褪黑激素埋植劑對發情期水貂卵巢形態、卵泡發育及血清主要生殖激素的影響

宮洪杰，畢曉燕，崔凱，高惠，馬澤芳*

(1. 青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；2. 山東省乳山市夏村鎮畜牧獸醫站，山東 乳山 264500)

水貂是一種季節性繁殖動物，其性腺的發育、衰退及生殖機能活動都存在明顯的季節性變化規律，這主要受光照周期變化的調控[1-2]。而光照周期變化主要通過調節松果體中褪黑激素(melatonin，MLT)的合成與分泌，使體內內分泌系統發生改變，進而調控體內生殖激素的合成與分泌，從而通過調節生殖功能來實現季節性繁殖[3-4]。Allain等[5]研究表明，給不同生理階段水貂埋植MLT后，能明顯促進公貂睪丸重量的增加、母貂各級卵泡的提前發育以及血清促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)、孕酮(progesterone，P4)、促卵泡素(follicle stimulating hormone，FSH)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和雌二醇(estradiol，E2)的提前分泌[5-7]。晏子越等[8]給配種準備期母貂埋植172 d MLT后發現，能促使卵巢發育、可視卵泡、原始卵泡和初級卵泡數量的增多及有腔卵泡的發育。然而，有關MLT對發情期母貂卵巢發育和血清主要生殖激素影響的研究尚未見報道。本試驗基于MLT埋植劑的埋植時間，埋植239 d后的水貂正處于配種階段，而此時也處于發情期，因此，通過對比埋植239 d MLT和未埋植MLT發情期水貂卵巢形態學、卵泡發育及血清主要生殖激素含量的差異性變化，探討MLT埋植劑對水貂卵巢形態學和卵泡發育的影響機制，為MLT埋植劑技術應用于水貂生產實踐提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試驗設計

試驗地為山東省諸城市某水貂養殖場。隨機選取2～2.5月齡、健康、體重均勻(870±5)g的雌性紅眼白水貂200只，隨機平均分為對照組和試驗組，每組100個重復，每個重復1只。試驗組于試驗開始當天使用MLT皮下埋植器在水貂頸部皮下埋植MLT埋植劑，1粒/只(每粒含MLT 18 mg)，對照組不做任何處理。試驗共進行239 d(2020年7月7日至2021年3月3日)。

1.2 飼養管理

水貂于南北走向的棚舍單籠飼養。試驗期內采用自然光照，每天由專人定時飼喂2次，使用飲水器自動飲水，其日糧參照水貂養殖生產中的經驗標準執行，基礎日糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎日糧組成及營養水平(按干物質計算)

1.3 測定指標與方法

于試驗結束當天隨機選取對照組和試驗組水貂各4只，先找到試驗組水貂的MLT埋植劑顆粒后，再進行心臟采血5 mL/只，4 ℃靜置30 min以上后，使用3 000 r/min的離心機(S1010E)離心5 min后分離血清，-20 ℃保存。

心臟采血處死水貂剝皮后，采集右側卵巢，測量形態學指標后將卵巢放于有10%中性甲醛溶液中固定。

1.3.1 卵巢形態指標及測量方法

用電子天平稱量卵巢的重量。用游標卡尺測量卵巢的長徑、寬徑和厚徑，并計算體積。

1.3.2 卵泡發育指標及測定方法

隨機選取固定于10%中性甲醛溶液中已固定48 h的右側卵巢每組各3枚，經洗滌、脫水、透明處理后進行石蠟包埋，并使用手搖式組織切片機(Leica RM2235)，以5 μm的厚度進行連續切片，每隔6張切片選取1張，每枚卵巢共選取5張切片，共計30張，經HE染色后封片，使用光學顯微鏡(BK系列生物顯微鏡)觀察各級卵泡的顯微結構，記錄各級卵泡數量，用目鏡測微尺測量各級卵泡和卵母細胞的直徑及透明帶厚度，并用顯微照相機拍照。

卵泡的分類方法借鑒李云龍等[9]對卵泡的分類方法，即根據卵泡大小、透明帶的形成、卵泡腔出現的時間以及卵母細胞的發育程度，將卵泡分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡5種類型。

1.3.3 血清主要生殖激素指標及測定方法

從2個組水貂的待測血清樣本中各取血清10 μL，使用酶標儀(Tecan Infinite F50)，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法進行血清FSH、LH、E2、P4含量的測定。以上4種ELISA試劑盒(水貂專用)均購自上海，試驗操作按照說明書進行，并根據各激素標準曲線計算FSH、LH、E2、P4在血清中的含量。

1.4 數據處理

所有試驗數據均用Miscrosoft Excel進行處理，利用SPSS 22.0統計軟件對所得的試驗數據采用獨立樣本t檢驗。試驗結果用“平均值±標準誤”表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 卵巢形態

由表2可知，試驗組水貂的卵巢長度、寬度、厚度及重量均顯著高于對照組(P<0.05)，體積極顯著高于對照組(P<0.01)，說明MLT埋植劑埋植239 d對卵巢的形態發育有促進作用。

表2 水貂卵巢形態統計結果(n=4)

2.2 各級卵泡顯微結構觀察結果

由圖1可見，原始卵泡數量多、體積小，由中央一個初級卵母細胞及周圍一層完整或不完整的扁平或立方卵泡細胞構成，沒有卵泡膜和透明帶。由圖2可見，初級卵泡的初級卵母細胞體積不斷增大，周圍由單層扁平變為立方或柱狀細胞的卵泡顆粒細胞圍繞，層數增殖為1～3層，逐漸形成不完整的卵泡膜，但未出現卵泡腔，在初級卵母細胞和卵泡細胞之間開始出現薄而不完整的透明帶。由圖3可見，次級卵泡的初級卵母細胞周圍顆粒細胞變為復層立方或柱狀細胞，增殖為3層以上，透明帶發育完整，在卵泡細胞間逐漸出現大小不等的腔隙。由圖4可見，三級卵泡的初級卵母細胞周圍顆粒細胞層數進一步增加，透明帶增厚，形成放射冠，卵泡中出現新月形的卵泡腔，卵母細胞及其周圍顆粒細胞逐漸被擠至卵泡腔一側，并與卵泡細胞一起突出卵泡腔形成卵丘，卵泡膜明顯。由圖5可見，成熟卵泡的初級卵母細胞完成第一次成熟分裂，成為次級卵母細胞，卵泡體積顯著增大，卵泡壁變薄，卵母細胞與卵泡壁之間的顆粒細胞層變窄，僅為2～3層，此時透明帶達到最厚。由此得出，從原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡到成熟卵泡，各階段卵泡的顯微結構均沒有顯著差異，說明MLT埋植劑埋植239 d對各級卵泡的顯微結構均沒有影響。

a. 對照組(未埋植MLT)；b. 試驗組(埋植239 d MLT)；PO. 初級卵母細胞；FC. 卵泡細胞。下同

ZP. 透明帶；下同

GC. 顆粒細胞；下同

CO. 卵丘；GL. 顆粒層；FA. 卵泡腔。下同

SO. 次級卵母細胞；CR. 放射冠；C. 卵泡液

2.3 各級卵泡和卵母細胞數量、直徑及透明帶厚度

2個組均有45個原始卵泡、30個初級卵泡、12個次級卵泡、6個三級卵泡，其中試驗組有3個成熟卵泡，而對照組僅有1個成熟卵泡。由表3可見各組測量的結果，試驗組與對照組相比，試驗組水貂卵等的原始卵泡和卵母細胞的直徑、三級卵泡直徑顯著增大(P<0.05)，而初級卵泡和次級卵泡及其卵母細胞的直徑差異均不顯著(P>0.05)。2個組均在初級卵泡階段開始出現透明帶，次級卵泡階段發育完整且隨卵泡成熟透明帶厚度逐漸增厚，但僅在三級卵泡階段透明帶厚度差異顯著(P<0.05)。

表3 水貂各級卵泡和卵母細胞數量、直徑及透明帶厚度比較

2.4 血清主要生殖激素含量

由表4可見，試驗組與對照組相比，血清FSH、LH、E2和P4的含量差異均不顯著(P>0.05)。由此說明，MLT埋植劑埋植239 d對血清FSH、LH、E2和P4含量均沒有影響。

表4 水貂血清主要生殖激素含量比較(n=4)

3 討論

3.1 MLT埋植劑對卵巢形態的影響

試驗結果表明，MLT埋植劑埋植239 d對卵巢的形態發育有促進作用。這可能與其繁殖活性和光照時間縮短調控MLT的分泌量有關，光照信號通過作用于視網膜，經下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)的中樞生物鐘調控，感知環境晝夜節律的變化，即在夜間促進MLT分泌，在日間抑制MLT分泌[10]。另據Viguie等[11]報道，季節性繁殖動物切除松果體并長期注射MLT，能促使GnRH和LH等激素脈沖釋放并激活其生殖活性。因此，本試驗埋植MLT埋植劑239 d相當于模擬短日照時MLT的分泌模式，直接促使體內MLT的分泌量持續增加，通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonadal axis，HPGA)調節下丘腦分泌GnRH，進而影響生殖系統功能，促進卵巢發育[12]。這與MLT能促進山羊[13]、梅花鹿[14]等動物卵巢卵泡發育的試驗結果相一致。

3.2 MLT埋植劑對各級卵泡顯微結構的影響

卵泡是由卵母細胞和其周圍的顆粒細胞及卵泡膜細胞組成，是卵巢皮質內的基本結構單元等[15]。本試驗結果表明，MLT埋植劑埋植239 d對各級卵泡的顯微結構均沒有影響。這與趙英等[16]報道MLT對休情期銀黑狐各級卵泡的顯微結構沒有影響的結果一致。這可能與樣品的采集時間有關，樣品采集時水貂正處于發情階段，試驗組水貂卵巢的發育程度可能剛好達到了與對照組水貂發情期相一致的狀態和水平。另據李德河[17]報道，母貂于7月初埋植18 mg/只MLT后，第1個月內MLT釋放量平均為9.840 mg，第2個月內釋放量平均為2.448 mg，第3個月內釋放量平均為0.861 mg，第4個月直至第8個月平均月釋放量為0.269 mg。由此說明，試驗結果可能與MLT的埋植時間、釋放量和分泌量有關。從MLT埋植劑埋植在水貂體內后，MLT的釋放量隨埋植時間的增加而逐漸減少，MLT分泌量也逐漸減少，以致于不能引起2個組各級卵泡顯微結構明顯的變化，具體機制還需進一步研究。

3.3 MLT埋植劑對卵泡發育的影響

MLT埋植劑顯著增加了原始卵泡和卵母細胞的直徑、三級卵泡直徑及其透明帶厚度，表明MLT埋植劑埋植239 d對原始卵泡和三級卵泡的發育有一定促進作用，這與趙英等[16]給休情期銀黑狐埋植MLT后能促進有腔卵泡發育的結果一致。本試驗2個組均在初級卵泡階段開始出現較薄且不完整的透明帶，次級卵泡階段發育完整且隨卵泡成熟透明帶逐漸增厚，這與川金絲猴[18]、牦牛[19]、藍狐[20]、天府黑兔[21]等相似，與牛和山羊[22]、東北梅花鹿[23]等透明帶出現在次級卵泡階段不同，這可能與動物種屬差異有關。本試驗中試驗組與對照組相比，初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡及其卵母細胞的直徑和其透明帶厚度差異均不顯著，說明此時試驗組水貂的卵泡發育程度也達到了正常發情時的相同狀態，可能與MLT在卵泡不同發育階段對FSH、LH、E2、P4等性腺激素的調節有關[24]。另據Tamura等[25]和堵吉等[26]報道，排卵前卵泡液中MLT含量比血清中高，且卵巢顆粒細胞中有褪黑激素受體(melatonin receptor，MR)存在。而在卵泡成熟的各個階段，MLT均能通過HPGA的MR直接調節卵泡內FSH、LH、E2、P4等性腺激素的合成與分泌，從而影響卵泡的發育[27]。因此，MLT的埋植時間、分泌量及其調控性腺激素的分泌作用均有可能影響卵巢形態學和內部卵泡的發育。

3.4 MLT埋植劑對血清主要生殖激素的影響

試驗結果表明，MLT埋植劑埋植239 d對血清FSH、LH、E2和P4含量沒有影響。馬友記等[28-29]分別給體外培養的綿羊垂體細胞和卵泡顆粒細胞添加不同劑量MLT進行刺激，發現各組FSH、LH和P4含量差異均不顯著，與本試驗的結果一致。這可能與MLT的釋放量和分泌量有關，MLT是調節光照與生殖系統關系中重要的激素信號且光照變化能引起MLT分泌模式的改變[30-31]。據李德河[17]報道，母貂于7月初埋植18 mg/只MLT后，第4個月直至第8個月平均月釋放量為0.269 mg。MLT長期處理增加了腦絡氨酸羥化酶mRNA的表達，使視前區多巴胺能系統激活，抑制FSH和LH的合成和釋放，而在HPGA和GnRH釋放細胞中，MLT抑制了GnRH mRNA的表達，使FSHβ和LHβ mRNA的表達降低，進而減少了血漿中性腺激素水平[32-33]。因此，FSH、LH、E2和P4的合成和分泌與MLT的釋放量密切相關。一方面可能由于埋植劑中的MLT枯竭所致，MLT埋植劑長期作用于機體，在體內緩慢釋放，使血清MLT含量升高，隨著釋放量逐漸減少直至枯竭，同時受體內內源性MLT負反饋調節的影響，致使血清MLT含量降低，從而間接影響水貂血清FSH和LH等生殖激素的含量；另一方面可能由于MLT迅速的外周代謝所致，使血清MLT含量降低，進而減少性腺激素水平[34]。

4 結論

水貂于7月初埋植MLT埋植劑(18 mg/只)239 d后，對發情期水貂卵巢的重量和體積及原始卵泡和三級卵泡的提前發育均有促進作用，但對初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡及其卵母細胞的直徑和其透明帶厚度均沒有影響；對血清FSH、LH、E2和P4含量沒有影響。