AMPK/MTOR信號通路介導脊髓神經元凋亡在樹脂毒素誘導帶狀皰疹后神經痛中的作用▲

蘇 明 張愛民 李 琴 趙 娟 馮鵬玖 黃 倩 秦明秀 黃恒藝

(1 柳州市中醫醫院麻醉科,廣西柳州市 545000; 2 四川省腫瘤醫院.研究所,四川省癌癥防治中心,電子科技大學附屬腫瘤醫院麻醉科,四川省成都市 610041; 3 廣西醫科大學第二附屬醫院疼痛科,廣西南寧市 530007)

帶狀皰疹后神經痛(postherpetic neuralgia,PHN)是由水痘-帶狀皰疹病毒感染引起的疼痛,是臨床上常見的神經病理性疼痛[1]。PHN的臨床表現主要為痛覺過敏、痛覺異常及自發性疼痛,該病遷延不愈,部分患者甚至終身都受影響。口服藥物治療在一定程度上可改善PHN患者的癥狀,但長期服藥易出現難以耐受的不良反應[2]。而神經阻滯治療及微創介入治療需要反復治療,且因PHN的發生和發展機制尚未完全明確,因此療效欠佳。我們在前期研究中發現,采用樹脂毒素誘導的PHN動物模型的脊髓背角組織中神經元凋亡顯著性增加[3],由此推測抑制脊髓背角組織的神經元凋亡可能是治療PHN的重要切入點[4]。但脊髓中樞在接受外周疼痛信號后,疼痛信號是如何誘導脊髓背角組織的神經元發生凋亡,目前并未完全清楚。

單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是真核細胞的重要能量感受器,單磷酸腺苷/三磷酸腺苷值升高時,處于激活狀態的AMPK啟動細胞分解代謝、抑制合成代謝[5]。既往研究表明,AMPK不僅可通過調控蛋白翻譯、抑制炎癥反應、谷氨酸轉運體的表達,以及調節神經元的興奮性等途徑來緩解疼痛[6-8],還可通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,MTOR)磷酸化程度來抑制中樞神經組織的凋亡[9]。但AMPK是否也參與PHN的脊髓組織神經元凋亡過程,目前鮮見有報告。本研究擬在前期研究的基礎上,建立樹脂毒素誘導的PHN大鼠模型,進一步探討AMPK/MTOR信號通路在介導PHN大鼠脊髓組織神經元凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只無特定病原體級SD雄性大鼠均由廣西醫科大學動物實驗中心提供(動物許可號:SCXK桂-2014-0002),體重150～200 g,鼠齡3～4個月。由實驗中心統一飼養大鼠,喂養環境的溫度控制在21 ℃左右,自然晝夜節律,給予大鼠正常飲食、飲水,避免噪聲和強光刺激。將所有大鼠適應性喂養3 d后用于實驗。本研究已獲得廣西醫科大學動物倫理委員會批準。

1.2 試劑與藥品 樹脂毒素(Adooq Bioscience公司,批號:57444-62-9),AMPK激動劑阿卡地新(Acadesine,AICAR;Sigma Aldrich Lab &Production Materials公司,批號:HPA021012),兔抗鼠AMPK α2抗體(Abcam公司,批號:ab105028),兔抗鼠磷酸化AMPK α2 (phosphorylated AMPK α2,p-AMPK α2)抗體(Abcam公司,批號:ab23875),兔抗鼠MTOR抗體(Abcam公司,批號:ab134903),兔抗鼠磷酸化MTOR(phosphorylated MTOR,p-MTOR)抗體(Abcam公司,批號:ab63552),兔抗鼠B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)抗體(Abcam公司,批號:ab182858),兔抗鼠Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體(Abcam公司,批號:ab182733),兔抗鼠Caspase-3抗體(Abcam公司,批號:13847),兔抗鼠GAPDH抗體(Abcam公司,批號:ab8245)。熒光TUNEL試劑盒(Roche公司,批號:TUN11684817),辣根過氧化物酶標記的山羊抗大鼠IgG(上海碧云天生物技術有限公司,批號:A0192),二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,批號:P0012),RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司,批號:ml076982),SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司,批號:P0012A),PVDF膜(上海碧云天生物技術有限公司,批號:FFP19)。

1.3 實驗分組及動物模型的建立 (1)分組:使用SPSS 22.0軟件的隨機數字發生器將30只SD大鼠分為對照組、PHN組、PHN-AMPK激動組(AICAR組),每組10只。(2)相關藥物配置方法:參考文獻[10]的方法配置樹脂毒素溶液,即將樹脂毒素溶解于新鮮配制的吐溫80、乙醇和生理鹽水混合液中(三者的比例為1 ∶1 ∶8),制成濃度為40 μg/mL的樹脂毒素溶液備用。參照說明書配置AICAR,用0.5%二甲基亞砜溶解AICAR后,再用PBS將AICAR稀釋為20 mol/L備用。(3)建模及給藥方法:除對照組外,參考文獻[11]對其余兩組大鼠腹腔注射0.2 μg/g的樹脂毒素以構建PHN模型,如注射樹脂毒素后3 d,與對照組大鼠相比,PHN組與AICAR組大鼠的機械刺激縮足閾值(paw mechanical withdrawal threshold,PMWT)顯著下降且熱刺激縮足潛伏期(paw thermal withdrawal latency,PTWL)顯著延長,則提示建模成功。注射樹脂毒素7 d后,給予AICAR組大鼠腹腔注射10 mg/kg的AICAR,給予PHN組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水,兩組給藥均為1次/d,連續給藥7 d。實驗期間正常喂養對照組大鼠,不給予任何干預。

1.4 標本的獲取與保存 于給藥結束后次日,完成各組大鼠的行為學指標檢測后,使用10%水合氯醛麻醉后處死各組大鼠,獲取L4～6脊髓組織。將一部分脊髓組織立即放入液氮中速凍30 min后取出并置于-80 ℃冰箱保存備用,將另外一部分脊髓組織使用甲醛固定后行石蠟包埋、制作切片備用。

1.5 觀察指標

1.5.1 行為學指標:參考文獻[3],在注射樹脂毒素前1 d及注射樹脂毒素后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d,分別使用Von Frey纖維絲(Danmic Global公司)檢測各組大鼠的PMWT,采用熱板法檢測大鼠的PTWL。(1)PMWT的檢測方法。首先使用0.4 g纖維絲垂直刺激大鼠右側后爪內側同一區域皮膚,每次刺激1.5 s,連續3次,每次間隔5 min,若出現嘶吼、舔足、甩尾及彈腿等任一行為則提示該力度陽性,選擇小于此力度的下一型號纖維絲刺激,直到刺激出現陰性為止,將此時纖維絲的力度值記為PMWT,當使用在0.07 g的纖維絲刺激時仍為陽性,則統一計數為0.07 g。若使用0.4 g纖維絲刺激時為陰性則選擇大于該力度的纖維絲刺激,直到呈現陽性,且將此時的力度值記為PMWT。(2)PTWL的檢測方法。將控制面板溫度設定為(55.0±0.5)℃進行熱板實驗。將各組大鼠置于熱痛閾檢測玻璃透明盒中,待其適應環境后取出大鼠,將玻璃透明盒置于底部為已預熱的冷熱板痛覺測試儀(安徽耀坤生物科技有限公司,型號:ZL-021)上,再將大鼠放入盒中,按動“start”鍵,以大鼠舔足、抬足或躲避反應作為疼痛反應指標,當大鼠出現上述反應后立即按動“stop”鍵以停止測量,記錄大鼠自置于熱板上至其出現疼痛反應的時間,即為PTWL。

1.5.2 脊髓組織的細胞凋亡情況:參考文獻[3]的方法,采用TUNEL染色法檢測細胞凋亡情況。取大鼠L4～6脊髓組織石蠟切片,常規進行脫蠟水化,經蛋白酶K工作液浸泡后使用PBS漂洗。配制TUNEL反應混合液,即將50 μL TdT和450 μL熒光素標記的dUTP液混勻。在切片中滴加100 μL DNase Ⅰ,在37 ℃環境下反應30 min,待玻片干后,滴加50 μL TUNEL反應混合液,加封口膜在濕盒中37 ℃下反應1 h。經PBS漂洗后用抗熒光淬滅封片劑封片,在熒光顯微鏡(OLYMPUS公司,型號:BX53)100倍鏡(激發波長為450～500 nm)下計數5個視野的凋亡細胞數,取平均值。

1.5.3 脊髓組織中相關蛋白的表達量:采用Western blot檢測相關蛋白的表達量。取置于-80 ℃冰箱保存的脊髓組織30 mg,加入RIPA裂解液后行超聲勻漿,提取總蛋白,采用二喹啉甲酸法檢測其濃度。將蛋白煮沸5 min使其變性,取40 μg總蛋白上樣后進行SDS-PAGE以分離蛋白,然后將蛋白轉移至PVDF膜上,使用5%脫脂牛奶常溫封閉膜1 h,分別加入兔抗鼠AMPK α2、p-AMPK α2、MTOR、p-MTOR、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH抗體(稀釋比均為1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜后復溫30 min,加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗大鼠IgG(1 ∶2 000)常溫孵育2 h,經ECL法顯色后,在凝膠成像儀(Bio-Rad公司,型號:12003153)獲取蛋白條帶, 使用Image Lab軟件測量目的蛋白條帶與內參GAPDH蛋白條帶的灰度值,以兩者的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.6 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗,重復測量資料采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠PMWT的比較 數據不滿足球形分布(P<0.001),故進行Greenhouse-Geisser校正,結果顯示,3組大鼠PMWT差異有統計學意義(F組間=207.859,P組間<0.001),PMWT有隨時間延長而變化的趨勢(F時間=168.380,P時間<0.001),分組與時間有交互效應(F交互=6.895,P交互<0.001)。進一步行分組因素和時間因素的單獨效應分析,結果顯示,在注射樹脂毒素后3～15 d各時間點,PHN組和AICAR組大鼠的PMWT低于對照組,但在注射樹脂毒素后9～15 d各時間點,AICAR組大鼠的PMWT高于PHN組(P<0.05);PHN組和AICAR組大鼠在注射樹脂毒素后3～7 d各時間點的PMWT低于注射樹脂毒素前1 d和注射樹脂毒素后1 d的PMWT,但AICAR組大鼠在注射樹脂毒素后9～15 d各時間點的PMWT高于注射樹脂毒素后3～7 d各時間點的PMWT(P<0.05),見表1。

2.2 3組大鼠PTWL的比較 數據不滿足球形分布(P<0.001),故進行Greenhouse-Geisser校正,結果顯示,3組大鼠的PTWL差異有統計學意義(F組間=70.789,P組間<0.001),PTWL有隨時間延長而變化的趨勢(F時間=79.380,P時間<0.001),分組與時間有交互效應(F交互=12.945,P交互<0.001)。進一步行分組因素和時間因素的單獨效應分析,結果顯示,在注射樹脂毒素后3～15 d各時間點,PHN組和AICAR組大鼠的PTWL長于對照組,但在注射樹脂毒素后9～15 d各時間點,AICAR組大鼠的PTWL短于PHN組(P<0.05);PHN組和AICAR組大鼠在注射樹脂毒素后3～7 d各時間點的PTWL長于注射樹脂毒素前1 d和注射樹脂毒素后1 d的PTWL,但AICAR組大鼠在注射樹脂毒素后9～15 d各時間點的PTWL短于注射樹脂毒素后3～7 d各時間點的PTWL(P<0.05),見表2。

表2 在不同時間3組大鼠的PTWL比較(x±s,s)

2.3 3組大鼠脊髓組織凋亡細胞數的比較 與對照組比較,PHN組和AICAR組大鼠的脊髓組織凋亡細胞數增加;與PHN組比較,AICAR組凋亡細胞數減少(P<0.05),見圖1、表3。

表3 3組大鼠脊髓組織凋亡細胞數的比較(x±s,個)

圖1 3組大鼠脊髓組織的細胞凋亡情況(TUNEL染色,×40)

2.4 3組大鼠脊髓組織p-AMPK/AMPK值、p-MTOR/MTOR值及Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表達量的比較 與對照組比較,PHN組和AICAR組大鼠脊髓組織p-AMPK/AMPK值降低,p-MTOR/MTOR值和Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表達量增加;與PHN組比較,AICAR組大鼠脊髓組織p-AMPK/AMPK值和Bcl-2的蛋白表達量增加,p-MTOR/MTOR值和Bax、Caspase-3的蛋白表達量降低(P<0.05),見圖2和表4。

圖2 3組大鼠脊髓組織相關蛋白表達情況的條帶圖

表4 3組大鼠脊髓組織p-AMPK/AMPK值、p-MTOR/MTOR值及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達量的比較(x±s)

3 討 論

脊髓神經元凋亡是神經病理性疼痛的重要致病機制。既往研究表明,PHN小鼠脊髓組織的過度自噬導致γ-氨基丁酸能神經元的凋亡[3];脈沖射頻可通過減少脊髓神經元凋亡,減輕坐骨神經分支損傷模型大鼠的疼痛程度[4]。這提示深入了解脊髓神經元凋亡的分子機制對解釋神經病理性疼痛的發病機制具有重要意義。為此,本研究使用樹脂毒素誘導建立PHN大鼠模型,以探討神經病理性疼痛的發病機制。本研究結果顯示,在腹腔注射樹脂毒素后3 d,大鼠的PMWT降低,PTWL延長,與PHN患者機械疼痛敏化、熱痛缺失的臨床特征一致,說明成功構建PHN大鼠模型。

研究表明,外周神經損傷后,疼痛刺激持續性傳入使脊髓背角神經元的敏感性增加,表現為過度興奮及傷害性神經元的可塑性改變[12]。此外,MTOR信號通路參與神經病理性疼痛中的脊髓背角突觸可塑性調節,是神經源性疼痛時程增長的關鍵因素[13]。哺乳動物雷帕霉素復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,MTORC1)由3種成分組成,分別為MTOR、Raptor和mLST8,與中樞神經系統的多種病理變化相關,其中MTOR是其關鍵核心成分[14]。研究表明,p-MTOR可通過蛋白激酶B等信號通路誘導神經元凋亡[15]。同時,MTOR在急性疼痛大鼠模型脊髓背角淺表層中表達,這與傷害性疼痛信號傳入定位一致[16]。而采用雷帕霉素抑制MTOR的磷酸化后,慢性疼痛超敏反應的啟動、建立和維持均受到抑制[17]。因此,MTOR介導的脊髓背角組織神經元凋亡可能是神經病理性疼痛發生的關鍵機制之一。

降鈣素基因相關肽(calcitonin-gene related peptide,CGRP)是C類神經纖維的主要神經遞質,通過下調中樞神經系統中的AMPK表達而使機體對神經性疼痛的敏感性增加[18]。研究表明,敲除AMPK可使小鼠出現痛覺過敏行為,使用AMPK激活劑后可以顯著緩解神經病理性疼痛中背根神經節感覺神經元的電興奮性[19]。有學者發現,在采用白藜蘆醇激活AMPK后,背根神經節和脊髓背角組織中神經元MTORC1信號傳導受阻,切口損傷引起的機械性超敏反應也降低[20],這表明AMPK和MTOR是治療神經病理性疼痛的潛在新靶點。本研究中,PHN大鼠出現機械疼痛敏化和熱痛缺失,脊髓組織凋亡細胞數增加,且AMPK磷酸化水平降低,MTOR的磷酸化水平增加,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達上調;而采用AICAR激活AMPK后,PHN大鼠的機械疼痛敏化和熱疼痛缺失均得到改善,脊髓組織凋亡細胞數減少,且AMPK磷酸化水平升高、MTOR磷酸化水平降低,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達受到抑制,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達增加。因此,推測AMPK/MTOR信號通路可能參與PHN大鼠脊髓背角組織神經元凋亡的過程,激活脊髓背角組織AMPK的表達或將成為治療神經病理性疼痛的潛在靶點。

綜上所述,刺激AMPK發生磷酸化后,PHN大鼠的機械疼痛敏化和熱疼痛缺失得到改善,脊髓組織MTOR磷酸化水平降低、神經元細胞凋亡受到抑制,AMPK/MTOR信號通路可能參與PHN大鼠脊髓背角組織神經元凋亡的過程。本研究結果為PHN中的脊髓神經元凋亡機制及干預靶點研究提供了新思路。但本研究僅使用了AMPK的激活劑,未分別使用AMPK抑制劑、MTOR激活劑與抑制劑進一步觀察其對PHN大鼠行為學指標的影響,今后將完善實驗設計以深入研究相關機制。