長期施有機肥對設施番茄土壤稀有和豐富細菌亞群落的影響

劉蕾，史建碩，張國印，郜靜，李玭，任燕利，王麗英

長期施有機肥對設施番茄土壤稀有和豐富細菌亞群落的影響

劉蕾，史建碩，張國印，郜靜，李玭，任燕利，王麗英

河北省農林科學院農業資源環境研究所/河北省肥料技術創新中心，石家莊 050051

【目的】將稀有和豐富細菌亞群落從整體群落中加以區分并探索兩者分別對長期施肥的響應特征，為解析農業活動對微生物多樣性與土壤功能穩定性之間的關系提供新視角。【方法】基于設施番茄長期定位試驗，采集4個不同處理土壤樣品：不施肥（M0）、低量有機肥5.68 t·hm-2（M1）、中量有機肥8.52 t·hm-2（M2）和高量有機肥11.36 t·hm-2（M3），利用Illumina MiSeq高通量測序技術，分析稀有和豐富細菌亞群落多樣性、群落組成、共現網絡和潛在功能差異，闡明兩者對長期施肥的響應規律，并探討驅動稀有和豐富細菌亞群落多樣性和施肥響應差異的關鍵環境因素。【結果】稀有細菌亞群落α和β多樣性均顯著高于豐富細菌亞群落，且物種組成和潛在功能也與豐富細菌差異明顯。功能預測結果顯示豐富細菌負責設施農田主要生態系統功能，如養分和能量代謝，而稀有細菌更多體現在輔助功能上（例如輔酶代謝），為微生物群落功能冗余做出貢獻。不同細菌亞群落多樣性和組成對長期施肥響應差異較大，其中，與不施肥相比，長期施用有機肥和化肥使稀有細菌亞群落豐富度顯著提高19.8%—53.8%、多樣性顯著提高5.8%—8.0%，總相對豐度顯著提高1.1—1.2倍，改變稀有細菌亞群落組成和結構，并且隨著有機肥施用量增加，稀有細菌豐富度顯著提升，亞群落組成和結構也發生顯著變化；與之相比，長期施肥并未顯著改變豐富細菌亞群落多樣性，僅群落組成受到影響。同時，細菌共現性網絡復雜度隨有機肥施用顯著增加，且稀有細菌更敏感。非度量多維度分析（NMDS）和Mantel檢驗結果均顯示，影響稀有和豐富細菌亞群落的關鍵環境因子不同，其中，土壤有機質、全量氮磷有效磷、速效鉀、pH、大中團聚體等多種與確定性過程相關的土壤因子顯著影響豐富細菌亞群落，結構方程模型（SEM）進一步顯示土壤有機質和全磷直接驅動豐富細菌多樣性變化；而稀有細菌亞群落受環境過濾的影響程度明顯下降，且群落分散性更強，暗示兩種亞群落構建機制可能存在差異。【結論】與豐富細菌和整體群落相比，稀有細菌亞群落呈現更高的多樣性和獨特的群落組成，提高微生物群落功能冗余；長期施肥主要通過影響稀有細菌（即提高多樣性、改變群落組成、增加網絡復雜度）而非豐富細菌，從而改變細菌整體群落，并且介導稀有和豐富細菌亞群落構建的環境因素也不相同。

稀有細菌；豐富細菌；有機肥；設施番茄；多樣性；群落構建；生態系統功能

0 引言

【研究意義】土壤微生物對維持土壤生態系統功能和服務至關重要[1]，其群落具有典型的物種豐度分布偏斜特征，表現為少數相對高豐度的優勢（dominant）物種和大量相對低豐度的稀有物種共存，分別被稱為“豐富生物圈（abundant biosphere）”和“稀有生物圈（rare biosphere）”[2]，而后者的群落特征及對環境變化的響應機制基本處于認知盲區[3]。隨著高通量測序技術快速發展，“稀有生物圈”構成的微生物“隱藏”多樣性及“生態保險”功能才逐漸引發關注[2]。設施農業對解決我國耕地資源短缺、推進農業結構調整和實現鄉村振興具有重要意義，然而高集約化生產模式，特別是過量施肥極易引起土壤退化等一系列生態環境問題[4]，而相較于傳統理化指標，土壤微生物對環境變化更敏感，因此，通過土壤微生物性狀的變化評估土壤受損程度和質量變化對長期施肥的響應已成為探索設施土壤質量保持和功能恢復的熱點[5-6]。然而，現階段有機肥和化肥對土壤微生物的影響結果多建立在豐富類群基礎上，對稀有微生物群落分布和響應特征仍知之甚少。因此，將稀有和豐富亞群落從整體群落中加以區分，分別研究兩者群落特征、潛在功能和對長期施肥的響應差異，并探討驅動其多樣性和施肥響應差異的關鍵環境因素，可以為解析農業活動對微生物多樣性與土壤功能穩定性之間的關系提供新視角，并為人口壓力帶來的農業強度不斷增加背景下，制定以保護農田土壤微生物多樣性和減少集約施肥對陸地生態系統影響的施肥策略提供科學依據。【前人研究進展】理解稀有微生物多樣性、群落組成及其背后的群落構建機制和生態系統服務功能，探索“稀有生物圈”對環境變化（或擾動）的響應規律，是目前微生物生態學的前沿[7]。基于現有少量的水體生態系統[3,8-10]和有限的草地[11]、冰川[12]、茶果園[7]、玉米[13]和石油污染[14]等土壤中的研究證實，與豐富微生物相比，稀有微生物呈現獨有的群落特征和環境變化響應機制。目前普遍認為稀有微生物系統發育多樣性和功能多樣性顯著高于豐富微生物，作為“種子庫（seedbank）”和“功能池（pool）”在增強生態系統穩定性和保持土壤健康方面具有重要作用和意義[15-17]。但驅動稀有和豐富微生物群落分布的因素及兩者對環境擾動的響應特征仍存在爭議，例如有研究認為介導兩者群落構建的因素不同[13-14,18]，因此面對環境擾動，兩者呈現差異性響應。但也有研究顯示兩者受相同因素驅動[19]，只是影響強度不同引起了兩者對擾動響應的不均衡（unequally）[20]。當環境變化時，一般認為稀有微生物對擾動敏感性更強，較豐富微生物更為脆弱[19,21]，但也有結果相反[13]。然而，對于陸地生態系統中人為干擾最強烈、生態環境更脆弱的半開放特殊農業生境，設施土壤“稀有生物圈”相關信息仍未見任何報道。施肥作為一種重要的農業措施，會加速土壤退化進程[22]，但近年來研究表明，與化肥相比，合理施用有機肥可以通過提高土壤微生物多樣性和多功能性，減少集約施肥的負面效應，并且相對于豐富微生物，稀有微生物是土壤多功能性的主要驅動力[23]。但總體上，我們對農田生態系統中有機肥和化肥施用對土壤微生物影響的大量研究結果均基于優勢物種，而對于長期施肥如何影響稀有微生物群落構建及功能發揮卻所知有限，鑒于稀有微生物可能在土壤功能和生態系統服務中發揮著超比例的作用，這種認知局限性極大地降低了我們對生態系統響應預測的準確性。【本研究切入點】雖然現階段對稀有微生物群落的關注與日俱增，但大部分研究仍以優勢物種為基礎，特別是在我國設施高集約化生產下，與豐富微生物相比，稀有微生物是否呈現不同的多樣性模式和施肥響應規律尚不明確。【擬解決的關鍵問題】本研究基于設施番茄長期定位試驗，采集不同有機肥施用量下的土壤樣品，利用Illumina MiSeq高通量測序技術分析稀有和豐富細菌亞群落多樣性、群落組成、共現網絡和潛在功能差異，闡明兩者對長期施肥的響應規律，并探討驅動稀有和豐富細菌亞群落特征和施肥響應差異的關鍵環境因素，為保護農田土壤微生物多樣性和科學施肥提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗位于河北省農林科學院大河試驗園區（38°08′24″，114°23′38″），地處石家莊市鹿泉區大河鎮大河村，地貌為太行山山前平原，土壤為黏壤質石灰性褐土，年均溫13.3 ℃，降水量550 mm，屬于溫帶半濕潤大陸性季風氣候。試驗開始于2013年，種植冬春茬番茄（3—7月），一年一茬。試驗開始前土壤基礎理化性質：容重1.44 g·cm-3、pH 8.20、有機質15.94 g·kg-1、全氮0.85 g·kg-1、硝態氮14.77 mg·kg-1、有效磷12.94 mg·kg-1、速效鉀91.25 mg·kg-1。

試驗設置4個處理：（1）不施肥（M0）；（2）低量有機肥5.68 t·hm-2（M1）；（3）中量有機肥8.52 t·hm-2（M2）；（4）高量有機肥11.36 t·hm-2（M3）。隨機區組，每個處理3次重復（小區），小區面積12 m2。為防止長期大量施用有機肥引起磷素累積和淋失，有機肥采用“以磷定氮”施肥原則，依據番茄目標產量（130 t·hm-2）對應磷素帶走量的1.0倍（88 kg P2O5·hm-2）、1.5倍和2.0倍分別確定低（M1）、中（M2）、高（M3）量有機肥施用量，3個處理化肥施用量相同。番茄于每年3月施用商品有機肥和復合肥作為底肥，每穗果坐果后追水溶肥一次，共6次，具體養分投入量見表1。

表1 不同施肥處理下養分投入量

1.2 樣品采集與測定方法

1.2.1 土壤樣品采集 于2021年7月番茄拉秧時在每個小區從東至西隨機用土鉆采集5個表層（0—20 cm）土壤并混合為一個樣品，共獲得12個土壤樣品（4個處理，3次重復）。采集的土壤樣品放入冰盒帶回實驗室，一部分土壤盡量保持原狀風干用于土壤團聚體和機械組成測定，剩余土壤過2 mm篩后分成兩份，一份保存于-20 ℃，用于微生物測定，一份保存于4 ℃，用于土壤化學性質測定。

1.2.2 土壤理化性質測定 土壤團聚體分組采用濕篩法。取100 g風干土壤樣品置于由2.000、0.250、0.053 mm孔徑組成的套篩最上層，加入蒸餾水淹沒浸泡10 min，以振幅3 cm、頻率30次/min持續振蕩5 min，結束后將各孔徑篩子上的土壤顆粒分別洗入鋁盒中，60 ℃烘干稱重，其中，> 2 mm、0.25—2 mm、0.053—0.25 mm、＜0.053 mm分別對應大團聚體、中團聚體、微團聚體和礦質顆粒組分[24]。土壤機械組成采用比重計法（GB7845—87）測定。土壤化學性質測定參照《土壤農化分析》[25]，pH用1 mol·L-1KCl浸提（土水比1﹕2.5）電位法測定，有機質用油浴加熱重鉻酸鉀氧化-容量法，全氮采用凱氏法，全磷采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法，全鉀用堿熔-火焰光度法，硝態氮和銨態氮用0.01 mol·L-1CaCl2溶液浸提（土水比1﹕10）后采用流動分析儀測定，Olsen-P用0.5 mol·L-1NaHCO3（pH=8.5）溶液浸提（土水比20﹕1）鉬銻抗比色法，速效鉀采用1 mol·L-1NH4OAc（pH=7.0）浸提（土水比1﹕10）火焰光度法，水溶性鹽采用電導法測定。

1.2.3 土壤高通量測序和序列處理 采用E.Z.N.A.? soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，美國）試劑盒提取土壤DNA，用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度。使用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGG CAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′）對細菌16S rDNA V3V4基因進行擴增，采用Illumina Miseq PE300平臺進行測序（美吉, 上海）。測序獲得的原始序列經過QIIME平臺篩選和序列優化后，依據97%的相似度聚類成操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）（UPARSE 7.1），選取每個OTU 中豐度最高的序列作為代表序列，以RDP classifier貝葉斯算法對比SILVA數據庫進行分類學信息注釋。去除單序列（singletons）的OTU（只包含一條序列的OTU）[9]。然后基于序列數24 692進行抽平，對所有樣本進行標準化，以抽平后的OTU豐度表進行后續分析[9]。

1.3 數據處理

基于OTU相對豐度分別在局域（local）和區域（regional）水平將其分為稀有和豐富細菌，劃分閾值采用先前廣泛發表的分類標準[3,8,10]：局域水平下（即一個樣品中），相對豐度＞1%的OTU被定義為豐富細菌，相對豐度＜0.01%的OTU被定義為稀有細菌；區域水平下（即在所有樣品中），平均相對豐度＞0.1%的OTU被定義為豐富細菌，平均相對豐度＜0.001%的OTU被定義為稀有細菌。

采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較不同施肥處理對土壤理化性質、細菌α多樣性及相對豐度的影響，并用LSD檢驗進行多重比較，用Kruskal-Wallis檢驗比較整體、豐富和稀有細菌α和β多樣性差異顯著性，均在SPSS 18.0中進行。細菌α多樣性采用OTU豐富度和Shannon多樣性表征，用R軟件vegan程序包“diversity”函數計算。采用“metaMDS”函數計算樣本間Bray-Curtis相異性用以表征細菌β多樣性[14]，并通過基于Bray-Curtis距離算法的非度量多維度分析（NMDS）展示細菌群落分布特征[9]，用“envfit”分析環境變量與細菌群落變化之間的關系，僅保留影響顯著的因子（＜0.05），多元分析之前群落數據進行平方根轉化，環境變量進行lg(+1)轉化。采用“anosim”函數進行置換多元方差分析（PERMANOVA）進一步統計不同施肥處理下細菌群落差異顯著性，置換次數999。Mantel檢驗用于分析環境變量對細菌群落的影響，以及整體、豐富和稀有細菌群落的相似性[18]。進一步以結構方程（SEM）分析NMDS和Mantel檢驗中顯著的環境因子對不同細菌亞群落分布的直接和間接作用，用豐富度代表多樣性，環境變量進行lg(+1)轉化，模型擬合結果判斷標準：Chi-square/df＜2，＞0.05，Root mean square error of approximation（RMSEA）＜0.05，計算在軟件Amos 17.0中進行[26]。基于樣本OTU之間Spearman系數進行共現性網絡分析，僅保留穩健相關（＞0.8,＜0.01）的OTU對兒進行構建，每個節點代表一個OTU，節點大小與度（degree）相關，拓撲結構參數采用Cytoscape 3.9.0軟件計算，可視化通過網絡平臺https:// www.omicstudio.cn/tool/實現[19]。采用Tax4Fun程序包對細菌進行功能預測，并用Wilcoxon秩和檢驗比較豐富和稀有細菌功能基因豐度差異顯著性[18]。

2 結果

2.1 土壤理化性質

長期施肥顯著改變了設施番茄土壤理化性質（表2）。與不施肥相比，有機肥和化肥施用顯著提高了土壤有機質、全氮、全磷、有效磷、速效鉀以及大、中團聚體含量，并顯著降低了土壤pH。不同有機肥施用量之間，土壤有機質含量隨有機肥施用量增加顯著提升，高量有機肥處理（M3）的土壤全氮、全磷和速效鉀含量顯著高于低量有機肥處理（M1），中高量有機肥處理（M2、M3）的土壤有效磷含量顯著高于低量有機肥處理（M1），高量有機肥處理（M3）的pH顯著低于中、低量有機肥處理（M1、M2）。

表2 不同有機肥施用量土壤理化性質

數據為平均值±標準誤。同列不同字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Data are presented by mean±SE. Different letters in the same column indicate a significant difference at＜0.05. The same as below

2.2 稀有和豐富細菌亞群落α多樣性

高通量測序數據經過質量過濾和去除嵌合體后，共保留1 360 939條高質量序列（各樣本34 492— 58 303），平均418 bp。去除單序列OTU并抽平后，共得到4 554個OTU。在每個樣本中，平均46.5%（41.7%—50.3%）的OTU被鑒定為稀有細菌，平均相對豐度僅為6.0%（4.9%—6.5%）。相比之下，每個樣本中所占比例很低的OTU被鑒定為豐富細菌（0.9%—1.5%），平均相對豐度卻可達23.0%（16.5%—45.1%）。所有樣本中，分別有381和206個OTU屬于稀有和豐富細菌，平均相對豐度分別為0.2%和55.9%。

在局域水平下，稀有細菌亞群落呈現更高的α多樣性（表3），其豐富度和多樣性分別比豐富細菌亞群落平均高出45.1%和1.5%。長期施肥對設施番茄土壤稀有和豐富細菌亞群落α多樣性的影響差異較大，其中，與不施肥相比，施肥處理下稀有細菌亞群落豐富度和多樣性分別顯著提高了19.8%— 53.8%和5.8%—80.0%，并且稀有細菌亞群落豐富度呈現隨有機肥施用量增加顯著上升的趨勢，然而，豐富細菌亞群落α多樣性受施肥影響不大（表3）。總體上，細菌整體群落（所有OTU）豐富度和多樣性隨有機肥施用分別顯著提高20.7%—27.5%和12.1%—15.1%，但不同有機肥施用量之間差異不顯著（表3）。

2.3 稀有和豐富細菌亞群落組成

豐富細菌亞群落組成和整體群落組成更為相似，門水平上，相對豐度前10名均為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcota）、甲基肌酐門（Methylomirabilota）、黏細菌門（Myxococcota）和擬桿菌門（Bacteroidota）（圖1）。與豐富細菌相比，稀有細菌亞群落涵蓋了更多類群，包含了25個細菌門分類水平，是豐富細菌亞群落的1.8倍，其組成也與豐富細菌有所差異，相對豐度排名前10的種群分別為綠彎菌門、變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、髕骨菌門（Patescibacteria）、黏細菌門、酸桿菌門、蛭弧菌門（Bdellovibrionota）、放線菌門和浮霉菌門（Planctomycetota）（圖1）。除此以外，裝甲菌門（Armatimonadota）、蛭弧菌門、脫鐵桿菌門（Deferrisomatota）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、迷蹤菌門（Elusimicrobiota）、食氫菌門（Hydrogenedentes）、匿桿菌門（Latescibacteria）、Margulisbacteria、浮霉菌門（Planctomycetota）和疣微菌門（Verrucomicrobiota）僅分布在稀有細菌亞群落，而甲基肌酐門（Methylomirabilota）和硝化螺菌門（Nitrospirota）僅分布在豐富細菌亞群落。

表3 不同施肥下細菌亞群落α多樣性

稀有：稀有細菌亞群落；豐富：豐富細菌亞群落；整體：整體群落。下同

Rare: The rare bacterial sub-community; Abundant: The abundant bacterial sub-community; Whole: The whole bacterial community. The same as below

Rare：稀有細菌亞群落；Abundant：豐富細菌亞群落；Whole：整體群落。下同

豐富細菌亞群落和整體群落組成對于長期施肥的響應也更為相似，從圖1可以看出，與不施肥相比，施肥處理下豐富細菌亞群落和整體細菌群落中變形菌門相對豐度分別顯著提高了1.4—1.8倍和1.3—1.7倍，放線菌門相對豐度分別顯著提高了1.8—1.9倍和約1.6倍；酸桿菌門和異常球菌-棲熱菌門相對豐度分別顯著下降了35.7%—49.6%、31.2%—51.4%以及86.8% —96.1%、86.8%—93.5%。豐富細菌總相對豐度（55.8%—59.1%）在施肥與不施肥處理之間差異不大，與此相比，有機肥和化肥處理下稀有細菌總相對豐度（0.2%）是不施肥處理的1.1—1.2倍。除此以外，不同有機肥施用量并未顯著影響稀有細菌亞群落中變形菌門、放線菌門等相對豐度較高的類群，而是通過影響相對豐度更低的種群改變群落組成（即相對豐度排名11以后的門水平分類，圖1中合并為其他Others），例如裝甲菌門、脫硫桿菌門只分布在不施肥或者低量有機肥處理中，而食氫菌門只分布在中高量有機肥處理中。

2.4 稀有和豐富細菌亞群落β多樣性

在區域水平下，稀有細菌亞群落β多樣性顯著高于豐富細菌和整體群落（圖2），并且從NMDS結果可以看出，豐富細菌亞群落分布格局更接近整體群落，而稀有細菌亞群落分散性更強（圖3），Mantel檢驗也證實該結果（豐富vs整體，=0.99，＜0.01；稀有vs整體，=0.24，=0.03）。不同細菌亞群落對長期施肥響應差異較大，其中，稀有細菌亞群落結構隨有機肥施用量增加發生顯著變化（圖3-a），與ANOSIM分析結果一致（M0 vs M1，=0.33，=0.02；M0 vs M2，=0.59，=0.01；M0 vs M3，=0.84，＜0.01；M1 vs M3，= 0.39，=0.02；M2 vs M3，=0.66，=0.01），而豐富細菌亞群落結構受施肥影響不大（圖3-b）。總體上，不施肥處理細菌整體群落結構顯著差別于施肥處理（ANOSIM，M0 vs M1，=0.37，=0.02；M0 vs M2，=0.59，=0.01；M0 vs M3，=0.81，＜0.01），但不同有機肥施用量之間群落結構差異不顯著（圖3-c）。

圖2 不同細菌亞群落基于Bray-Curtis相異性的β多樣性差異

圖3 不同細菌亞群落非度量多維度分析（NMDS）分布圖

2.5 稀有和豐富細菌亞群落共現模式

采用共線性網絡分析確定細菌潛在相互作用和不同亞群落對長期施肥的響應規律，分別在356（M0）、502（M1）、538（M2）和580（M3）個OTUs（節點）中捕獲了1 056、2 271、2 109和2 364個關聯（Edges），其中大多數OTUs是稀有細菌（圖4）。與M0相比，M1—M3節點數、關聯數、度和節點間正相關比例分別顯著增加了1.4—1.6倍、2.0—2.2倍、1.0—1.2倍和1.0—1.1倍，且隨有機肥施用量增加，節點數和節點間正相關比例（M1：83.9%、M2：86.7%、M3：92.4%）不斷提升，說明有機肥施用顯著增加了群落共現性網絡復雜度，并促進細菌間相互作用。其中，稀有細菌節點數、度和節點間正相關比例隨有機肥用量升高增加幅度（44.4%—75.2%、3.5%—23.1%、4.8%—13.3%）大于豐富細菌（35.9%—45.1%、-3.7%—-15.8%、0—12.2%），即施肥對稀有細菌群落穩定性影響更大。

圖4 不同細菌亞群落共現性網絡分析

2.6 影響稀有和豐富細菌亞群落的環境因素

非度量多維度分析（NMDS）結果顯示，土壤有機質（豐富，2=0.94，＜0.01；整體，2=0.94，＜0.01）、全氮（豐富，2=0.93，＜0.01；整體，2=0.94，＜0.01）、全磷（豐富，2=0.91，＜0.01；整體，2=0.94，＜0.01）、pH（豐富，2=0.87，＜0.01；整體，20.88，＜0.01）、有效磷（豐富，2=0.86，＜0.01；整體，2=0.87，＜0.01）、速效鉀（豐富，2=0.82，＜0.01；整體，2=0.84，＜0.01）、大團聚體含量（豐富，2=0.81，＜0.01；整體，2=0.75，＜0.01）、碳氮比（豐富，2=0.57，=0.02；整體，2=0.54，=0.02）和中團聚體含量（豐富，2=0.57，＜0.01；整體，2=0.54，＜0.01）是顯著影響豐富細菌亞群落和整體群落結構的關鍵環境因素（圖3-b，3-c），與Mantel檢驗結果完全一致（表4）。然而，NMDS結果顯示僅土壤有機質（2=0.67，＜0.01）、碳氮比（2=0.58，=0.02）和pH（2=0.56，=0.04）顯著影響稀有細菌亞群落分布（圖3-a）。Mantel檢驗也表明顯著影響稀有細菌亞群落分布的環境因素數量少于豐富細菌亞群落和整體群落，并且相關性值也明顯降低（表4），說明相對于豐富細菌，稀有細菌亞群落受環境過濾（Filtering）影響程度降低。

進一步采用SEM模型分析施肥及其引起的土壤性質變化對不同細菌亞群落多樣性的直接和間接影響，模型對稀有和豐富細菌多樣性變化的解釋度分別為92.3%和85.5%（圖5）。與NMDS和Mantel檢驗結果一致，SEM模型也顯示影響稀有和豐富細菌亞群落多樣性的環境因素及其作用的直接/間接途徑存在差異：施肥對稀有細菌多樣性有顯著正效應，但土壤屬性和稀有微生物多樣性之間無顯著聯系，根據標準化總效應，施肥是調控稀有細菌多樣性的首要因素；豐富細菌響應趨勢相反，施肥主要通過顯著改變土壤有機質和全磷，分別對豐富細菌多樣性產生顯著直接負效應和正效應，土壤有機質和全磷是影響豐富細菌多樣性的重要因素（圖5）。

表4 不同細菌亞群落與環境因子相關性（pearson）的Mantel檢驗

加粗字體表示顯著相關 Bold fonts indicate significant correlation (＜0.05)

模型中實線和虛線分別表示顯著和不顯著的路徑，路徑上的數值表示標準化的路徑系數。R2表示模型對該變量的解釋量。R：稀有細菌亞群落；A：豐富細菌亞群落；F：施肥量

2.6 稀有和豐富細菌潛在功能

基于Tax4Fun對不同細菌亞群落進行潛在功能預測，結果顯示稀有細菌亞群落KEGG一級代謝通路中遺傳信息處理和細胞進程功能基因豐度（9.3%、4.2%）顯著高于豐富細菌亞群落，但代謝功能基因豐度（57.6%）顯著低于豐富細菌（63.9%）。進一步基于KEGG二級代謝通路分析可以看出，與輔酶和維生素代謝、信號轉導和細胞運動等功能相關的基因豐度在稀有細菌亞群落中顯著更高，而與碳水化合物代謝、脂代謝、膜傳輸相關的功能基因豐度在豐富細菌亞群落中顯著更高（圖6），因此稀有和豐富細菌亞群落在功能上也存在差異。

*：P＜0.05

3 討論

3.1 稀有和豐富細菌多樣性和群落組成差異及其對潛在功能的影響

在多數生態系統中，土壤“豐富生物圈”有助于微生物生物量產生和有機質流動，而“稀有生物圈”則作為“種子庫”提供巨大的遺傳多樣性和功能多樣性儲備，維持生態系統健康[12]，因此，將稀有和豐富亞群落從整體群落中加以區分，并探索其分布特征及驅動因素有助于我們加深對微生物生態學的理解和研究，尤其對于長期以來處于認知盲區的稀有微生物[8,15]。本研究中，稀有細菌亞群落α和β多樣性均顯著高于豐富細菌亞群落（表3，圖2），與以往研究一致[14,18-19,27]，再次印證了稀有類群是微生物多樣性的主要貢獻者這一觀點[28]，一方面因為稀有類群的低豐度特性有助于其免于病毒裂解和捕食造成的物種損失[29]，另一方面由于稀有微生物作為“種子庫”擁有更高的新物種輸入[30]。除了多樣性，稀有細菌亞群落物種組成也與豐富細菌差異明顯（圖1），一方面體現在稀有細菌亞群落涵蓋更多且獨有（即門水平上只分布在稀有細菌亞群落的類群）的物種類群，另一方面體現在主要的細菌門在稀有和豐富亞群落之間相對豐度差異顯著，例如變形菌門（稀有12.0% vs豐富20.6%）、擬桿菌門（稀有8.0% vs豐富1.0%）。物種的稀有性可能是隨機過程、生命史策略的內在權衡以及生物與非生物相互作用的結果[31]，例如本研究中僅分布在稀有細菌亞群落的脫硫桿菌門在先前研究也被鑒定為稀有細菌[18]，最新研究顯示該門中部分類群可利用底物十分有限[32]，生存策略導致生態位狹窄，屬于永久稀有類群；而另外一些類群既包含稀有細菌也包含豐富細菌，例如本研究中擬桿菌門，在以往研究中也有時被鑒定為稀有細菌[19,27]，有時被鑒定為豐富細菌[8,18]，這類微生物屬于r-策略者，其相對豐度隨周期或隨機的環境變化（如溫度、降水等）而波動，是有條件的稀有類群[15]。微生物功能的發揮高度依賴其多樣性及群落組成，因此，稀有細菌亞群落功能也顯著差別于豐富細菌（圖6）。其中，與基礎功能相關的養分和能量代謝（例如碳水化合物代謝）更多分布在豐富細菌亞群落，表明設施農業中豐富細菌可能負責主要的生態系統功能，而本研究發現豐富細菌亞群落更接近整體群落（圖1、3）也從側面證實了該推斷。與之相比，稀有細菌亞群落更多體現在輔助功能上（例如輔酶代謝），從而為微生物群落功能冗余做出貢獻，許多研究表明稀有細菌是保障土壤多功能性和提高微生物群落抵御環境擾動能力的關鍵[13,23]，當環境條件發生變化時不適應環境的豐富細菌豐度下降，而更適應新環境的稀有細菌豐度升高，最終使生態系統結構和功能一直保持穩定健康狀態。

3.2 長期施肥對稀有和豐富細菌分布模式的影響及關鍵環境因子

闡明長期施肥對設施土壤稀有和豐富微生物亞群落的影響可以為解析農業活動對微生物多樣性與土壤功能穩定性之間的關系提供新視角，為降低集約施肥對陸地生態系統的影響提供科學依據。本研究表明，長期施肥并未顯著改變豐富細菌亞群落多樣性，僅群落組成受到影響，表現為富營養型細菌相對豐度隨有機肥施用量增加顯著提高，例如變形菌門和放線菌門[33]，而寡營養型細菌則相反，例如酸桿菌門[33]。在自然陸地生態系統[19]和水體系統[9]中也發現豐富細菌亞群落對環境變化的敏感性較低，這可能是由于豐富細菌所占生態位更寬，能競爭利用更廣泛的資源，從而在環境擾動中保證其優勢地位[34]。與豐富細菌相比，稀有細菌低豐度和高多樣性的特性使其在面臨擾動時表現出更高的活性和周轉[9]，做出快速響應以適應新環境[21]。本研究中，與不施肥相比，長期施用有機肥和化肥顯著提高稀有細菌α多樣性（表3）和總相對豐度（圖1），改變稀有細菌亞群落組成和結構（圖1、3）；并且，隨著有機肥施用量增加，稀有細菌豐富度顯著提升（表3），亞群落組成和結構也發生顯著變化（圖1、3）。最新研究也表明長期施用有機肥主要通過影響稀有微生物類群而非豐富類群增加土壤微生物多樣性[23]，與本研究結果一致。一方面，有機肥中含有豐富的氨基酸、蛋白質、維生素和無機鹽等營養物質，施入土壤后為狹窄生態位和資源利用種類單一的稀有細菌提供了更多底物，顯著提高了該類群稀有細菌相對豐度和多樣性；另一方面，有機肥施用可以重塑根際土壤微生物群落[35]，從而激活因生物相互作用（例如資源競爭能力弱）導致稀有的微生物。本研究顯示長期施用有機肥顯著增強了細菌生態網絡的交互度和穩定性，特別是稀有細菌（圖4），可能正是由于有機肥改善了化肥施用或番茄連作導致的土壤微生物群落結構失衡[36]，例如激發土著有益菌，抑制病原菌增殖并降低其生存能力，為稀有細菌留下生存空間。有趣的是本研究還發現9年番茄平均產量與稀有細菌豐富度相關性（=0.77，=0.03）高于豐富細菌（=0.50,=0.05），與LIANG等[13]在玉米試驗中觀察到的規律一致，但都低于整體群落（=0.89,＜0.001），然而前面提到稀有細菌主要負責輔酶、維生素代謝等輔助功能，豐富細菌才是養分、能量代謝等基礎功能的主體參與者（圖6），這說明對于經濟作物，長期大量有機肥和化肥供應使得碳水化合物、氮磷等養分不再是產量的限制因子，反而是輔酶、維生素代謝等途徑的增強可能對產量做出更大潛在貢獻，并且稀有細菌輔助功能更大的價值可能體現在番茄品質的提升，但仍需要后續試驗進行驗證。同時也強調了稀有和豐富細菌之間復雜的相互作用和功能互補形成的健康區系是微生物生態功能發揮的保障。

本研究還發現，影響稀有和豐富細菌亞群落的關鍵環境因子也不相同（圖3、5，表4），其中，多種與確定性過程相關的土壤因子（有機質、養分、pH、大中團聚體等）被證實顯著影響設施土壤豐富細菌亞群落分布（圖3），與先前在玉米[13]、茶園[7]、草地[19]和石油污染土壤[14]中得到的結果一致。這種確定性過程主導下，群落演替是定向且收斂的，即群落間相異性隨著環境篩選逐漸降低[37]，因此豐富細菌亞群落在不同處理間差異并不顯著（圖3）。相比之下，隨機性過程強調物種間相對豐度的隨機變化、不由環境決定其適應度（即生態漂移），其主導的群落構建缺乏收斂性，更為發散[18]。而本研究中稀有細菌亞群落受環境過濾的影響程度明顯下降（圖5，表4），且群落分散性更強（圖3），暗示了兩種亞群落構建機制可能存在差異。群落構建過程決定了微生物組成和多樣性，進而影響其生態功能和服務[2,33]，因此揭示微生物群落構建機制（或確定性過程和隨機性過程的相對重要性）一直是生態學研究的中心議題，然而關于稀有和豐富細菌亞群落構建驅動因素的研究仍處于起步階段，且結果不盡相同。多數研究表明土壤豐富細菌亞群落構建受確定性過程的支配作用更強[7,13-14,18]，與本研究一致，而稀有細菌因高度多樣化從而占據更多樣化的生態位，因此受環境過濾/篩選強度明顯低于豐富細菌亞群落，其分布更多受擴散限制等中性過程或更為復雜的生態過程與機制的影響[3]。

4 結論

與豐富細菌和整體群落相比，稀有細菌亞群落呈現更高的多樣性和獨特的群落組成，提高微生物群落功能冗余，其“種子庫”和“功能池”作用對生態系統穩定至關重要。在設施土壤中，長期施肥主要通過影響稀有細菌（即提高多樣性、改變群落組成、增加網絡復雜度）而非豐富細菌從而改變細菌整體群落，并且介導稀有和豐富細菌亞群落構建的環境因子也不相同，其中，土壤有機質、全量氮磷、有效磷、速效鉀、pH、大中團聚體等多種與確定性過程相關的土壤因子顯著影響豐富細菌亞群落，而稀有細菌亞群落受環境過濾的影響程度明顯下降，且群落分散性更強，暗示兩種亞群落構建機制可能存在差異。

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Effects of Long-Term Application of Organic Fertilizer on Rare and Abundant Bacterial Sub-Communities in Greenhouse Tomato Soil

LIU Lei, SHI JianShuo, ZHANG GuoYin, GAO Jing, LI Pin, REN Yanli, WANG LiYing

Institute of Agricultural Resources and Environment, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Hebei Fertilizer Technology Innovation Center, Shijiazhuang 050051

【Objective】The objective of the present study was to distinguish the rare and abundant bacteria from the whole community and to explore their responses to long-term application of organic fertilizer respectively, so as to provide new insights into the relationships between soil biodiversity and ecosystem functioning under major agricultural activities. 【Method】Based on the long-term fertilization experiment of greenhouse tomato, soils were collected under four different treatments, including no fertilizer (M0), low organic fertilizer 5.68 t·hm-2(M1), medium organic fertilizer 8.52 t·hm-2(M2), and high organic fertilizer 11.36 t·hm-2(M3). Illumina MiSeq platform was used to analyze the diversity, community composition, co-occurrence network and potential functions differences of the rare and abundant bacterial sub-communities, and their various responses to long-term fertilization, to illustrate the key factors driving the distinct distribution patterns and responses for rare and abundant bacteria. 【Result】Compared with the abundant bacterial sub-community, the rare bacterial sub-community showed higher α- and β-diversity and distinct community composition, as well as potential functions. A functional prediction detected that abundant bacteria contributed primary functions in the greenhouse ecosystem, such as nutrient and energy metabolism, meanwhile rare bacteria contribute a substantial fraction of auxiliary functions (e.g., metabolism of cofactors), which indicated they played important roles in the functional redundancy of microbial communities. Contrasting responses of rare and abundant bacterial sub-communities to long-term fertilization were revealed in this study, in which the rare bacteria was more sensitive. Compared with no fertilizer, the long-term application of organic and chemical fertilizer significantly increased the OTU richness, Shannon diversity, and total relative abundance by 19.8%-53.8%, 5.8%-8.0%, and 1.1-1.2 times, respectively, and changed the community composition and structure of rare bacterial sub-communities. In addition, with the increased application rates of organic fertilizer, the OTU richness of rare bacteria also increased significantly, accompanied by obvious changing in community composition and structure. However, the abundant bacteria exhibited less sensitivity to long-term fertilization, with only the community composition altered. Besides, the co-occurrence network complexity increased with organic fertilizer rates, especially in rare sub-communities. Both the results of the NMDS and mantel test revealed that the controlling factors affecting rare and abundant bacterial sub-communities were different. A variety of soil factors associated with deterministic processes, i.e., SOC, soil nutrients of total N and P, Olsen-P and available K, and pH, as well as macro- and medium-aggregate, significantly influenced abundant bacteria. Structural equation model (SEM) further showed that soil organic matter and total phosphorus directly drove abundant bacterial diversity. On the other hand, less effects of environmental filtering and more scattered distribution patterns were found in rare bacteria, indicating different assemblies of rare and abundant sub-communities. 【Conclusion】Compared with the abundant bacteria and the whole community, the rare bacteria sub-community showed higher diversity and unique community composition, which improved the functional redundancy of the microbial community. Long-term fertilization altered the whole bacterial community mainly by affecting rare bacteria (i.e., increasing diversity, changing community composition, increasing co-occurrence network complexity) rather than the abundant bacteria. The controlling factors that mediated the assembly of the rare and abundant bacterial sub-communities were also different.

rare bacteria; abundant bacteria; organic fertilizer; greenhouse tomato; diversity; community assembly; ecosystem function

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.18.010

2022-10-09；

2023-03-20

河北省重點研發計劃項目重大專項（21326904D）、河北省農林科學院科技創新專項（2022KJCXZX-ZHS-1）

劉蕾，E-mail：liuleihbnky@163.com，史建碩，E-mail：sjzjianshuo@126.com，劉蕾和史建碩為同等貢獻作者。通信作者王麗英，E-mail：wangliying5@163.com

（責任編輯 李云霞）