ROR1 CAR-T療法在腫瘤免疫治療中的研究進展

米澤威 楊會江 徐 婕

臨床上治療腫瘤常以綜合治療為原則,常用的腫瘤治療方法包括手術、化療、放療等。然而,常規的治療方法并未有效提高腫瘤患者的生存期,腫瘤的侵襲和轉移是造成患者死亡的主要原因,因此,尋找腫瘤的新型治療方法是亟待解決的重要科學問題。近年來,免疫療法已成為多種惡性腫瘤的潛在治療方法,這為腫瘤的治療打開了新的思路。其中,過繼性細胞療法是腫瘤免疫療法中耀眼的新星,在推進免疫療法的進展中做出了不可磨滅的貢獻,尤其是嵌合抗元受體T細胞(chimeric antigen receptor engineered T cells,CAR-T)療法。

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(recombinant receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1,ROR1)是一個被公認的非常有潛力的腫瘤治療靶點。基于此,本文將對ROR1 CAR-T療法在腫瘤免疫治療中的研究進展做一綜述,以期更全面地評估ROR1 CAR-T療法的實際療效,為ROR1 CAR-T的改善設計提供參考依據,進一步推動ROR1 CAR-T療法的臨床應用。

一、ROR1靶點的引入

過繼性細胞療法是指將人體內有抗腫瘤活性的細胞分離出來,在體外對其進行誘導、修飾、培養,再回輸給患者,達到抗腫瘤目的的免疫療法。其中CAR-T療法在血液腫瘤治療中表現驚艷,成為領域內唯一被FDA批準上市的細胞產品[1]。隨后,越來越多的過繼性細胞療法向實體瘤發起沖擊。近年來,已有多個CAR-T治療項目成功應用于膠質母細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肉瘤、肺癌、胃癌等實體腫瘤的治療[2～6]。大量文獻報道,ROR1在多種腫瘤組織中特異性高水平表達,在正常細胞中幾乎不表達;同時,ROR1在促進腫瘤生長和轉移、誘導腫瘤細胞耐藥、抑制細胞凋亡等方面都發揮著重要作用,已逐漸成為腫瘤治療藥物靶標[7,8]。近年來,美國食品藥品監督管理局已批準兩款新藥用于治療ROR1+的惡性腫瘤,分別是生物制藥公司Precigen的自體CAR-T療法結合PD-1阻斷劑而成的PRGN-3007以及JUNO Therapeutics研發的一款自體ROR1 CAR-T療法JCAR024,目前后者已處于臨床一期研究階段。

ROR1是受體酪氨酸激酶樣孤兒受體家族成員之一,屬于Ⅰ型受體酪氨酸激酶家族。ROR1含有兩種亞型,分別是完整的細胞膜受體型和截短型變異體,后者又主要分為無胞外結構的膜結合型ROR1和只含胞外結構的可溶型ROR1。由于可溶型ROR1在血清中的表達量很低或檢測不到,且與疾病進展無關,因此筆者默認研究的是完整結構的膜結合型ROR1。ROR1編碼基因共2814bp,位于染色體1p31.3,ROR1膜蛋白由937個氨基酸組成,相對分子質量約為105 kDa。人源ROR1由一個胞外的免疫球蛋白樣結構域(Ig)、兩個富含半胱氨酸的結構域(FZD)、近膜kringle結構域、單次跨膜結構以及一個胞內酪氨酸激酶結構域(TKD)、兩個絲/蘇氨酸富集結構域(S/TRD)和一個脯氨酸富集結構域(PRD)組成[9]。ROR1在生物種間高度保守,人與鼠的ROR1氨基酸序列同源性可達97%。

多項研究發現,ROR1在脂肪組織、胰腺、肺、少量B前體細胞中低表達,在其他正常細胞中幾乎不表達,而在多種腫瘤細胞中高度表達,如慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病、髓細胞白血病、邊緣區淋巴瘤等血液腫瘤以及肺癌、結直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、膠質母細胞瘤、三陰性乳腺癌等實體腫瘤[10]。雖然腫瘤治療中理想的治療靶點是僅在腫瘤細胞表面特異性表達的腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen,TSA),但目前發現的幾乎所有靶點均是腫瘤相關抗原(tumor associated antigen,TAA),ROR1便是屬于TAA類。即便如此,越來越多的研究顯示,ROR1 CAR-T療法在多種腫瘤治療中都取得了理想療效。ROR1 CAR-T療法首先需要收集患者的外周血并提取T淋巴細胞,將T淋巴細胞在體外進行刺激擴增并通過病毒載體轉入特定的CAR基因,構建成靶向特異性的CAR-T(如靶向ROR1+的ROR1 CAR-T),再將質檢合格的CAR-T在體外擴增至合適數量后回輸給患者,在患者體內行使其被設定的腫瘤殺傷作用[11]。現階段,靶向ROR1的免疫療法已成為腫瘤治療的新發展趨勢。

二、ROR1 CAR-T療法在多種腫瘤中的研究進展

鑒于ROR1在多種腫瘤組織中特異性高水平表達,是癌癥的潛在治療靶點,ROR1 CAR-T對ROR1+腫瘤細胞具有顯著的殺傷作用和較高的安全性,現對ROR1 CAR-T療法在多種腫瘤中的研究進展進行詳細闡述[12]。

1.白血病:ROR1 CAR-T療法自開發起最先便是用于治療血液腫瘤,如白血病等,并已取得了較為理想且成熟的臨床前實驗結果[13]。早期,Hudecek等[14]在臨床試驗中將特異性ROR1 CAR-T靶向ROR1+B型急性淋巴細胞白血病,產生了前所未有的抑癌效果。在此基礎上,利用靶向ROR1胞外Ig-like/FZD的mAb 2A2制備2A2 CAR-T,并截短其間隔域,獲得對ROR1+腫瘤的識別。進一步研究發現,利用靶向ROR1 Ig-like和FZD上的一個獨立表位的兔抗人ROR1 mAb R12制備R12 CAR-T,與2A2 CAR-T比較時,展現出了更高的親和性[15];而且針對體內ROR1+B細胞淋巴瘤和體外多種上皮性腫瘤都表現出了很好的反應活性[16];隨后,通過改造與修飾R12 CAR-T的空間間隔,明顯地提升其對ROR1+腫瘤的識別及擴大T淋巴細胞的生物學效應[17]。此外,Thomas Kipps等[18]在發表于PNAS的研究中指出,癌基因ROR1僅在慢性淋巴細胞性白血病的B淋巴細胞中表達,在正常組織中不表達,該基因與其他原癌基因共同作用會加速小鼠的慢性淋巴細胞性白血病發病進程,并在動物模型中成功證實ROR1 CAR-T療法對白血病的良好療效。現階段由慢性淋巴細胞白血病的全球研究基金會聯盟牽頭開展的ROR1 CAR-T療法應用于白血病的治療已進入臨床一期,社會多方都在熱切關注這項臨床實驗的實際療效。

2.三陰性乳腺癌:三陰性乳腺癌預后差、耐藥性強、復發率高,而治療手段又非常有限。近年來,有研究者研發出新型CAR-T療法針對三陰性乳腺癌表現出前所未有的效果,有望打破三陰性乳腺癌的治療格局。陳玥等[12]利用構建的ROR1 CAR-T,在體外實驗中發現針對陽性靶細胞MDA-MB-231,在2∶1、4∶1、8∶1的效靶比條件下,CAR-T組中釋放的γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)均高于對照組。但CAR-T與陰性靶細胞共培養后,IFN-γ幾乎沒有釋放,即使在高效靶比(8∶1)時釋放量也很少,酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)也產生較少,證明ROR1 CAR-T對于ROR1陽性的三陰性乳腺癌細胞具有特異性的殺傷作用,并且脫靶性的危險較小。

西雅圖華盛頓大學Jennifer Specht博士團隊則利用ROR1 CAR-T細胞進行了人體試驗,該研究納入了7例ROR1表達超過20%的三陰性乳腺癌患者。在接受5個劑量水平的ROR1 CAR-T療法過程中,并未出現明顯的劑量限制性毒性。只有1例患者出現了三級細胞因子釋放綜合征,經地塞米松和托珠單抗治療后反應迅速,沒有出現嚴重的神經毒性或細胞因子釋放綜合征或腫瘤溶解綜合征或任何與ROR1表達相關的其他毒性。該研究的治療結果令人欣喜,經ROR1 CAR-T療法后,患者生存期持續延長,2例患者病況穩定,分別維持了15周和19周,其中1例患者在病況穩定一段時間后又接受了第2次ROR1 CAR-T回輸,腫瘤明顯縮小。目前還沒有任何其他后續治療方案的療效超過ROR1 CAR-T療法。

3.肉瘤:患有轉移性、復發性和(或)難治性肉瘤的患者通常預后較差,迫切需要新的有針對性的治療方法。研究顯示,ROR1在肉瘤細胞系(11/15)中有很高的表達率,這些肉瘤細胞系包括尤文肉瘤、骨肉瘤、肺泡或胚胎性橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤。Huang等[19]利用Sleeping Beauty系統將來源于8名志愿者的免疫細胞構建ROR1 CAR-T,發現其對肉瘤細胞具有細胞毒性,并且以抗原特異性方式產生高水平的IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素-13(interleukin-13,IL - 13),而來源于3個肉瘤患者的ROR1 CAR T響應肉瘤的刺激并釋放顯著量的IFN-γ。研究發現,ROR1 CAR-T可顯著降低小鼠骨肉瘤模型中的腫瘤生長率,延長小鼠壽命,證實ROR1可作為利用Sleeping Beauty構建的CAR-T有效靶點,并且這種CAR-T有可能會在高危肉瘤患者的治療中起到重要作用。

Berger等[20]利用獼猴構建的骨肉瘤靈長類動物模型來評估ROR1 CAR-T的治療效果,結果顯示ROR1 CAR-T具有較強的抗腫瘤作用,并且對低表達ROR1的B前體細胞、脂肪細胞、胰腺和肺無毒性作用,具有良好的安全性,是骨肉瘤理想的免疫治療方法。此外,由于目前大多數CAR-T靶點都屬于TAA類,為避免“on-target off-tumor”毒性,Srivastava等[21]設計了一種邏輯門控ROR1 CAR-T。在改善后的設計中,CAR-T僅消除同時表達抗原A和B的腫瘤。針對抗原A合成的Notch受體可誘導針對特異性抗原B的CAR表達,通過整合多種信號來調節T淋巴細胞功能,從而可以更精確地區分腫瘤組織和正常組織。這種新型設計的ROR1 CAR-T已被證明能夠很好地治療尤文肉瘤,此項目目前正在進行臨床招募(NCT02706392),表現出巨大的發展潛力。

4.卵巢癌:卵巢癌作為一種早期較難檢測、晚期致死率高、復發性高的腫瘤,傳統的治療手段尚不能滿足目前的醫療需求,在婦科惡性腫瘤中,卵巢癌被稱為“沉默殺手”。近年來,CAR-T療法的問世,讓人們看到了“治愈”的希望。在利用傳統CAR-T療法治療各種惡性腫瘤的同時,科學家也在致力于通過前期基因工程技術,多維度提高CAR-T療法的療效。來自Fred Hutchinson癌癥研究中心的科學家設計了一種生物相容性良好的多孔網狀鎳鈦薄膜,可高效裝載CAR-T,并能在植入部位觸發它們快速擴增。研究者將ROR1 CAR-T置于膜的兩側,使其被吸收到材料中,在應用于卵巢癌小鼠臨床前模型時,驚喜地發現此薄膜可準確定位至腫瘤病灶上,并促進嵌入的抗癌淋巴細胞快速擴增,使得腫瘤組織中CAR-T密度比傳統的靜脈注射T淋巴細胞高232倍,能有效消除小鼠腫瘤、延長生存期,并且整個實驗過程中,此金屬薄膜安全可靠,周圍的組織或器官也沒有出現壞死[22]。新型改善技術的出現,無疑讓CAR-T療法如虎添翼。

5.肺癌:肺癌是發生率和病死率增長最快、對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一,將CAR-T療法應用于治療肺癌是諸多研究者的奮斗目標。Wallstabe等[23]在研究中利用ROR1 CAR-T治療肺癌A549細胞系和肺癌三維模型,結果顯示ROR1 CAR-T具有較強的抗腫瘤活性。而Srivastava等[24]通過在KP鼠肺癌模型中引入ROR1基因,建立KP-ROR1鼠(高表達ROR1),系統研究CAR-T療法在肺癌治療中的作用,結果發現ROR1 CAR-T的浸潤性較差并且存在功能性失調。于是他們進行聯合療法的嘗試,結果發現,在注射奧沙利鉑和ROR1 CAR-T 1天后,再注射抗PD-L1抗體,可顯著提高ROR1 CAR-T在病灶處的富集,顯著抑制腫瘤生長。進一步將聯合療法用于臨床試驗,結果顯示,同時注射奧沙利鉑和ROR1 CAR-T的肺癌患者,T淋巴細胞水平顯著上升、巨噬細胞水平顯著下降,此趨勢在治療203天后仍舊顯著,表明奧沙利鉑的使用在臨床上可以有效提高T淋巴細胞在病灶處的富集。目前三聯療法的臨床應用仍在進行中,但現有結果已足以說明,聯合療法可顯著增強ROR1 CAR-T療法的抗肺癌效果。

除上述已開展的利用ROR1 CAR-T療法治療白血病、三陰性乳腺癌、肉瘤、卵巢癌、肺癌之外,由于ROR1在肝癌、結直腸癌、胰腺癌、膠質母細胞瘤等實體瘤中同樣特異性高表達,因此將ROR1 CAR-T療法用于治療此類癌癥將是今后持續探討的研究方向。

三、展 望

CAR-T療法是有別于包括抗體藥物、抗體偶聯藥物(antibody-drug conjugate,ADC)、重組蛋白等在內的傳統生物藥物的新型治療手段,具有“活的藥物”的特性,其治療深度和持續性是上述傳統生物藥物不具備的。ADC代表性藥物的緩解率為60%,未來可能需要聯合其他療法進行治療;而CAR-T代表性藥物bb2121和LCAR-B38M的緩解率分別為94%和100%。抗體介導的抗腫瘤藥物只能殺死細胞表面抗原高表達的腫瘤細胞,而CAR-T可以有效殺死細胞表面抗原表達量較低的腫瘤細胞,反應深度更深。此外,CAR-T在治療過程中會在患者體內大量擴增,相對傳統的生物藥物,具有起效快速、緩解率高和緩解時間長等優勢。

與傳統的利用基因工程技術構建特異性CAR靶向ROR1靶點不同的是,現階段針對ROR1 CAR-T技術的研究已經開始關注如何通過改善CAR前期設計、多方法聯合應用等提高ROR1 CAR-T的實際療效。比如邏輯門控ROR1 CAR-T技術,它通過雙特異性靶標,精確CAR-T的靶向性,降低對正常低表達ROR1細胞的損傷性;又比如Fred Hutchinson癌癥研究中心研發的多孔網狀鎳鈦薄膜,利用該膜高效裝載CAR-T,使得腫瘤組織中CAR-T密度比傳統的靜脈注射法提高了232倍;再比如Stanley R. Riddell等嘗試的聯合療法,通過將ROR1 CAR-T與成熟的臨床藥物、經典的腫瘤治療方法聯合,評估不同方法的實際療效,尋找ROR1 CAR-T療法的更高效使用方法。Cho等[25]設計的通用型CAR-T,通過在ScFv與穿膜和胞內結構域間插入一個可調控的亮氨酸,使得抗原結合區可以任意地更換成各種ScFv,提高了CAR-T療法的靈活性。目前關于ROR1 CAR-T療法在腫瘤免疫治療中的研究已進入新的階段,不僅在治療的腫瘤類型上更加豐富,在CAR-T技術的改善設計上也日漸完善,從而多方面推動了ROR1 CAR-T療法的臨床應用。

綜上所述,ROR1靶點是CAR-T療法中新的嘗試,致力于提供更強效、可耐受、易獲得的免疫療法,解決疾病標準療法無法應對的復發及其他難治問題,為患者的臨床治療帶來新的希望。