PEDV感染過程中TRIM5α介導(dǎo)的自噬對病毒復(fù)制的影響

朱嘉樂，王梓行，郭嘉，朱德馨，魏春燕，史超，張偉，孫志華，張輝

(新疆石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

豬流行性腹瀉(porcien epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcien epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種接觸性腸道傳染病，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展[1]。PEDV屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬成員，是一種有囊膜包被的單股正鏈RNA病毒[2]。仔豬感染后其臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重嘔吐、腹瀉、精神抑郁及食欲下降等，最后因消瘦、嚴(yán)重脫水而死亡[3]。

自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種降解機(jī)制，細(xì)胞通過這種機(jī)制將有毒的聚集體、受損的細(xì)胞器和感染物從細(xì)胞質(zhì)中移除，或者通過將其降解達(dá)到代謝的目的。同時自噬也可作為一種促進(jìn)細(xì)胞生存的機(jī)制發(fā)揮作用，負(fù)責(zé)溶酶體的降解和細(xì)胞質(zhì)再循環(huán)[4]。病毒感染細(xì)胞可引起細(xì)胞自噬，自噬同樣會影響病毒復(fù)制[5]。如豬瘟病毒感染可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬并促進(jìn)完整的自噬過程，自噬過程有利于豬瘟病毒的復(fù)制[6]，同時也有研究表明，自噬可以抑制PEDV的復(fù)制[19]。

三結(jié)構(gòu)域蛋白5α(tripartite motif protein 5α，TRIM5α)是TRIM蛋白家族重要成員，由RING、B-box、Coiled-coil和PRYSPRY 4個結(jié)構(gòu)域組成[7]，TRIM5α對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)存在抑制作用[7]，TRIM21通過核衣殼蛋白的蛋白酶體降解抑制PEDV增殖[8]，但TRIM5α對PEDV的調(diào)控作用鮮有報道。

本研究利用PEDV感染Vero-E6細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，通過實(shí)時熒光定量技術(shù)檢測TRIM5α在PEDV感染Vero-E6細(xì)胞過程中的表達(dá)量，進(jìn)而通過RNA干擾技術(shù)合成TRIM5α干擾片段檢測其是否會對Vero-E6細(xì)胞自噬和PEDV復(fù)制產(chǎn)生影響，初步證明TRIM5α通過促進(jìn)Vero-E6細(xì)胞自噬并抑制PEDV在Vero-E6細(xì)胞中的復(fù)制，為揭示TRIM5α在PEDV感染Vero-E6細(xì)胞過程中發(fā)揮調(diào)控作用提供理論依據(jù)，為PED的防控和藥物新靶點(diǎn)的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與毒株

非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero-E6)和PEDV毒株均由新疆石河子大學(xué)動物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM basic(1×)、胰酶和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；UltraSYBR Mixture(Low ROX)熒光定量染料，Ultrapure RNA Kit超純RNA提取試劑盒均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化科技(北京)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑購自上海碧云天生物技術(shù)公司；LC3A/B Rabbit mAb購自Cell Signaling Technology(CST)公司；HRP AffiniPURE Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)購自Earthox公司；高敏性ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自南京諾維贊生物科技股份有限公司。

1.3 引物序列設(shè)計及siRNA

根據(jù)GenBank中公布的PEDV N基因序列(MT787025.1，MW560716.1)、PEDV ORF3基因序列(MZ342899.1)、TRIM5α基因序列(AY625003.1)、GAPDH基因序列(XM_028828781.1)設(shè)計相應(yīng)引物，引物由生工生物工程公司合成。TRIM5α的3條siRNA由安徽通用生物公司設(shè)計并合成(表1)。

表1 引物及干擾片段

1.4 半數(shù)組織細(xì)胞感染量(TCID50)測定

取處于對數(shù)生長期的Vero-E6細(xì)胞平鋪于96孔板，將待測病毒液經(jīng)10倍依次稀釋，分別感染細(xì)胞。每孔感染100 μL病毒稀釋液，對照孔感染100 μL稀釋緩沖液。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，觀察并記錄96孔板中發(fā)生病變的孔數(shù)，采用Reed-Muench法測定TCID50。

1.5 PEDV感染Vero-E6細(xì)胞N基因的鑒定

取對數(shù)生長期的Vero-E6細(xì)胞，以MOI=1 PEDV接種至Vero-E6細(xì)胞，感染3～4 d后，利用RNA提取試劑盒提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板，使用PEDV-N(MT787025.1)的特異性引物進(jìn)行N基因的擴(kuò)增。取20 mL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過凝膠成像儀觀察目的條帶。

1.6 Western blot檢測LC3Ⅱ表達(dá)水平

以MOI=1的PEDV感染Vero-E6細(xì)胞，分別在0、6、12、24、36和48 h收集被感染細(xì)胞，裂解液裂解后，12 000 r/min，離心10 min，收取上清液制備蛋白樣品，用BCA法檢測蛋白濃度并定量。經(jīng)SDS-PAGE電泳，90 V恒壓6 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，以兔抗LC3A/B單抗為一抗，以HRP 標(biāo)記的山羊抗兔為二抗，ECL顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀拍照保存。

1.7 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測TRIM5α的表達(dá)水平

以PBS為對照，分別在0、6、12、24、36和48 h后收集細(xì)胞并提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA。以GAPDH(XM_028828781.1)為內(nèi)參基因，熒光定量PCR定量檢測TRIM5α基因的mRNA表達(dá)水平(每組各3個重復(fù))。程序設(shè)定采用三步法熒光定量PCR，熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變形10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共50個循環(huán)。使用2-ΔΔCt計算TRIM5α的相對表達(dá)量。

1.8 利用RT-qPCR檢測siRNA干擾效率

將siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3分別轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，利用RNA提取試劑盒提取干擾后細(xì)胞總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以其為模板，采用TRIM5α(AY625003.1)的定量引物對其進(jìn)行相對定量檢測，計算siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3的干擾效率。

1.9 干擾TRIM5α對細(xì)胞自噬和病毒復(fù)制的影響

根據(jù)1.8結(jié)果將siRNA-2轉(zhuǎn)染Vero-E6細(xì)胞并設(shè)立對照組。細(xì)胞生長至70%～80%時接種MOI=1的病毒。按照1.6方法收集被病毒感染48 h的細(xì)胞，檢測LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)水平。同時提取被病毒感染48 h細(xì)胞的總RNA，利用1.7的方法，以PEDV-N和PEDV-ORF3的定量引物檢測N和ORF3基因的mRNA表達(dá)水平。通過Reed-Muench法測定干擾TRIM5α組和對照組病毒TCID50。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

每個試驗(yàn)均重復(fù)3次。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析比較兩組間均數(shù)差異，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05，差異顯著，P<0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 病毒TCID50測定

PEDV感染Vero-E6細(xì)胞后，觀察并記錄96孔板中發(fā)生病變的孔數(shù)，采用Reed-Muench法測定TCID50，結(jié)果見表2。

表2 PEDV TCID50的測定

距離比=(61.5-50)/(61.5-21.4)=0.3，lgTCID50=(-1)×0.3+(-6)=-6.3，所以病毒液的TCID50為10-6.3/mL。

2.2 PEDV 感染Vero細(xì)胞N基因鑒定

以MOI=1的PEDV感染Vero-E6細(xì)胞48 h后觀察到明顯的細(xì)胞病變，與對照組相比，接毒組的細(xì)胞呈現(xiàn)出表面粗糙、明顯皺縮、細(xì)胞膜融合、細(xì)胞聚集成團(tuán)形成合胞體及大量脫落的現(xiàn)象。提取細(xì)胞總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，使用PEDV-N的特異性引物擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在1 326 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。說明PEDV成功感染Vero-E6細(xì)胞，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

M. DL2000 DNA Marker；1，2，3. N基因產(chǎn)物；4. 陰性對照

2.3 PEDV感染Vero-E6細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞自噬

PEDV感染Vero-E6細(xì)胞0、6、12、24、36、48 h后，收集總蛋白，利用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)量隨著感染時間的增加而增多(圖2A)；進(jìn)一步利用Image J對蛋白進(jìn)行定量分析并繪制柱狀圖，結(jié)果顯示LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)量在48 h最高，且與對照組相比差異顯著(P<0.01)，見圖2B。

2.4 RT-qPCR檢測TRIM5α相對表達(dá)量

用RT-qPCR檢測PEDV感染Vero-E6細(xì)胞0、6、12、24、36、48 h時TRIM5α的表達(dá)情況，結(jié)果見圖3。在PEDV感染Vero-E6細(xì)胞0、12、24、48 h時，TRIM5α的相對表達(dá)量逐漸升高且在48 h時表達(dá)量最高，且與PBS對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

與PBS組相比，**表示P<0.01，***表示P<0.001

2.5 干擾片段篩選及干擾后LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3后，RT-qPCR檢測TRIM5α表達(dá)情況的結(jié)果見圖4。圖4A顯示siRNA-2的干擾效率最高，干擾效率為 85%。Vero-E6細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-2后，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%接種病毒時，Western blot結(jié)果顯示，接毒48 h后自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)明顯降低，自噬受到抑制(圖4B)。

A. 未轉(zhuǎn)染siRNA-2的PEDV感染Vero-E6細(xì)胞試驗(yàn)組；B. 轉(zhuǎn)染siRNA-2的PEDV感染Vero-E6細(xì)胞試驗(yàn)組；C. PEDV N、ORF3 mRNA表達(dá)水平；D. 干擾組與對照組病毒滴度變化

2.6 干擾TRIM5α細(xì)胞病變觀察和N、ORF3基因表達(dá)檢測

Vero-E6細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-2后，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%后接毒，并在接毒后48 h觀察細(xì)胞病變，與未干擾組相比(圖5A)，干擾組細(xì)胞呈現(xiàn)出更加明顯的細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜融合、細(xì)胞聚集成團(tuán)形成合胞體且存在大量脫落的現(xiàn)象(圖5B)。干擾TRIM5α后，通過RT-qPCR檢測N、ORF3基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，2個基因的表達(dá)量均升高(圖5C)，且干擾組病毒滴度明顯高于對照組(圖5D)，表明PEDV感染Vero-E6細(xì)胞過程中干擾TRIM5α?xí)龠M(jìn)PEDV復(fù)制。

3 討論

PEDV能使各個年齡段的豬只感染發(fā)病，尤其是對10日齡以內(nèi)仔豬的感染最為嚴(yán)重，豬只發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%[9]。我國從1973年開始出現(xiàn)有關(guān)PED的報道，1984年研究人員利用熒光標(biāo)記的抗原和血清中和試驗(yàn)鑒定了該病的抗原，從而確定了PED在我國出現(xiàn)[10]。由于PEDV的S基因的高突變率和跨國傳播極大地促進(jìn)了該病毒突變與流行[11]。高毒力PEDV毒株傳播速度快、仔豬致死率高。亞洲經(jīng)典PEDV弱毒疫苗針對變異毒株的保護(hù)效果并不理想，所以新型PEDV毒株的高效疫苗的研發(fā)、新藥物靶點(diǎn)的尋找迫在眉睫。本試驗(yàn)從蛋白水平出發(fā)，探究TRIM5α通過細(xì)胞自噬對PEDV復(fù)制的影響。

TRIM家族存在于所有動物體內(nèi)，是包含了較多蛋白的一個相當(dāng)大的家族，參與細(xì)胞周期、增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳遞、損傷修復(fù)、炎癥免疫等幾乎一切生命活動的調(diào)控[12]。多項研究證明，TRIM家族分子可通過多種途徑調(diào)節(jié)自噬，包括調(diào)控自噬相關(guān)信號通路、調(diào)節(jié)自噬核心分子、作為自噬底物識別受體等[13]。TRIM5α 具有E3泛素連接酶活性[14]，存在于細(xì)胞質(zhì)中，能夠抑制包括HIV-1在內(nèi)的一些逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染。TRIM蛋白參與了細(xì)胞的眾多生命進(jìn)程，在細(xì)胞自噬和病毒感染中發(fā)揮重要作用。TRIM蛋白參與了病毒和非病毒誘導(dǎo)的自噬過程，其中TRIM5α在自噬過程中起關(guān)鍵作用[15]。TRIM5α發(fā)揮其限制活性是通過識別包裹病毒基因組RNA的衣殼蛋白，從而準(zhǔn)確靶向病毒核心。自噬因子和TRIM5α、TRIM6、TRIM16、TRIM17、TRIM20、TRIM22、TRIM49和TRIM55之間的相互作用是緊密且廣泛的，并且涉及調(diào)節(jié)劑和效應(yīng)物(ULK1、Beclin1、mAtg8s和p62/sequestosome1)。TRIM5α可以通過依賴于與mAtg8s相互作用的方式直接識別靶標(biāo)的氨基酸序列來靶向逆轉(zhuǎn)錄病蛋白衣殼用于自噬降解[16]。在本試驗(yàn)中干擾TRIM5α的內(nèi)源性表達(dá)，可導(dǎo)致LC3Ⅱ的表達(dá)量降低，說明TRIM5α促進(jìn)自噬發(fā)生。

自噬與病毒感染的關(guān)系錯綜復(fù)雜，既可促進(jìn)一些正鏈RNA病毒的復(fù)制，也可抑制單純皰疹病毒和人類免疫缺陷病毒等病毒的復(fù)制，這與病毒的類型或宿主密切相關(guān)[17]。研究報道豬細(xì)小病毒感染ST細(xì)胞可誘發(fā)自噬并促進(jìn)病毒的復(fù)制[18]。研究者用PEDV感染自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)降低了PEDV滴度，而自噬抑制劑3-MA處理細(xì)胞后，提高了PEDV的滴度，表明自噬可以抑制PEDV的復(fù)制[19]。本研究證實(shí)PEDV感染Vero-E6過程中TRIM5α的干擾導(dǎo)致細(xì)胞自噬受到抑制，與此同時，當(dāng)細(xì)胞自噬受到抑制時，PEDV的N、ORF3 2個基因的表達(dá)量上調(diào)且出現(xiàn)典型的細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜融合、細(xì)胞大量脫落等情況，初步證實(shí)了TRIM家族的抗病毒作用，同時為防控PED提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上，本研究證實(shí)TRIM5α在PEDV感染Vero-E6細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞自噬中發(fā)揮促進(jìn)作用，干擾TRIM5α后，LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)量明顯降低，細(xì)胞自噬受到抑制，其主要機(jī)制是TRIM5α抑制PEDV在Vero-E6細(xì)胞中的復(fù)制。這一結(jié)果不僅從蛋白和mRNA水平上印證細(xì)胞自噬和PEDV感染的關(guān)系，同時也將TRIM家族和病毒復(fù)制建立聯(lián)系，為抗PEDV新型藥物靶點(diǎn)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。