見，廣闊而獨特的深海環境是研究和開發放線菌資源的良好場所。

南海是西太平洋最大的邊緣海域，海域面積達350萬km2，平均深度為1 350 m，最深深度超過5.5 km[7-8]。冷泉是一種特殊的海底環境，在冷泉深部富含硫化氫、甲烷等碳氫化合物的流體會向海底表面滲漏或噴發，因此冷泉環境中含有大量的甲烷[9]，因此冷泉環境中的微生物群落優勢種屬多為硫酸鹽還原菌、好氧甲烷菌、氧甲烷菌、硫氧化菌等[10]，該類群的冷泉微生物豐富度高于熱液和普通海底沉積物[11]。不同冷泉的微生物群落存在差異[12]。南海冷泉區微生物資源多樣性豐富[13]，從南海冷泉區豐富的微生物資源中尋找新型次級代謝產物有利于加強對海馬冷泉未知生物資源的開發與利用。已有許多新型活性物質來源于南海冷泉微生物[14-19]，對微生物資源的利用推動了深海微生物資源的應用潛力評價。

海馬冷泉位于南海西北陸坡，是南海2個活躍的冷泉之一[10]，目前對海馬冷泉微生物群落研究較少[20-23]。本研究主要在南海海馬冷泉區，對沉積物中的放線菌進行分離純化、培養鑒定、多樣性分析及次級代謝產物抗菌活性的研究，旨在挖掘海馬冷泉區可培養的放線菌資源，及其潛在的生物活性價值，為后續研究和開發冷泉放線菌資源提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 沉積物樣品由中國科學院深海科學與工程研究所“探索一號”科考船搭載的“深海勇士”號載人潛水器于2021年2月采集于南海海馬冷泉區。樣品采集后，放置4 ℃冰箱冷藏。巡航結束后，所有樣品放在冰上運送到實驗室，放置4 ℃保存備用。樣品分為3組HM2、HM3、HM6（表1）。

表1 深海沉積物樣品信息表

抗菌活性檢測采用7種供試菌，即H119（糞腸球菌Enterococcus faecalis）、H57（甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA）、G280（甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌methicillin-susceptibleStaphylococcus aureus,MSSA）、H442（亞胺培南敏感鮑曼不動桿菌imipenem-susceptibleAcinetobacter baumannii）、E292（亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌imipenemresistantAcinetobacter baumannii）、G1（高地芽孢桿菌Bacillus altitudinis）、F1（副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus）。菌株分離、發酵、抑菌活性測試使用相應的培養基（表2）。

表2 深海沉積物放線菌分離、發酵、活性測試所用培養基配方

1.2 深海放線菌菌株分離與保存 在無菌條件下，稱取0.1 g深海沉積物樣品，加入1 mL無菌海水，振蕩10 min，隨后將沉積物懸濁液梯度稀釋10-1到10-6，稀釋倍數為10-6懸濁液100 μL于培養基中涂布，28 ℃倒置培養，每隔24 h觀察菌落生長狀況，待形成菌落后，挑取部分菌，采用三區劃線法接種到分離培養基，重復純化培養多次直至得到單一純化菌株。隨后用含25%甘油液體培養基凍存（-80 ℃）保種。

1.3 深海放線菌菌株鑒定 利用試劑盒提取DNA（TIANamp Bacteria DNA Kit），以16S rDNA序列通用引物27F/1492R[24]、Taq酶體系對其進行PCR擴增。對PCR產物驗證通過后測序（擎科生物公司）。測序結果拼接完成后，上傳EZbiocloud在線數據庫（https://www.ezbiocloud.net）進行對比分析，獲得菌株的分類信息。以近緣菌株的16S rRNA基因序列作為參比對象，采用MEGA軟件neighbor-joining構建系統發育樹。

1.4 放線菌的發酵培養及次級代謝產物的提取在2216E瓊脂培養基上采用平板劃線法培養菌株形成菌落，挑取單菌落，接種至5 mL發酵培養基中培養（28 ℃，180 r·min-1）3 d，獲得種子菌液。隨后，按照發酵培養基∶種子液（v∶v）= 100∶5的比例進行發酵培養（28 ℃，180 r·min-1）7 d，發酵液總體積為105 mL。發酵完成后，取乙酸乙酯與發酵液等體積充分混合，萃取3次，有機相合并后經旋轉蒸發儀濃縮獲得粗提物，-20℃保存備用。

1.5 深海放線菌的抑菌活性分析 采用K-B紙片擴散法藥敏試驗[25]檢測放線菌發酵粗提物對7種供試菌的抑菌活性。用甲醇（分析純）配制待測粗提物溶液（10 g·L-1），分2次滴加到滅菌濾紙片（直徑6 mm）上，每次滴加5 μL，將風干的濾紙片貼在涂布了供試菌的固體培養基上（供試菌稀釋至10-3涂布），采用萬古霉素以及氯霉素（1 g·L-1）為陽性對照，甲醇溶液為空白對照，37 ℃培養24 h。通過與陽性對照的抑菌圈直徑對比，判斷粗提物的抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 深海沉積物中放線菌的菌種分離鑒定及其多樣性分析 實驗從HM2、HM3、HM6三組沉積樣中分離出50株放線菌，從HM3樣品組中分離的放線菌最多，共26株，其次是HM6樣品組，19株，HM2樣品組的最少，只有5株（圖1）。這50株放線菌都屬稀有類型，形態類似于細菌，無氣生菌絲，隸屬于7個屬（圖2），其中類諾卡式菌屬（Nocardioides）22株、迪茨氏菌屬（Dietzia）13株、喬治菌屬（Georgenia）6株、考克氏菌屬（Kocuria）4株、節桿菌屬（Arthrobacter）2株、小單孢菌屬（Micromonospora）2株、印度洋金色丸菌屬（Chryseoglobus）1株。各放線菌屬間的相對豐富度呈現一定差異，其中類諾卡氏菌屬在3組樣品中屬于優勢菌。采用2216E培養基、R2A瓊脂培養基和ISP3瓊脂培養基分別篩選到18、29和3株放線菌，R2A培養基更適合用于篩選深海放線菌。基于對潛在新菌種的界定[26-28]，在這50株放線菌中，有6株與近緣菌株16S rRNA基因的相似度低于98.7%，初步判斷為潛在新種（表3）。

圖1 從各沉積樣品中分離到的放線菌種類

圖2 分離出的50株放線菌與近緣菌株的系統發育樹

表3 50株放線菌中潛在的新菌株

2.2 放線菌的抑菌活性分析 通過對50株放線菌的發酵液粗提物進行抑菌活性分析，發現7株放線菌的粗提物對3種供試菌顯示出不同程度的抑菌作用，抑制活性比例為14%。其中，5株菌對F1有抑菌活性，4株對G280有活性，2株對H57有活性。編號為 LDBS2366和LDBS2469的菌株粗提物僅對 G280 有抑菌活性。 LDBS3832、LDBS3950和 LDBS3974對F1有輕微抑菌活性，此外LDBS3974 對H57也有輕微抑菌活性。LDBS3949的菌株粗提物對H57、G280、F1均有抑菌活性。LDBS3988的菌株粗提物對G280和F1有抑菌活性。50株放線菌粗提物對H119、H422、E292、G1均沒有活性。小單孢菌屬的抑菌活性及抑菌范圍都優于類諾卡式菌屬（表4）。其中，小單孢菌屬的菌株LDBS3949和LDBS3988呈現出良好的抑菌效果。

表4 放線菌代表性菌株的抗菌活性

3 討 論

從南海海馬冷泉區的三組沉積物樣品中分離到50株放線菌，屬于5個科，7個屬，其中類諾卡式菌屬、迪茨氏菌屬是優勢菌，后者為海洋特有。這與從南大西洋深海沉積物分離出的36株放線菌不同，屬于6個科，8個屬，其中微球菌屬、迪茨氏菌屬和微桿菌屬是優勢菌[29]，也有實驗分離出132株放線菌，屬于13個科，19個屬，其中考克氏菌屬、短桿菌屬和鏈霉菌屬是優勢菌[30]。在這些沉積樣品中，共有種屬的放線菌有迪茨氏菌屬、考克氏菌屬、微球菌屬、微桿菌屬。不同沉積樣品的放線菌種屬存在著差異，這可能一方面是源自地域環境差異，另一方面是因不同的培養條件和分離方法造成的。基于對潛在新種的界定，本研究分離的放線菌中有6株的相似性低于98.7%初步認為是潛在新種，它們屬于迪茨氏菌屬、類諾卡式菌屬、小單孢菌屬。有研究發現Nocardioidessp.strain CF18利用單加氧酶（pBMO）在丁烷上生長，而pBMO與甲烷氧化細菌的甲烷單加氧酶（pMMO）基因序列相似[31]，推測這些酶助力于類諾卡式菌屬菌株在含大量甲烷環境的冷泉中能生存并成為優勢屬。

本研究中發現諾卡式菌屬和小單孢菌屬的發酵液粗提物都呈現出較好的抗菌活性，其中，小單孢菌屬的LDBS3988和LDBS3949菌株對G+菌MRSA、MSSA，以及G-菌V. parahaemolyticus都表現出抑制作用。Zhang等[32]曾從南海沉積物來源的小單孢菌屬的次級代謝產物中分離到3個新化合物fluostatins I-K，小單孢菌屬的次級代謝產物對金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用。除了能產多種化合物的小單孢菌屬外，本研究分離到的類諾卡式菌屬對MRSA、MSSA、V. parahaemolyticus也呈現出一定的抗菌活性，這是首次報道深海來源類諾卡式菌屬有抑菌活性。尤其是小單孢菌屬的2株菌LDBS3988和LDBS3949的發酵粗提物呈現較強的抑菌活性，具有較好的深入研究價值。

目前對南海冷泉沉積樣品中硫化細菌的研究較多[33]，但對放線菌的研究還較少。本研究揭示了冷泉區豐富的放線菌資源，這些具有活性的菌株可作為挖掘深海放線菌抗菌天然產物的重要資源。后期研究將通過優化培養條件、發酵條件、激活沉默次級代謝合成途徑等手段進一步挖掘新穎活性化合物，為從深海極端環境中尋找新型抗生素提供參考資料。