丹皮酚對LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞炎性損傷的緩解作用

楊明，李可，賈麗，武英豪，林倩穎，袁麗寧，李連敏，馬玉忠

(河北農業大學動物醫學院，河北 保定 071001)

奶牛乳房炎會導致奶牛產奶量下降，飼養成本增加及奶牛淘汰率上升，嚴重影響奶牛養殖產業的發展。有研究表明，奶牛乳房炎主要由病原微生物侵入乳房組織引起[1]，這些病原微生物的種類可達150多種，其中主要致病菌為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌[2]。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分之一，是導致體內外炎癥反應的重要刺激因素，臨床上常用來建立各種炎性模型[3]。LPS能與細胞表面的TLR4樣受體結合，激活NF-κB信號通路，促進IL-1β、IL-6、IL-8等炎性因子的表達和釋放，促進炎癥的發展[4-5]。在國內，抗生素仍是預防和治療奶牛乳房炎的主要方法，但隨著抗生素的大量使用導致耐藥菌株出現以及藥物殘留的問題日益凸顯，給人類及動物健康造成了嚴重威脅。因此尋找抗生素的替代藥物，已成為當下發展的必然趨勢[6]。丹皮酚是牡丹根莖的提取物，具有良好的抗炎、神經保護、抗氧化應激、抗腫瘤、預防心血管疾病的作用[7]，因其具有無毒，低殘留的特點，在治療奶牛乳房炎方面具有巨大的應用潛力[8]。目前，丹皮酚對奶牛乳房炎的治療作用及機理尚不明確，本研究利用LPS建立奶牛乳房炎體外炎癥模型，探討丹皮酚對細胞炎性反應的潛在作用，為后續臨床治療奶牛乳房炎奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

丹皮酚購自大連美侖生物技術有限公司；LPS購自Gentihold公司；DMSO、CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、BCIP/NBT底物顯色試劑盒、RIPA高效裂解液、DAPI染色液均購自Solarbio公司；牛TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒購自上海酶聯生物有限公司；DMEM/F12培養基購自Gibco公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份公司；胰蛋白酶購自Amresco公司；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購自北京康為公司；IкBα抗體購自Cell Signaling Technology公司；p-IкBα、p-p65、p65、β-actin抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；2× Fast Super EvaGreen qPCR Mastermix購自US Everbright公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司。

1.2 細胞活力檢測

試驗分為空白對照組、0加藥組、丹皮酚處理組(10、20、50、80、100 mg/L)，每組設3個孔。空白對照組不添加細胞，丹皮酚處理組將細胞按1×104個/孔接種于96孔板中，待細胞貼壁后加入不同濃度的丹皮酚，于37 ℃、5% CO2條件下孵育12 h，使用CCK-8試劑盒檢測細胞活力。計算公式如下：

細胞活力=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0 加藥)-A(空白)]×100%，A表示吸光度。

1.3 試驗分組及處理

將奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基于37 ℃、5% CO2條件下孵育12 h。進行如下處理。

空白對照組(Con)：用無血清培養基培養24 h后繼續用無血清培養基培養12 h。

LPS組：用含20 mg/L LPS 的無血清培養基孵育24 h后繼續用無血清培養基培養12 h。

LPS+(低、中、高)丹皮酚處理組：用含20 mg/L LPS的無血清培養基孵育24 h后，換含20、50、100 mg/L丹皮酚的無血清培養基培養12 h，3個組別分別命名為Low、Mid和Hig。

1.4 熒光定量PCR(RG-qPCR)

將培養好的BMECs 用PBS清洗3次，使用超純RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，用NanoDrop2000檢測RNA的濃度和純度。隨后用逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄為cDNA，進行RT-qPCR反應，采用2-ΔΔCt計算目的基因的mRNA表達情況，通過標準曲線分析法來確定RT-qPCR的擴增效率。

反應程序為：預變性，95 ℃ 300 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個循環。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 氧化應激指標檢測

將BMECs用PBS清洗3次，每孔內加入適量RIPA裂解液，待細胞裂解充分后，12 000 r/min，離心5 min，取上清液。使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測細胞蛋白濃度，并使用試劑盒測定細胞氧化應激因子的含量。

1.6 細胞凋亡檢測

將培養好的BMECs用PBS清洗1次，根據Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明對細胞進行染色，隨后于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.7 Western blot

配置濃縮膠、分離膠進行SDS凝膠電泳檢測，半干法轉膜，脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜，一抗4 ℃過夜，TBST洗膜，二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜，BCIP/NBT試劑盒顯色。IκBα、p-IκBα抗體稀釋倍數為1∶1 000，p65、p-p65、β-actin抗體稀釋倍數為1∶2 000。

1.8 統計與分析

試驗數據使用SPSS 19.0進行 One-way ANOVA分析，使用GrarhPad Prism 8.0繪制圖表，結果用“平均值±標準差”表示。差異顯著性判斷以P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 丹皮酚對BMECs活力的影響

由圖1可知，10～100 mg/L的丹皮酚處理BMECs后，各劑量組細胞活力均有上升，但差異不顯著 (P>0.05)。本試驗選取對細胞活力無顯著影響的20、50、100 mg/L的丹皮酚作為后續低、中、高處理劑量。

圖1 不同濃度丹皮酚處理BMECs后的細胞活力

2.2 丹皮酚對 IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達的影響

如圖2所示，與對照組相比，LPS組IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，丹皮酚低、中、高劑量的IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相對表達量均顯著降低(P<0.05)。

同一指標中不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；下同

2.3 丹皮酚對SOD、MDA、GSH-Px活性及含量的影響

由圖3A可知，與對照組相比，LPS組SOD活性顯著降低(P<0.05)，而中劑量和高劑量的丹皮酚能顯著升高SOD活性(P<0.05)。由圖3B可知，與對照組相比，LPS組MDA含量顯著升高(P<0.05)，而高劑量的丹皮酚能顯著抑制MDA含量的升高(P<0.05)；由圖3C可知，與對照組相比，LPS組GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；丹皮酚高劑量組同LPS組相比GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。

圖3 SOD、MDA、GSH-Px的活性及含量變化

2.4 丹皮酚對細胞凋亡的影響

由圖4可知，LPS處理組相較于對照組凋亡細胞數量明顯增多，而使用中劑量丹皮酚處理后抑制了LPS誘導的細胞凋亡。

A.凋亡細胞包含早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞；早期凋亡細胞僅發出綠色熒光(Annexin V-FITC陽性，PI陰性)，晚期凋亡細胞發出綠色和紅色熒光(Annexin V-FITC陽性，PI陽性)，正常細胞無熒光(Annexin V-FITC陰性，PI陰性)；標尺=100 μm；B.各組陽性細胞數統計；數值來自于3個獨立試驗中的5個視野

2.5 丹皮酚對IκBα、p-IκBα、p65、p-p65蛋白表達的影響

與對照組相比，LPS組極顯著提高了IκBα、p65蛋白的磷酸化水平(P<0.05)(圖5B、5C)，而低、中、高劑量的丹皮酚均能顯著抑制IκBα (圖5B)、p65 (圖5C)磷酸化水平的升高(P<0.05)。

圖5 丹皮酚對BMECs中NF-κB信號通路的影響

3 討論

抗生素對畜牧業發展作出了重大貢獻[9]，但隨著抗生素的大量應用，耐藥菌株及藥物殘留問題愈發嚴重，引起人們對動物生產活動的擔憂。因此尋找有效、綠色、低毒、易得、價廉的替抗藥物迫在眉睫。目前，多種無抗治療方法可用于防治奶牛乳房炎，如中藥、細胞因子、乳酸菌、微生態制劑等[10]。丹皮酚作為一種中藥提取物，具有多種藥理作用，抗炎作用便是其中之一。研究表明，丹皮酚能抑制炎性細胞因子分泌，調節相關激酶及信號通路的活性，發揮抗炎作用[11]。季力同等[12]發現丹皮酚可以顯著降低急性胰腺炎模型大鼠血清的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量，從而減輕急性胰腺炎造成的病理損傷。劉海濤[13]發現丹皮酚可以調節NF-κB信號通路，抑制LPS引起的奶牛子宮內膜上皮細胞炎性損傷。Liu等[14]研究表明丹皮酚通過抑制IL-1β的分泌，從而發揮治療大鼠骨關節炎的作用。Himaya等[15]研究表明丹皮酚能抑制NF-κB和MAPK信號通路，阻斷LPS誘導的BV-2和RAW264.7細胞的炎癥反應。因此推測，丹皮酚在治療奶牛乳房炎方面同樣具有良好的作用。

LPS作為一種具有代表性的促炎物質，可激活NF-κB信號通路，從而促進其下游炎癥因子的產生，加重炎癥的發展進程。Liu等[16]使用LPS成功建立了奶牛乳房炎體內外炎癥模型。本試驗使用20 mg/L的LPS處理BMECs后，IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著升高，表明炎癥模型成功建立。而經過丹皮酚處理后，IL-6、IL-1β、TNF-α含量有不同程度的下降，中、高劑量的丹皮酚能顯著抑制細胞中IL-1β的表達，同時高劑量丹皮酚對細胞IL-6、TNF-α也有顯著抑制作用，表明丹皮酚抑制細胞炎性因子的表達與作用劑量有一定的關系。LPS在刺激細胞炎性進展中，能使細胞產生氧化應激損傷，并誘導細胞凋亡的發生，同時產生多種復雜的生理作用[17-18]。

在乳房炎發展過程中，氧化應激對疾病的發展同樣發揮重要的作用，SOD是生物體內抗氧化酶系的重要成員之一，可催化體內的超氧陰離子分解為氧和過氧化氫，從而減緩超氧陰離子對機體的損傷。MDA屬于脂質過氧化物，它的含量可間接反映出機體細胞損傷的嚴重程度。GSH-Px是機體內重要的自由基捕獲酶之一，不僅具有清除自由基和衍生物的作用，還減少脂質過氧化物的形成，增強機體抗氧化損傷的能力[19-21]。本研究發現，當LPS作用于BMECs后，細胞的SOD和GSH-Px的活性顯著降低，MDA的含量顯著升高，表明此時細胞的抗氧化能力下降并出現氧化應激損傷；而丹皮酚處理后可逆轉這些變化，表明丹皮酚能提高細胞抗氧化能力，緩解細胞損傷，對治療奶牛乳房炎具有積極的作用。細胞凋亡是機體主動地適應內環境變化的過程，與細胞炎性損傷過程密切相關。有研究表明，植物提取物對細胞凋亡有良好的調節作用。朱海泉等[22]研究發現，川芎嗪有抑制NF-κB p65磷酸化對LPS誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡的作用。Akhtar等[23]發現，石榴果提取物對創傷性關節炎兔軟骨細胞凋亡有良好的調節作用。本試驗使用丹皮酚處理LPS炎性模型后，凋亡細胞數量明顯減少，說明丹皮酚對細胞凋亡有一定的抑制作用。

NF-κB是細胞內重要的核轉錄因子，參與機體的炎癥反應、免疫應答、細胞凋亡和應激等過程。NF-κB的過度激活，與人類許多疾病如類風濕關節炎、心臟與腦部疾病的炎癥變化密切相關[24]。當LPS等促炎物質進入機體后，與細胞表面的TLR4結合，導致后者的構型的改變，進而使IκB磷酸化釋放NF-κB p65。細胞質中游離的p65進入細胞核后發揮促炎等復雜生理功能[25]。本試驗結果表明，當LPS作用于BMECs后，IκBα和p65的磷酸化水平升高，而不同劑量的丹皮酚降低了IκBα和p65的磷酸化水平。說明丹皮酚抑制了NF-κB信號通路的活性，抑制炎癥反應，這與賈紅豆[5]和劉逸煊等[26]的研究結果一致。綜上所述，丹皮酚能抑制BMECs中NF-κB信號通路的活性和炎性基因的表達，緩解造成的炎性損傷，對治療奶牛乳房炎具有良好的效果。由于體外細胞模型無法完全復制生物體復雜的內環境，丹皮酚在牛體上的治療效果和作用機理仍需進一步研究。