基于DNA序列信息的貞琵甲屬物種界定分析(鞘翅目:擬步甲科:琵甲亞科)

李秀敏,戎際達,劉一右,范嬌嬌,任國棟

(河北大學生命科學學院,河北大學生命科學與綠色發展研究院,河北省動物系統學與應用重點實驗室,河北保定 071002)

青藏高原是全球生物多樣性熱點地區之一,以擁有大量的特有物種而聞名(Mittermeieretal., 2005)。貞琵甲屬AgnaptoriaReitter是青藏高原的特有屬,隸屬于鞘翅目Coleoptera擬步甲科Tenebrionidae琵甲亞科Blaptinae琵甲族Blaptini,主要分布在3 000 m以上的高海拔地區,是琵甲族小琵甲亞族中的第三大屬,模式種為AgnaptoriarubripesReitter,1887。目前該屬已知36 種/亞種,分布于中國西藏、青海、四川和甘肅4省(Reitter, 1887, 1893;Medvedev, 1998, 1999, 2002, 2006, 2008;石愛民等, 2005, 2007; Ren and Liu 2009; Renetal. 2016)。該屬的主要形態及生物學特征如下:體中小型,黑至紅棕色;第1～2節觸角紅色/棕色;前胸背板橫寬;鞘翅中部兩側平行;足細長,脛節自基部向端部強烈變寬,基部通常為紅色或紅褐色,跗節黑色,跗節短于脛節;后翅愈合,不能飛行,主要棲息于石塊或腐殖質下,夜出性活動,遇到驚擾時,能從腹部特殊的腺體內散發出強烈的刺鼻性氣味。

隨著全球氣候變化等環境因子的改變,物種正在以驚人的速度消失,而越來越多的研究表明生物多樣性喪失對生態系統的功能有著巨大影響(Cardinaleetal., 2012)。鑒于高海拔地區的物種分化強烈,以及基于傳統的形態特征進行分類的局限性,加快物種發現和認知尤為重要,特別是生物多樣性熱點地區的物種多樣性。近年來,DNA序列信息也被廣泛應用于無先驗物種信息的物種界定,在越來越多的類群中得到廣泛應用,確立了許多物種的分類地位和新種地位(Yeatesetal., 2011; Carstensetal., 2013; Toussaintetal., 2015; Soldatietal., 2017)。尤其是在形態上相近的物種間利用DNA序列信息來劃定物種邊界,驗證形態物種的有效性,已成為快速識別和描述物種、加速發現和認識種類繁多的昆蟲世界的一種有效手段。分子物種界定方法結合形態證據進行準確的物種界定,以揭示某一類群的系統發育關系,從新的視角理解生物多樣性時空演變格局的形成過程。因此,本研究選取貞琵甲屬15個種的30個樣品,選擇4個基因片段(COI; Cytb; 16S rDNA; 28S rDNA-D2)作為分子標記,構建該屬部分物種的系統發育關系,運用分子證據對以形態特征建立的已知物種分類地位進行驗證,為該屬未知種類的認知以及其物種多樣性分布格局的形成和演變奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究選取貞琵甲屬15個物種的30個樣本作為研究對象,主要來自于近幾年野外采集的酒精浸泡標本及部分館藏干制標本。首先在Nikon SMZ800立體顯微鏡下觀察其形態特征,根據已出版的《中國動物志》擬步甲科(一)及相關分類文獻依據其形態特征進行分類鑒定(任國棟等,2016)。所有樣本的采集信息見表1。

表1 所用貞琵甲屬樣本信息

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

選取中、后足肌肉組織,使用EZNA?昆蟲DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek, USA),參照說明書中的操作步驟提取DNA,獲得的DNA存放于-20℃冰箱中保存用于PCR擴增。本文選取了4對線粒體和核基因進行擴增,引物由通用生物系統(安徽)有限公司合成(Simon, 1994; Folmeretal., 1994; Belshawetal., 1997; Simmonsetal., 2001)。COI基因的引物序列為2183: 5′-CAACA TTTATTTTGATTTTTTGG-3′;3014: 5′-TCCAA TGCACTAATCTGCCATATTA-3′。Cytb基因的引物序列為revcb2: 5′-TGAGGACAAATATCATTTTGA GGW-3′; rebcbj: 5′-TCAGGTCGAGCTCCAATTC ATGT-3′。16S基因的引物序列為13398: 5′-CG CCTGTTTATCAAAAACAT-3′;12887: 5′-CCG GTCTGAACTCAGATCAT-3′。28S基因的引物序列為3665: 5′-AGAGAGAGTTCAAGAGTACGTG-3′; 4068: 5′-TTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3′。PCR采用TaKaRa Ex Taq進行PCR擴增(TaKaRa, 中國大連),反應體系均為25 μL,PCR Mix 12.5 μL,10 μmol/L上下游引物各1 μL,DNA模板1.5～5 μL,ddH2O補足至25 μL。PCR反應條件為:94℃預變性4 min;30個循環包含94℃變性1 min 30 s,50～58℃復性30 s,72℃延伸1 min,最后72℃延伸8 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用凝膠成像系統拍照。確定為目標條帶的PCR產物由通用生物系統(安徽)有限公司完成雙向測序,獲得DNA序列信息。

1.3 序列數據處理

測序得到的DNA序列首先使用DNASTAR SeqMan v7.1.0軟件查看測序峰圖并進行拼接,為了確保序列的準確性,對照雙向測序峰圖,逐一對所有堿基進行人工校對剪切,確保讀取正確,然后將得到的序列在NCBI(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/)中BLAST搜索進行同源性分析,確定所得到的序列是否為目標序列,并保證序列方向一致。同一基因的目標序列按照分析需要通過BioEdit v7.0.9.0(Hall, 1999)軟件導入到一個.fas文件中,然后將.fas文件導入軟件PhyloSuite中,用MAFFT進行序列比對;然后用Concatenate Sequence將4個基因片段串聯起來;用PartitionFinder2(unlingked)進行分區,選擇最適合的分區方案;用ModelFinder對優化的數據進行最優模型選擇用于系統發育分析研究(Lanfearetal, 2017; Kalyaanamoorthyetal, 2017)。

1.4 系統發育樹構建

系統發育樹的構建采用目前公認的最大似然法(ML),選用與貞琵甲屬關系較近的小琵甲屬的9個物種作為外群。ML分析使用了IQ-TREE v1.6.6(Nguyenetal., 2015)在線軟件,4個基因片段的聯合數據集在Auto+R6替代模型下進行運算,bootstrap分析選用Ultrafast,重復抽樣次數設為默認值為1 000,啟用SH-aLRT,設置為默認值1 000,快速自舉值(uBV)大于或等于95%被認為是強有力的支持。

1.5 分子物種界定分析

對于分子物種界定分析,最近研究顯示有些方法可能會低估或高估物種的數量(Dellicouretal., 2018; Luoetal., 2018)。因此,綜合使用多種分子物種界定方法,以更準確地評估物種的分類地位。本研究使用如下3種方法的8種方案分析物種界限:

(1)ASAP(Assemble Species by Automatic Partitioning)在線分析軟件(Puillandreetal., 2012;https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/asapweb. html)。為了避免與缺失數據相關的距離估計偏差,本文僅對COI和Cytb的單基因進行了ASAP物種界定分析。將比對好的.fas文件導入程序,基于K2P模型計算遺傳距離,其余參數使用缺省值,即種內差異先驗值P(prior intraspecific divergence)為0.001～0.1,將最小相對間隙寬度(relative gap width)X值設置為0.5,其余參數為系統默認設置。

(2)GMYC(Generalized Mixed Yule Coalescent)物種界定方法(Ponsetal., 2006;Reidetal., 2012)。先利用BEAST v2.4.7(http://www. beast2.org/)獲得超度量(ultrametric)二叉分支樹,使用jModelTest選擇最佳核苷酸替代模型。首先,運行了1個聯合基因數據集的BEAST分析(去掉所有外群),然后又對COI和Cytb數據集進行了單基因的BEAST分析(設置相同)。利用BEAUti打開FAS格式文件,依次約束內群為單系群、設置核苷酸替代模型、分子鐘、系統樹、MCMC鏈等,并生成xml文件;BEAST下運行xml文件;Tracer v1.6對BEAST運算結果進行分析,Burn-In默認為鏈長10%,全部ESS>200表示數據運行很好;再利用TreeAnnotator v1.8.2生成所需系統樹;轉換的系統發育樹在R語言包“splits”讀取并計算得到物種界定結果,以與其它分子界定方法、形態鑒定結果對照分析。

(3)PTP(Poisson Tree Processes)物種界定方法(Zhangetal., 2013)。本研究使用PTP在線程序運行(https://species.h-its.org/ptp/),共分為3組數據進行PTP分析:去掉所有外群后的聯合基因的系統發育樹、COI基因系統發育樹和Cytb基因系統發育樹。運行時將MCMC代數設置為100 000代,其它參數使用默認值。

2 結果與分析

2.1 系統發育關系

基于貞琵甲15個物種的30個樣本的4個基因片段:COI,Cytb,16S rDNA和28S rDNA的DNA序列數據集在IQ-TREE軟件下構建了ML系統發育樹(圖1)。總的來說,貞琵甲屬15個物種中的13個物種的種間關系得到了較高的支持(80%的節點uBV ≥ 95%),與外群小琵甲屬部分物種構成了2個分支,內群分支的單系性也得到了很好的支持(uBV=100)。

圖1 基于30-taxa的3個線粒體基因和1個核基因序列(COI, Cytb, 16S rDNA, 28S rDNA),2 327 bp的串聯數據集獲得的貞琵甲屬Agnaptoria的系統發育樹和物種界定結果Fig.1 Phylogenetic relationships within the genusAgnaptoria and species boundaries. Phylogenetic tree based on mitochondrial and nuclear DNA sequences. A similar topology was recovered under a maximum likelihood approach.注:樹的每個節點的支持度由大似然法推斷得到的超快bootstrap值(uBV)表示。彩色柱形條帶表示形態物種數(黑色),以及8種物種劃分方案的分子物種界定分析結果(紅色、橙色、紫色、藍紫色、粉色、綠色、橘黃色和藍色);對于單基因COI/Cytb的界定結果中,灰色柱形條帶表示缺失的序列信息;21個MOTUs為ASAP、GMYC和PTP分子物種界定分析得出的結果。Note: Support for each node was represented by ultrafast bootstrap values (uBV) obtained for the maximum likelihood tree. Vertical coloured bars delineate extant morphospecies (black colour), and the results of the eight separated molecular analyses delimiting species (red, orange, purple, bluish-purple, pink, green, yellow, blue). For the analyses using COI or Cytb genes only, we used grey colour to delineate specimens for which sequencing failed. Numbers on the right represented codes for 21 putative MOTUs delineated using ASAP, GMYC and PTP analyses.

2.2 物種界定結果

利用3種分子物種界定分析方法(ASAP、GMYC和PTP)對單基因片段(COI和Cytb)和聯合基因基因(COI,Cytb,16S rDNA和28S rDNA)片段的數據集對30個貞琵甲樣品進行了物種界定,其中GMYC和PTP兩種物種界定方法既使用了聯合基因數據集,也使用了單基因數據集,而ASAP方法只使用了單基因數據集。3種分子物種界定結果(共8種方案)推斷出的MOTUs的數基本一致,PTP方法的3種方案界定出的MOTU數以及與其它兩種方法在部分MOTUs上顯示出不同的結果,且界定的物種數略多。通過形態學鑒定,30個樣本為13個已知物種和2個待定種,其中13個物種的形態鑒定結果與分子界定結果完全吻合(圖1)。

ASAP方法對單基因COI和Cytb的界定結果一致,為確定最終物種的數量,本研究傾向于先驗值在0.01～0.02之間,30個樣品界定為17個物種;GMYC方法使用單基因與聯合基因界定的結果基本一致,為17～18個物種(COI基因界定出17個。Cytb基因界定出17個,一個物種基因缺失;聯合基因界定出18個),不同的是COI基因將MOTU19與MOTU20界定為1個物種,而Cytb基因和聯合基因數據集界定為2個物種。

PTP方法的3種方案界定出的MOTU數以及與上述兩種方法的在部分MOTU上顯示出不同的結果,且界定的物種數略多于上述兩種方法(COI基因界定出19個物種;Cytb基因界定出19個物種,一個物種基因缺失;聯合基因界定出18個物種)。Cytb基因將MOTU1、MOTU2和MOTU3界定為3個物種,而Cytb基因和聯合基因數據集將其界定為1個物種;Cytb基因將MOTU17、MOTU18、MOTU19和MOTU20界定為一個物種,COI基因與其它7種方案結果不同,將MOTU17和MOTU18界定為2個物種,而將MOTU19和MOTU20界定為1個物種。

3 結論與討論

不同的分子物種界定方法界定物種的結果并不完全一致,但是無論使用單基因還是聯合基因,分子種界定結果與形態分類結果是大致吻合的,對已知物種分類地位的驗證以及提高物種鑒定效率有很大幫助。29個樣品的COⅠ基因序列通過ASAP物種界定方法得到了18個MOTUs,通過GMYC方法得到了17個MOTUs,通過PTP方法得到了17個MOTUs;28個樣品的Cytb基因序列通過ASAP和GMYC分子物種界定方法均得到了18個 MOTUs,通過PTP方法得到了17個MOTUs。除PTP方法中的Cytb基因外,其它7種方案都將A.markana的5個樣品界定為一個MOTU;這一結果與已有研究認為的GMYC和PTP方法會高估MOTUs的數量較為一致(Lecocqetal., 2015; Dellicour &Flot, 2018; Luoetal., 2018)。除PTP方法中的Cytb基因的界定結果與形態鑒定結果一致外,其它7種方案均將A.nigriceps的4個樣品界定為2～3個MOTUs。通過檢視不同采樣地點的黑頭貞琵甲A.nigriceps,確認其形態特征并無差異。綜合考慮,本研究將來自不同采樣地點的樣品暫時作為一個物種處理。總的來說,ASAP、GMYC和PTP方法的8種方案界定結果與形態鑒定結果均呈現較高的吻合度,證明了這3種方法綜合運用對貞琵甲屬進行分子物種界定的有效性。

青藏高原是印度板塊與歐亞板塊兩大陸地板塊的劇烈碰撞形成的地球上海拔最高、最年輕的高原。隨著青藏高原隆升過程中的地質變化,受到山脈、河流的阻隔,形成“島嶼”化的地理格局,某一種群被限制于特定高度分布并在特定的小尺度生境內繁衍,并以小種群形式存在,從而限制了種群間的基因交流,為遺傳物質的分化——新物種的快速形成創造了機會(Lietal., 2021)。青藏高原這種極端環境下物種形成時間較短,種間識別特征差異不顯著,僅依據傳統的形態特征很難將其區分開,分子界定結果通常也會出現多于形態物種的現象(Lietal., 2021)。物種的形成是一個十分復雜的過程,其形成模式一直受到廣泛關注(Futuyma and Mayer, 1980; Taylor and Friesen, 2017)。對分化期較短的物種,個體或種群間因生殖隔離而產生的遺傳距離上的差異,因其極小的形態差異,從而可能導致基于進化樹和遺傳距離的分子物種界定結果與傳統的形態鑒定不完全吻合。青藏高原特異性環境下產生的一些“疑難種”在很多類群中都普遍存在,對于這些物種的界定邊界在哪里,還需繼續積累更多不同采樣地點樣本的數量,檢視大量標本找出其形態變化規律,并通過增加基因數量或者通過基因組數據來進行其遺傳距離的分析,使研究結果盡可能符合客觀事實,反應物種真實的分類地位。

運用DNA序列與傳統的形態學方法相結合鑒定物種,是準確確定物種分類地位的科學方法,脫離傳統分類學而單純開展分子物種經鑒定得出的結果并不完全可靠,因此,傳統的形態分類學方法與分子鑒定必須結合,才能準確確定物種的分類地位,提高物種鑒定的效率和準確性。本文初步構建了貞琵甲屬部分物種的DNA序列信息數據庫,為貞琵甲的快速、準確鑒定提出了可行方法,對貞琵甲的物種演化和地理分布格局研究也具有重要意義。