昆蟲死亡素thanatin與斑點(diǎn)叉尾鮰β-防御素在畢赤酵母中的表達(dá)及其抑菌效果評價

何敬文，陳婷，趙微，扈立偉，任君，劉青，顧天越，包利霞，金天明

(1. 天津農(nóng)學(xué)院/天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300392；2. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300192)

抗生素曾廣泛造福人類，但其濫用帶來的一系列“細(xì)菌耐藥性”、“超級耐藥菌”、“DNA污染”等問題已造成人類公共衛(wèi)生巨大威脅，加之我國減抗、禁抗政策的實(shí)施，尋求抗生素替代物的研究尤為迫切[1]。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是生物抵御外界病原微生物而產(chǎn)生的一類7～60個氨基酸的小分子多肽類物質(zhì)，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲作用，又被稱為“自然抗生素”[2]。抗菌肽通過與細(xì)菌的核酸、蛋白質(zhì)或表面負(fù)電荷結(jié)合，破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜、生物大分子或細(xì)胞壁的合成，因此不易產(chǎn)生耐藥性，抗菌肽替抗已成研究熱點(diǎn)[3-5]。

昆蟲死亡素thanatin源自刺肩蝽(Podisusmaculiventris)，共21個氨基酸，β反向折疊及二硫鍵結(jié)構(gòu)發(fā)揮抑菌作用[6-7]，生理濃度下即具有良好抑菌作用，但對金黃色葡萄球菌抗性較低，是迄今為止抗菌譜最廣、抗菌活性最強(qiáng)的昆蟲抗菌蛋白[8]。斑點(diǎn)叉尾鮰為低等脊椎動物，底棲魚，棲息環(huán)境復(fù)雜，易遭受病原微生物的侵染，已有研究證明其β-防御素發(fā)揮了主要免疫作用，Zhu等[9]化學(xué)合成后發(fā)現(xiàn)其水溶液可抑制多種細(xì)菌生長。其C1-C5、C2-C4、C3-C6可形成二硫鍵，總體呈3股反相平行的片層結(jié)構(gòu)，高度穩(wěn)定，不易被蛋白酶降解，故可發(fā)揮持久抗菌作用[10]。

將不同抗菌肽基因融合表達(dá)或共表達(dá)是彌補(bǔ)單一抗菌肽抗菌譜或增強(qiáng)其抗菌效果的常用方式。融合表達(dá)易出現(xiàn)重組蛋白與原蛋白結(jié)構(gòu)、功能不同的現(xiàn)象，如王偉東[11]表達(dá)了thanatin雜合肽，發(fā)現(xiàn)其抗菌效果較thanatin有很大下降。而共表達(dá)則更大程度上保證了原抗菌肽的功能，將不同目的基因間用2A剪切肽連接，轉(zhuǎn)譯時核糖體合成至2A肽時會將前半段已合成的肽鏈放出，造成“剪切”效果，即分別表達(dá)了2A肽兩邊的基因，使兩端基因表達(dá)時互不影響，各自表達(dá)。在多順反子中通常推薦使用P2A或T2A。

試驗(yàn)選定死亡素thanatin和斑點(diǎn)叉尾鮰β-防御素(defbl)，將thanatin低濃度高抑菌活性與defbl長效廣譜抗菌特性相結(jié)合，采用共表達(dá)方式，僅單次誘導(dǎo)即可獲得2種抗菌肽，一同純化，既方便操作，又可實(shí)現(xiàn)協(xié)同抑菌的目的，為后續(xù)對該抗菌肽的研究及應(yīng)用奠定理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、畢赤酵母GS115、抑菌試驗(yàn)指示菌株如大腸桿菌K88、奇異變形桿菌ATCC 35659、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、多殺性巴氏桿菌CIP 103826、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26001、表皮葡萄球菌ATCC 12228、無乳鏈球菌ATCC 12386、停乳鏈球菌ATCC 2957等均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD-thanatin、pMD-defbl、pMD-TD、pPICZɑA Vector(ZeocinTM)購自上海捷瑞有限公司。

1.2 主要工具酶和試劑

限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、SacⅠ、T4 DNA連接酶、DNA ladder、10×Fast Digestion Buffer購自Thermo Fisher Scientific公司；Amp、Zeocin、GoldView I型核酸染色劑、Plasmid Mani Kit I試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、無氨基酵母氮源(YNB)、生物素、山梨醇購自北京索萊寶科技有限公司；酵母基因組提取試劑盒、His標(biāo)簽純化試劑盒、小鼠抗6×His單克隆抗體(一抗)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(二抗)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；YPD、BMGY、BMMY培養(yǎng)基參照Invitrogen公司畢赤酵母表達(dá)手冊配制。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因合成

將The Antimicrobial Peptide Database中的thanatin序列(APD ID：AP00102)和NCBI中斑點(diǎn)叉尾鮰β-防御素基因標(biāo)準(zhǔn)序列(GenBank：KX211992.1)進(jìn)行畢赤酵母偏好性密碼子優(yōu)化，同時利用T2A剪切肽(GGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCT)連接上述基因獲得共表達(dá)序列(命名為TD)，序列兩端添加EcoRⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn)、6×His標(biāo)簽、終止密碼子后由上海捷瑞生物有限公司構(gòu)建至pMD19-T載體上，獲得pMD-thanatin、pMD-defbl、pMD-TD。

1.3.2 引物設(shè)計

根據(jù)目的基因序列和表達(dá)載體pPICZɑA設(shè)計特異性引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成(引物信息見表1)。

表1 引物序列

1.3.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切pMD-thanatin、pMD-defbl、pMD-TD和表達(dá)載體pPICZαA，回收并純化，用T4 DNA連接酶將目的基因片段和載體于16 ℃連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-thanatin、pPICZαA-defbl、pPICZαA-TD并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用Zeocin篩選陽性菌株，進(jìn)行PCR、雙酶切等鑒定。

1.3.4 重組酵母工程菌株的獲得

將重組表達(dá)載體質(zhì)粒10 μg經(jīng)SacⅠ線性化后，與80 μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞均勻混合，于預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中冰浴5 min進(jìn)行電擊，電擊條件為：1.5 kV、25 μF、200 Ω。電擊后立即加入1 mL 1 mol/L預(yù)冷的山梨醇，28 ℃搖床培養(yǎng)1 h后，分別涂布于含1 000、500、300和100 μg/mL Zeocin的YPD平板上，培養(yǎng)2～4 d至單菌落長出，篩選高拷貝高耐受Zeocin轉(zhuǎn)化子菌株，提取基因組，以通用引物3′AOX1/5′AOX1進(jìn)行PCR鑒定，以pPICZɑA空載體質(zhì)粒同上處理作為陰性對照，以線性化的重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物為陽性對照。

1.3.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

篩選到的陽性單克隆菌株接種于10 mL BMGY培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600 nm值為3，以4 000 r/min離心5min后收集菌體重懸于100 mL新鮮的BMMY培養(yǎng)基中至OD600 nm值為1，利用1%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度為1%，誘導(dǎo)72 h后收集培養(yǎng)基上清液，凍干濃縮純化后進(jìn)行Western blot檢測及濃度測定，分析重組抗菌肽的表達(dá)情況。

1.3.6 重組蛋白的抑菌效果分析

制備濃度為105CFU/mL的各指示菌懸液，利用牛津杯法[12]分析各重組蛋白抑菌活性。每杯中加入200 μL濃度為200 μg/mL的各重組蛋白，以ddH2O和空載體組上清液做對照組，37 ℃培養(yǎng)過夜后測量其抑菌圈直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次。

通過二倍稀釋培養(yǎng)法計算各重組蛋白抑菌率。96孔板各孔加入100 μL無菌LB培養(yǎng)基，取100 μL濃度為200 μg/mL的各重組蛋白，自第1孔倍比稀釋到第6孔，前7孔加入10 μL菌懸液，第8孔只加液體培養(yǎng)基作為陰性對照，37 ℃孵育12 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔OD600 nm值，試驗(yàn)重復(fù)3次，計算抑菌率[13]。

抑菌率=[(陽性O(shè)D值-試驗(yàn)組OD值)/(陽性O(shè)D值-陰性O(shè)D值)]×100%

1.3.7 重組蛋白的溶血性檢驗(yàn)

利用2%兔紅細(xì)胞懸液進(jìn)行各重組抗菌肽的溶血性試驗(yàn)[14]。96孔板各孔加入100 μL無菌PBS緩沖溶液，每排第1孔加入100 μL濃度為300 μg/mL的各重組蛋白，倍比稀釋至10號孔，11號孔加入10% Triton-X-100作為陽性對照，此時的紅細(xì)胞溶解值為100%，12號孔為PBS陰性對照；每孔加入100 μL 2%兔紅細(xì)胞懸液，37 ℃作用4 h，3 000 r/min離心10 min，測各孔上清液OD540 nm處的吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3次，計算溶血率。

溶血率=[(試驗(yàn)組OD值-陰性O(shè)D值)/(陽性O(shè)D值-陰性O(shè)D值)]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴(kuò)增出75 bp的thanatin片段、213 bp的defbl片段和357 bp的TD片段，因TD片段為thanatin片段和defbl片段經(jīng)T2A剪切肽連接的片段，所以片段長度大于thanatin片段和defbl片段之和，與預(yù)期大小相符(見圖1)；雙酶切鑒定結(jié)果顯示，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，重組表達(dá)載體經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切后，在3 487 bp、357 bp、75 bp、214 bp處存在高亮條帶，與預(yù)期相符(見圖2)；結(jié)合進(jìn)一步測序結(jié)果表明，重組表達(dá)載體pPICZαA-thanatin、pPICZαA-defbl、pPICZαA-TD構(gòu)建成功。

M.DL0501 Marker；1. pPICZαA-thanatin；2. pPICZαA-defbl；3. pPICZαA-TD

M.DL2502 DNA Marker；1. pPICZαA-thanatin；2. pPICZαA-defbl；3. pPICZαA-TD

2.2 重組酵母工程菌株的獲得

重組表達(dá)載體質(zhì)粒電轉(zhuǎn)畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)1 mg/L的Zeocin抗性篩選獲得陽性菌落，提取其基因組DNA，以3′AOX1/5′AOX1為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，有陽性菌株在549、690、834、589 bp處存在條帶，與預(yù)期大小相符(見圖3)。

M.DL2501 Marker；1～2. GS115-pPICZɑA-thanatin；3～4. GS115-pPICZɑA-defbl；5. GS115-pPICZɑA-TD；6. GS115-pPICZɑA；T. pPICZɑA-thanatin；D. pPICZɑA-defbl；TD. pPICZɑA-TD；空. pPICZɑA質(zhì)粒

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

重組畢赤酵母工程菌株經(jīng)1%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后，收集培養(yǎng)基上清液，凍干濃縮、純化后進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，GS115-pPICZɑA-TD誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清液在分子質(zhì)量為2.3 kDa和7.8 kDa處存在與His-tag抗體特異性結(jié)合條帶；GS115-pPICZαA-defbl誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清液在分子質(zhì)量為7.8 kDa 處存在與His-tag抗體特異性結(jié)合條帶；GS115-pPICZαA-thanatin誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清液在分子質(zhì)量為2.3 kDa處存在與His-tag抗體特性結(jié)合條帶；空載體組在2.3～7.8 kDa范圍內(nèi)無特異性結(jié)合His-tag抗體條帶(見圖4)。測定各組蛋白濃度分別為：thanatin 600 μg/mL，defbl 300 μg/mL，TD 700 μg/mL。

1. GS115-pPICZɑA-TD誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清液；2. GS115-pPICZɑA-defbl誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清液；3. GS115-pPICZɑA-thanatin誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清液；4. pPICZɑA誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清液

2.4 重組蛋白抑菌活性檢測

牛津杯法分析各重組蛋白抑菌活性，結(jié)果顯示，thanatin、defbl及TD組所表達(dá)蛋白對8種指示菌株均具有抑制作用，ddH2O和空載體組對指示菌無抑制效果(見表2)。

表2 目的蛋白對各菌株的抑菌效果(抑菌圈直徑) mm

各重組蛋白二倍稀釋法處理至終濃度為100、50、25、12.5、6.25和3.125 μg/mL后分別對各受試菌株作用12 h，計算抑菌率結(jié)果見圖5～圖7。試驗(yàn)各組表達(dá)的thanatin、defbl、TD蛋白對試驗(yàn)選用的8種指示菌株均具有抑菌作用。其中，thanatin組在蛋白濃度為25 μg/mL時，對各菌株的平均抑菌率在30%～70%之間，對金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌的抑菌率在50%左右；當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_(dá)到50 μg/mL時，對除無乳鏈球菌外的受試菌株的平均抑菌率均在95%以上，且抑菌率不隨蛋白濃度的增加而增加；蛋白濃度超過50 μg/mL后，對金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、奇異變形桿菌的抑菌率反而下降，但不低于90%；對于無乳鏈球菌，蛋白濃度為50 μg/mL時，平均抑制率為77%，隨著蛋白濃度的增加，抑菌率繼續(xù)增加，蛋白濃度為100 μg/mL時，平均抑菌率在95%以上。

圖5 thanatin蛋白抑菌率

圖6 defbl蛋白抑菌率

圖7 TD蛋白抑菌率

defbl組蛋白濃度為25 μg/mL時，其對大腸桿菌(K88)、多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯菌的平均抑菌率均在75%以上，針對奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、停乳鏈球菌的平均抑菌率均在50%～75%之間，針對無乳鏈球菌的平均抑菌率在50%左右；蛋白濃度為50 μg/mL時，defbl對各受試菌株的平均抑菌率均在95%以上，此后雖增加蛋白濃度，但抑菌率并不增長。

對于TD組蛋白，當(dāng)濃度為25 μg/mL時，TD對肺炎克雷伯菌的抑制率可達(dá)到90%以上，對無乳鏈球菌的抑菌率在75%以上，均明顯優(yōu)于同濃度的thanatin、defbl組蛋白對這2種菌的抑制效果；蛋白濃度為50 μg/mL時，TD組對除無乳鏈球菌外的受試菌株抑菌率均在90%以上，對無乳鏈球菌的平均抑菌率也較同濃度thanatin組對無乳鏈球菌的平均抑制率高，在75%以上，而后增加蛋白濃度，TD組對停乳鏈球菌的平均抑菌率有所下降，但也在80%以上。

總體來看，TD組作為thanatin和defbl基因共表達(dá)組，與單獨(dú)thanatin組、單獨(dú)defbl組相比，同一濃度下，蛋白TD較蛋白thanatin、蛋白defbl的針對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、無乳鏈球菌的抑制作用顯著提高，且對所有指示菌株的平均抑菌率均在80%以上，對部分菌株抑制率甚至超過95%。綜上，TD蛋白的抑菌效果更優(yōu)。

2.5 重組蛋白溶血活性檢測

測定純化后各重組蛋白的溶血活性，試驗(yàn)結(jié)果見圖8。結(jié)果顯示，各試驗(yàn)組thanatin、defbl、TD蛋白在最高濃度150 μg/mL時的溶血率均低于5%，參考醫(yī)用溶血判斷標(biāo)準(zhǔn)，溶血率小于5%為陰性反應(yīng)，無溶血現(xiàn)象；溶血率大于5%為陽性反應(yīng)，有溶血現(xiàn)象[15]。說明本試驗(yàn)所獲重組抗菌肽對紅細(xì)胞的溶血能力均較弱。

圖8 重組蛋白溶血性

3 討論

抗菌肽是生物天然免疫的重要活性分子，廣泛存在于各種動物、植物、細(xì)菌、真菌甚至人體中，是生物天然免疫的第一道防線[15]，具有抑菌效果好，不易使細(xì)菌等產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)。抗菌肽在生物體內(nèi)含量極微，直接提取工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低，人工合成費(fèi)用昂貴且可能與天然抗菌肽存在差異，這極大地制約著抗菌肽的發(fā)展與應(yīng)用[16]。利用基因工程、微生物發(fā)酵技術(shù)微生產(chǎn)抗菌肽具有明顯優(yōu)勢，在節(jié)省大量的人力物力的同時又可獲得大量的抗菌肽[17]。相較于原核表達(dá)系統(tǒng)，酵母真核表達(dá)系統(tǒng)具有相對完善的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，表達(dá)產(chǎn)物的后修飾使目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能更接近于天然，同時酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量高，已有大量外源基因通過酵母獲得表達(dá)，表達(dá)量可達(dá)到g/L水平[18]。

昆蟲死亡素thanatin和斑點(diǎn)叉尾鮰的β-防御素均為廣譜抗菌肽，已受到廣泛研究。蘇鵬[19]、張文杰等[20]、Tanhaeian等[21]都曾對thanatin進(jìn)行了原核、真核的異源表達(dá)。王莎莎等[22]利用酵母X-33菌株表達(dá)了斑點(diǎn)叉尾鮰β-防御素，獲得的抗菌蛋白對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌都具有很好的抑菌效果。

本試驗(yàn)選用昆蟲死亡素thanatin和斑點(diǎn)叉尾鮰β-防御素基因，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pPICZαA-thanatin、pPICZαA-defbl、pPICZαA-TD，利用酵母GS115獲得了重組畢赤酵母工程菌株GS115-pPICZαA-thanatin、GS115-pPICZαA-defbl、GS115-pPICZαA-TD；通過甲醇誘導(dǎo)，獲得了相應(yīng)的重組抗菌肽蛋白，純化后進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)及溶血性試驗(yàn)。在試驗(yàn)設(shè)計上，為盡量避免2種抗菌肽基因的相互干擾，選擇了共表達(dá)方式，2個基因各自表達(dá)，盡可能保證抗菌肽本身功能又可一次性獲得2種抗菌肽，彌補(bǔ)單抗菌肽抗菌譜窄或者抗菌效力不足的缺憾。一同純化，方便操作。同時試驗(yàn)設(shè)計單基因表達(dá)組進(jìn)行對照，探討共表達(dá)組在蛋白表達(dá)量、抑菌效果上是否具有實(shí)際優(yōu)勢。試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)構(gòu)建獲得的3組重組抗菌肽都明顯具有抑制大腸桿菌(K88)、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌的作用，且在150 μg/mL濃度時均不產(chǎn)生紅細(xì)胞溶血作用，相較而言，共表達(dá)TD組蛋白在抑菌效果上具有優(yōu)勢，較單蛋白組對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、無乳鏈球菌的抑制活性明顯提高。

綜上，本試驗(yàn)首次開展昆蟲死亡素thanatin和斑點(diǎn)叉尾鮰β-防御素在畢赤酵母GS115菌株中的重組表達(dá)，獲得了表達(dá)量分別為thanatin組 600 μg/mL，defbl組 300 μg/mL、TD組 700 μg/mL的重組抗菌肽蛋白，溶血性均較低，在抑制革蘭陰性及革蘭陽性細(xì)菌活性方面，均表現(xiàn)出廣譜抗菌性，且共表達(dá)TD組重組蛋白具有明顯優(yōu)于thanatin、defbl組重組蛋白的抑菌活性。本試驗(yàn)為后期重組抗菌肽的臨床應(yīng)用提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。