全國部分地區H9亞型禽流感病毒分子流行病學和遺傳變異分析

馬利芳，牛登云，段寶敏，史秋穎，陳卓，馮敬敬，鮑恩東

(1. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2. 天津渤海農牧產業聯合研究院有限公司，天津 300308)

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，為單股負鏈RNA病毒，是引起家禽呼吸道疾病的主要病因之一。HA蛋白是禽流感病毒最主要的2種表面糖蛋白之一，在AIV復制過程中起關鍵作用，直接參與AIV的致病過程，是AIV的主要毒力因子和保護性抗原。根據HA抗原性不同可將AIV分為18種HA亞型(H1～H18)[1-2]，其中H9亞型禽流感病毒(H9-AIV)是其重要成員，不僅能感染禽類、也能感染豬和人類等哺乳動物。但由于其低致病性特點，往往被人們所忽視，而且H9-AIV也沒有被列入政府強制免疫計劃。近年來，H9-AIV檢出在各地不斷得到報道[3-8]，如從1992年H9N2首次在中國境內出現并開始報道以來，H9-AIV在短短幾年內便發展成為全國大流行，且其HA經歷了從BJ/94 Like、F/98 Like、Y280 Like的逐漸演化[1，9]。在當前中國家禽廣泛接種禽流感疫苗的大環境下，H9-AIV正不斷發生變異以逃避疫苗的選擇性壓力。因此，對于H9-AIV的全面監測，不僅對中國家禽的養殖、疫病防控具有重要意義，而且由于H9-AIV是高致病性AIV的重要基因供體，監測其變異方向對人類健康也同樣重要。本文就2020—2021年間中國家禽間H9-AIV的流行特點和變異情況進行了調研。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本研究收集的臨床樣本，主要包括拭子(咽喉拭子或泄殖腔拭子)、組織樣本、死雞等。檢測樣品主要為2020—2021年收集到的來源于山東、遼寧、河北、河南等省份的10 336份疑似H9亞型禽流感發病肉雞(如AA、科寶、817等)和蛋雞(如海蘭灰、海蘭褐)的臨床樣本。

1.2 儀器設備及材料

PCR儀(型號T100)為美國伯樂公司產品；核酸提取儀(型號NP968)為天隆公司產品；高通量組織研磨儀(型號SCIENTZ-48)為寧波新芝生物科技有限公司產品；低溫冷凍離心機(型號5427R)為eppendorf公司產品；RNA酶抑制劑(RRI)、逆轉錄酶(M-MLV)等均購自寶生物工程(大連)有限公司；RT-PCR/PCR相關試劑均購自北京全式金生物技術有限公司；檢測病毒分離用SPF雞胚均購自梅里亞或濟南賽斯公司；檢測及測序引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

M. DL1000 DNA Marker；1～6. 檢測樣品；7. 陽性對照

1.3 引物設計與合成

檢測引物參照NY/T 772—2013提供的H9-AIV基因的引物序列：H9-487-F為5′-CTCCACACAGAGCAYAATGG-3′；H9-487-R為5′-GYACACTTCTTCTTCTRTCG-3′，引物擴增長度為487 bp。

在NCBI中查找到HA基因的參考核苷酸序列，設計HA測序引物：H9-F為5′-AGCAAAAGCAGGGGAATG-3′；H9-R為5′-TTATATACAAATGTTGCATCTGCAAG-3′，引物擴增長度為1 683 bp。引物委托北京擎科新業生物技術股份有限公司合成。

1.4 樣品處理

針對不同樣本，將采集到的拭子溶解在滅菌PBS中待檢，或將采集到的組織樣本或病死雞樣本(重點采集氣管、脾臟、肺臟、肝臟、腎臟等)用剪刀剪碎，加入等體積PBS，反復凍融3次，用組織研磨儀打碎，10 000 r/min離心10 min，取上清液至4 ℃待檢。

1.5 核酸提取和RT-PCR鑒定

用移液器吸取200 μL上清液用核酸提取儀提取RNA，進行反轉錄。反轉錄體系為：隨機引物(25 μmol/L)4 μL、RNase free H2O 20 μL、模板RNA 4 μL，總體積為28 μL。反應程序為：70 ℃ 10 min后迅速在冰上急冷2 min以上。在上述管中加入下列反轉錄反應液：5×M-MLV Buffer 8 μL、dNTP Mixture(各10 mmol/L)2 μL、RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL、M-MLV(200 U/μL)1 μL，總體積為40 μL。反應程序為：42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min后冰上冷卻，得到的cDNA溶液用于PCR擴增。

20 μL檢測用擴增體系：ddH2O 11.6 μL、10×Buffer 2 μL、dNTP Mixture 1.6 μL、引物H9-487-F/R 1.0/1.0 μL，TaqDNA酶 0.3 μL、cDNA 模板2.5 μL，總體積20 μL。反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，擴增34個循環；72 ℃延伸10 min。擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 病毒分離

將RT-PCR檢測陽性的病料經雙抗處理后，接種9～10日齡SPF雞胚，每胚100 μL，棄去24 h內死亡的雞胚，以后每隔8 h照胚1次，記錄雞胚死亡時間，接種后72 h收獲尿囊液，進行血凝和血凝抑制試驗。

1.7 測序和分析

將病毒分離結果為陽性的尿囊液提取核酸，進行RT-PCR，膠回收產物送測序公司進行測序。拼接后的序列與GenBank中的參考序列(表1)，用MegAlign軟件進行同源性比對，利用MEGA 5.0軟件進行遺傳進化分析。

表1 參考毒株序列在NCBI上的登錄信息

50 μL測序用擴增體系：ddH2O 20.5 μL、10×Buffer 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、引物H9-F/R 2.5/2.5 μL、rTaqDNA酶0.5 μL、cDNA模板2.5 μL，總體積為50 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，50～52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴增34個循環；72 ℃延伸10 min。12 ℃保存。

2 結果

2.1 H9-AIV檢測率

統計H9-AIV核酸檢測結果發現，2020—2021年期間送檢的10 336份樣品中，有1 665份樣品為H9-AIV檢測陽性，圖1顯示的是其中部分樣品的RT-PCR鑒定電泳結果，H9-AIV陽性率為16.1%。

從檢測樣品的發病雞類型分析，商品肉雞的檢出率最高，其次為商品黃雞，父母代比商品代檢出率低表2。從送檢樣本的月份檢出率來看，2020年秋季到2021年春季期間，H9-AIV陽性檢出率較高(表3)。

表2 2020—2021年不同類型雞H9-AIV檢出統計

表3 2020—2021年H9-AIV檢出統計

2.2 病毒分離

選擇RT-PCR檢測陽性的部分樣品進行雞胚接種以分離病毒，共獲得920株H9-AIV，分離率為92.2%(920/998)，其中12份是尿囊腔接種呈陰性后，通過卵黃囊接種或絨毛尿囊膜接種呈陽性。病毒接種雞胚后，棄掉24 h內死亡雞胚，剩余雞胚出現胚體表面有針尖大小的紅點、全身發紅、弱胚等病變；部分樣品在48～72 h內死亡，死亡雞胚剖檢出現內臟出血等病變(圖2)。

A、B. 雞胚病料接種后的病變；C、D.正常雞胚

2.3 HA基因同源性及遺傳進化分析

對代表性分離毒株進行HA基因測序后，共獲得464條HA序列，對上述序列進行基因同源性和遺傳進化分析。結果顯示，分離株與歐亞譜系F98 like代表毒株A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別在85.5%～91.0%和84.5%～93.8%，而與Y280 like代表毒株A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)核苷酸和氨基酸同源性分別在86.8%～92.0%和85.6%～94.6%，與WJ57核苷酸和氨基酸同源性分別在92.2%～99.9%和89.6%～99.8%。

遺傳進化分析結果顯示，2020—2021年全部采集后分離的毒株都屬于h9.4.2.5分支，與其他的參考毒株相比，本研究中所分離的毒株與WJ57毒株的遺傳關系較近。但在此分支上，根據遺傳距離的遠近，選取部分有代表性的分離毒株序列進行遺傳進化分析，結果見圖3。進化樹共分為4個亞分支，其中21株分離毒株(4.5%，21/464)屬于h9.4.2.5.1分支；101株分離毒株(21.8%，101/464)屬于h9.4.2.5.2分支；22株分離毒株(4.7%,22/464)屬于h9.4.2.5.3分支;320株分離毒株(69.0%,320/464)屬于h9.4.2.5.4分支。

2.4 關鍵氨基酸位點分析

HA基因裂解位點對于AIV的致病力至關重要，本研究對測得的H9-AIV HA基因氨基酸序列進行分析，發現464株分離毒株中共有457株氨基酸裂解位點(335～338位氨基酸，本研究中全文采用H9編碼序號)為R-S-S-R，3株為R-A-S-R，4株為R-S-N-R，均為典型的低致病性禽流感病毒特征性序列，這與之前的研究結果[13-14]一致。

本研究分析比較了H9-AIV分離毒株HA蛋白的11個受體結合位點(109、146、161、92、191、198、202、203、234、235、236位氨基酸)，發現共有459株(459/464)第234位受體結合位點由Q突變為L，其他分離毒株分別突變為F/G/V；有92株(92/464)第198位受體結合位點為A，211株為T，154株為V，其余分離毒株分別突變為(H/K/M/Y)。其余受體結合位點均相對保守。此前有報道稱，HA基因第381位氨基酸(對應H3第363位氨基酸)是影響H9-AIV的氣溶膠特性的關鍵位點[16]，本研究中427株分離毒株(92.0%，427/464)的該位點氨基酸由R突變為K，表明大多數分離毒株可能具有氣溶膠的傳播能力。

分析潛在糖基化位點結果顯示，共計434株分離毒株與WJ57毒株的潛在糖基化位點一致，均為7個糖基化位點(29、141、298、305、313、492、551)；7株含有8個潛在糖基化位點(其中6株由于在145位氨基酸S突變為N，由此增加1個潛在糖基化位點)；14株分離毒株含有6個潛在糖基化位點，主要原因是缺少第29位或313位潛在糖基化位點。與F98 like和Y280 like相比，2020—2021年送檢的H9-AIV已缺失了218位的潛在糖基化位點，新增加了313位潛在糖基化位點，這與資料報道的我國華東地區(2016—2020年)的H9N2變異基本一致[9，17]，而與古小兵[18]所報道(2011—2012年)的研究結果不同，說明H9-AIV已經逐步發生變異，且變異趨勢非常顯著。

3 討論

在以往的研究中，人們普遍認為分離AIV的最好是通過尿囊腔途徑接種雞胚。但有些毒株分離失敗時，也可通過卵黃囊或絨毛尿囊膜途徑接種分離[19]，這一方法在本研究中也得到了有效應用。

本研究對分離毒株的HA基因進行了遺傳進化分析，結果顯示送檢的所有H9-AIV分離毒株全部屬于h9.4.2.5分支，且逐步演化出新的4個亞分支，而且主要位于h9.4.2.5.4分支上。本試驗中共有459個分離毒株的受體結合位點第234位氨基酸由Q突變為L，占總樣本的98.9%(459/464)。這與此前所報道的結果基本一致，預示H9-AIV進一步增強了對哺乳動物的α-2，6-Gal受體的結合能力；本研究中427株分離毒株(92.0%，427/464)的HA蛋白第381位氨基酸由R突變為K，但H9N2亞型AIV必須同時在PA的672位氨基酸為L，且HA的363位為K時才能進行氣溶膠傳播感染，另有其他次要因素也可影響病毒的氣溶膠傳播特性[16]。因此，本研究中的分離毒株是否具有氣溶膠傳播特性還需進一步研究才能確定。本研究中的分離毒株發生了HA基因第218位糖基化位點缺失和313位潛在糖基化位點增加。此前有報道稱，這可能會影響H9-AIV對雞和雞胚的感染力及病毒在組織中的復制能力，但并不會影響病毒的抗原特性[20]。這對進一步分離和篩選H9-AIV疫苗候選毒株而言具有重要指導意義。

相比于其他亞型，H9亞型AIV的致病性低，但長期帶毒會導致雞只出現呼吸道癥狀和蛋雞產蛋量下降的現象[21-22]。雞感染H9亞型AIV后容易引起免疫抑制，進而繼發感染其他病原，死亡率高，造成較大經濟損失。Hu等[4]在研究2013—2017年從中國湖北分離出的H9N2時發現，其分離毒株與人源H9N2、高致病性AIV H10N8、H5N2、H5N6和H10N6的內源基因高度同源。研究認為，H9N2型AIV可能會充當其他AIV的基因供體，或者可能與其他AIV發生基因重組，從而造成危害性更大的新病毒病的流行[7，18，23-24]。一旦高致病性AIV通過氣溶膠形式傳播，那對社會造成的威脅將是不可估量的。綜上，全面監測H9亞型AIV的變異具有重大意義。