CircCEP85L對牛肌肉干細胞增殖、成肌分化的調控

韋瑤，張瑞門，安強，王樂怡，張永旺，鄒超霞，張爾康，莫碧云，石德順，楊素芳，鄧彥飛，韋英明

CircCEP85L對牛肌肉干細胞增殖、成肌分化的調控

韋瑤1，張瑞門1，安強1，王樂怡1，張永旺1，鄒超霞1，張爾康1，莫碧云2，石德順1，楊素芳1，鄧彥飛，韋英明

1廣西大學動物科學技術學院/廣西畜禽繁育與疾病防控重點實驗室，南寧 530004；2欽州市動物疫病預防控制中心，廣西欽州 535099；3廣西大學農牧產業發展研究院，南寧 530004

【目的】目前，越來越多的研究證明環狀RNA（circRNA）在牛肌肉發育過程中扮演著重要的角色，但其分子調控機理尚未完善。通過挖掘與牛肌肉發育相關的circRNA的作用機制，為進一步闡明其調控牛肌肉發育的分子機制奠定基礎。【方法】以前期分析的增殖期(GM)與成肌分化期（DM）黃牛肌肉干細胞（MuSCs）的RNA-seq測序結果為基礎，篩選出顯著差異表達的circRNA，circCEP85L。采集新鮮黃牛胎牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、腸和胃的組織樣本，分離培養黃牛肌肉干細胞并誘導成肌分化，收集黃牛體外培養的GM與DM細胞，分別提取RNA并反轉錄為cDNA。通過實時熒光定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）檢測circCEP85L在不同組織及不同細胞狀態的表達規律。同時，設計特異性引物擴增circCEP85L全長，構建過表達載體p-circCEP85L，質粒轉染MuSCs后收集過表達circCEP85L細胞樣本。以過表達質粒pCD5-ciR細胞樣本為對照，采用qRT-PCR、流式細胞術、Western Blot及免疫熒光等技術檢測過表達circCEP85L對黃牛MuSCs增殖、凋亡及成肌分化的影響。【結果】PCR電泳結果證明circCEP85L環化位點真實存在。CircCEP85L在多種組織中表達，并在DM期的表達量顯著高于GM期（＜0.001）；為了進一步探究對circCEP85L黃牛MuSCs的影響。將過表達載體p-circCEP85L與對照載體pCD5-ciR轉染體外培養的黃牛MuSCs，繼續培養24 h之后，EdU結果表明過表達circCEP85L能顯著降低EdU陽性細胞比例（＜0.001）；流式周期檢測結果表明，過表達circCEP85L增加了G0/G1期細胞比例，顯著減少S期細胞比例（＜0.001）；流式凋亡結果表明，過表達circCEP85L顯著抑制MuSCs的凋亡率（＜0.05）。QRT-PCR及Western blot檢測黃牛MuSCs增殖及凋亡相關基因的表達情況,結果表明過表達circCEP85L后顯著降低了黃牛MuSCs增殖及凋亡相關基因的mRNA表達水平（＜0.001）,凋亡蛋白BAX的表達量也顯著降低（＜0.01）。此外，為了檢測過表達circCEP85L對黃牛MuSCs成肌分化的影響，在轉染24h后更換分化培養基誘導細胞分化，Western blot及免疫熒光結果顯示過表達circCEP85L后顯著促進分化標志基因的表達水平（＜0.001），細胞融合形成肌管的數量和大小均顯著高于對照組。【結論】研究表明，circCEP85L通過抑制黃牛MuSCs增殖和凋亡、促進細胞成肌分化，從而影響黃牛骨骼肌的生長發育過程，為circRNA調控黃牛骨骼肌的生長發育機制研究奠定基礎。

circCEP85L；肌肉干細胞；細胞增殖；成肌分化

0 引言

【研究意義】骨骼肌的生長發育與牲畜的產肉量密切相關，它的發育受許多基因、轉錄因子及一些非編碼RNA（ncRNA）的調控[1-4]。最新的研究表明circRNA在骨骼肌細胞增殖、成肌分化等過程中發揮重要作用。因此，研究動物骨骼肌生長發育相關circRNA的調控機制對于促進畜牧業發展具有重要意義。【前人研究進展】circRNA是不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴的共價閉合環狀結構的內源性非編碼RNA分子[5]。circRNA最初是通過電子顯微鏡在植物類病毒中發現的[6]，長時間內被認為是沒有功能的RNA分子。隨著生物學的快速發展，circRNA在腦、心臟、骨骼肌等許多組織中被發現[7]，具有高度的保守性和穩定性。近年來的研究發現circRNA以多種方式參與調控動物骨骼肌的發育。首先，作為競爭性內源RNA（ceRNA）發揮作用，如circZfp609通過吸附miR-194-5p調節小鼠成肌細胞分化[8]；CDR1as通過競爭性結合miR-7促進山羊骨骼肌的發育[9]；circHIPK3、circFGFR2和circSVIL通過吸附miRNA促進雞骨骼肌的發育[10-12]；circTUT7可作為miR-30a海綿調節豬骨骼肌的發育[13]; circMYBPC1、circRILPL1和circTTN等[14-18]結合miRNA參與牛骨骼肌的發育。其次，circRNA能與特定的RNA結合蛋白（RBP）結合進而調控RBP及目的分子的作用，如circ-FOXO3可以和細胞周期蛋白依賴性激酶2（）與形成circ-FOXO3-CDK2-P21三元復合物，從而抑制細胞周期[19]。此外，circRNA可編碼蛋白質，如circ- ZNF609可翻譯成微肽并在肌生成中發揮作用[20]。以上研究表明，circRNA在調控肌肉發育方面發揮至關重要的作用。【本研究切入點】目前circRNA在癌癥、腫瘤和其他醫學方面的研究較為廣泛，但在黃牛肌肉發育方面的研究鮮見報道，其調控機制尚不完善。在之前的一項研究中，黃牛肌肉干細胞（MuSCs）增殖、成肌分化的circRNA表達譜已經被揭示[17]，本研究從中發現了一個新的circRNA，circCEP85L可能對MuSCs有關鍵的調控作用。【擬解決的關鍵問題】進一步探究circCEP85L的表達特征及其對黃牛MuSCs的功能影響，為后續深入研究circCEP85L在黃牛肌肉生長發育中的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2022年4—9月在廣西大學廣西畜禽繁育與疾病防控重點實驗室進行。

1.2 試驗材料

胚胎期（3月齡）的黃牛胎兒來源于廣西南寧市屠宰場、欽州市欽北區嘉德富肉牛養殖專業合作社。收集肌肉、肝臟、心臟、肺臟、腸、腎臟、脾臟和胃組織，并立即投入液氮中冷凍，運回到實驗室再將各組織整理后置-80℃保存備用。大腸桿菌Trans-T1感受態細胞、環狀RNA過表達載體pCD5-ciR、內切酶（RI和HI）及連接酶均由廣西大學廣西畜禽繁育與疾病防控重點實驗室提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃牛MuSCs的分離、培養和成肌分化 黃牛MuSCs的分離、培養：胚胎期（3月齡）的黃牛胎兒從體內取出后，用一次性無菌袋包裝后在恒溫條件下于2—3 h內送達實驗室。將黃牛胎兒用含雙抗（1%青霉素和鏈霉素）的PBS緩沖液沖洗，并用75%酒精擦拭胎兒皮膚表面，眼科剪和鑷子分離出背最長肌肌肉組織。將組織轉移至超凈工作臺中，用含雙抗的PBS緩沖液漂洗組織塊3次，再放入75%酒精中漂洗20—30 s，隨即將組織塊用含雙抗的PBS緩沖液漂洗3—5次。剔除筋膜后將組織放到小皿中剪碎至1 mm3，采用兩步酶消化法（先0.2%I型膠原蛋白酶消化1 h, 再0.25%胰蛋白酶消化0.5 h）消化后[21]，加入2倍體積的含10%胎牛血清（FBS; Thermo Fisher Scientific, HyClone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM（Gibco, Logan, UT, USA）終止消化；使用70 μm細胞濾器進行過濾，除去多余的組織塊和其他雜質，離心并棄上清；將細胞鋪至100 mm的無菌培養皿中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養；2 h后取上清液至另一新的培養皿進行貼壁培養。原代細胞用含10%FBS和雙抗的高糖DMEM培養基進行培養。

黃牛MuSCs傳代培養及成肌分化誘導：當細胞匯合度達90%左右時，即可進行細胞的傳代培養。經過傳代培養后，處于增殖狀態的MuSCs標記為GM樣本（n=3），并收集備用；當MuSCs長至90%時將培養基更換為成肌分化培養基（含2%HS的高糖DMEM）用于細胞誘導分化，每天更換分化培養基，4 d后收集成肌分化的細胞并標記為DM樣本（n=3）。

1.3.2 總RNA的提取及cDNA的合成 采用Trizol試劑（Vazyme, 南京）提取各樣本的總RNA，并使用ND-100超微量紫外可見分光光度計（Miulab, 杭州）測定RNA濃度及純度。將質量和濃度檢測合格的RNA樣品根據HiScript? Ⅲ RT SuperMix for qPCR試劑盒（Vazyme, 南京）逆轉錄為cDNA。

1.3.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）引物設計及合成 根據GenBank基因序列，使用Oligo7.0軟件設計特異性擴增引物，具體引物信息如表1所示，均由上海生工生物工程有限公司合成。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme, Nanjing, China）進行qRT-PCR試驗。作為內參，qRT-PCR采用2-ΔΔt方法計算。

1.3.4 qRT-PCR反應 反應體系為20 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA模板（100 ng·μL-1）1 μL，加ddH2O至20 μL。反應程序為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環。每個樣本設置3個重復[22]。

1.3.5 circCEP85L的鑒定及過表達載體構建 bta_ circ_0003271是來源于其宿主基因CEP85L，因此命名為circCEP85L，轉錄本長度為657 nt的環狀RNA。設計并合成circCEP85L的全長序列引物（circCEP85L F：5′CGGAATTCTAATACTTTCAGTGATGTGCAGAG TCAGAGT-3′; circCEP85L R:5′CGGGATCCAGTTGTTCTTACTCAAGAGTTGGAAGATCAG-3′）。擴增circCEP85L全長序列。使用RI和HI酶切PCR擴增產物及pCD5-ciR載體，酶切產物純化后利用同源重組酶進行連接。取10 μl連接產物轉化至Trans-T1感受態中，轉化完成后在37℃搖床培養1 h，將菌液于含氨芐抗性的LB營養瓊脂板上進行培養，隨機挑取10個獨立的陽性克隆進行菌液擴增，菌液PCR完成后，將能擴出circCEP85L的菌液送至上海生工生物工程股份有限公司測序。把正確連接的單克隆菌液進行擴大培養，用無內毒素質粒抽提試劑盒（天根, 北京）抽提質粒，并將載體命名為p-circCEP85L。

表1 qRT-PCR基因引物合成序列

1.3.6 黃牛MuSCs的轉染試驗 將細胞接種于孔板中，細胞匯合度達70%左右時，利用脂質體轉染法（轉染試劑ExFect Transfection Reagent（Vazyme, 南京））分別將過表達質粒p-circCEP85L和對照質粒pCD5- ciR與轉染試劑ExFect Transfection Reagent（Vazyme, 南京）加入高糖DMEM基礎培養基中（每組3個重復），室溫孵育15 min，將孵育好的混合物分別加到MuSCs細胞孔板中并輕輕混勻，12 h后更換完全培養液繼續培養。待細胞生長密度為90%以上時，使用分化培養基誘導黃牛MuSCs分化。

1.3.7 EdU試驗檢測細胞增殖 將細胞接種于96孔板，當細胞密度達到70%左右，分別用過表達質粒p-circCEP85L和對照質粒pCD5-ciR轉染MuSCs細胞，12 h后換液繼續培養。轉染48 h后參照銳博EdU試劑盒（RiboBio, 廣州）說明書，對細胞進行孵育、固定、通透等處理，染色完成后加PBS緩沖液避光保存待用。每個樣品隨機選擇3個視野，用熒光顯微鏡觀察細胞。增殖率=（新增殖的細胞數目/總細胞數目）×100%。

1.3.8 流式細胞儀檢測細胞周期與凋亡 在12孔板中接種細胞，分別用過表達質粒p-circCEP85L和對照質粒pCD5-ciR轉染黃牛MuSCs細胞，48h后收集細胞，Cell Cycle Staining Kit（Multi Sciences, 杭州）試劑盒用來檢測不同試驗組的細胞周期分布情況。AnneXin V-FITC/PI Staining Kit（Multi Sciences）試劑盒用來檢測黃牛MuSCs細胞凋亡率。在試劑盒孵育細胞完成后使用Attune? NxT聲波聚焦流式細胞儀（Invitrogen, Singapore）檢測細胞周期以及凋亡率。每個樣品3個重復，試驗結果使用Flow Jo v10（Tree Star, Inc, Ashland, OR）軟件分析。

1.3.9 免疫印跡（Western blot, WB）檢測 收集細胞，用含1% PMSF（GenStar, 北京）的RIPA（Beyotime, 上海）裂解液冰上裂解細胞30 min，用BCA試劑盒（Beyotime, 上海）測定蛋白濃度，并經4×SDS上樣緩沖液（Solarbio? Life Sciences, 北京）變性。提取到的蛋白經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質并轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉處理膜，室溫封閉2 h。稀釋一抗PCNA、MyH6、CDK2、BAX、β-Actin（1﹕2 000 Dilution；ABclonal Technology,武漢），稀釋后的一抗與PVDF膜共同在4 ℃孵育過夜。用1×TPST清洗膜后，再次將PVDF膜與山羊抗兔二抗（1﹕5 000 Dilution；ABclonal Technology）共同室溫孵育2 h。用超敏ECL化學發光試劑盒處理PVDF膜，進行曝光和顯影。作為對照樣本，用ImageJ軟件（National Institutes of Health, Baltimore, MD, USA）分析蛋白灰度值。相對蛋白表達量以目的條帶灰度值與條帶的比值表示。

1.3.10 免疫熒光試驗 使用4%多聚甲醛固定處理的細胞30 min，去除4%多聚甲醛后用1%TritonX-100通透處理10 min，1%BSA用來封閉細胞，1h后加入兔抗MyH6（1﹕200 Dilution, ABclonal Technology）、PAX7（1﹕200 Dilution, ABclonal Technology），4℃孵育過夜。PBS清洗后加入山羊抗兔抗體（1﹕100 Dilution, ABclonal Technology），避光室溫孵育1.5 h，最后用10 μg·mL-1DAPI染色10 min，加入少量PBS緩沖液覆蓋細胞，在熒光顯微鏡下隨機選擇3 個視野進行拍照觀察。

1.3.11 統計分析 qRT-PCR數據使用t檢驗評估組間差異，并使用Prism8.0版（GraphPad Software, USA）進行統計分析。≤0.05被認為是有統計學意義的。每個試驗重復3次，*＜0.05； **＜0.01；***＜0.001。

2 結果

2.1 黃牛MuSCs的分離、培養和鑒定

3月齡黃牛胎兒用于分離MuSCs（圖1-A）；貼壁培養24 h的P1代黃牛MuSCs，呈紡錘形，形態均一性較好（圖1-B）；對培養的MuSCs進行分化誘導，結果顯示誘導4 d細胞融合產生大量肌管（圖1-C）。細胞免疫熒光試驗檢測P1代黃牛MuSCs中PAX7的表達情況，結果顯示MuSCs能表達其特異性蛋白PAX7（圖1-D），由此說明，本研究所分離獲得的細胞為高純度黃牛MuSCs，可作為后續研究的試驗材料。

A：3月齡黃牛胎兒；B：黃牛MuSCs的增殖期（GM）生長狀態；C：黃牛MuSCs的分化期（DM）生長狀態；D：細胞免疫熒光顯示黃牛MuSCs表達其特異性蛋白PAX7。標尺=100/400 μm

2.2 circCEP85L的表達譜特征

circCEP85L在黃牛胎牛組織中的表達分析顯示（圖2-A），circCEP85L在各組織中均有表達，在脾臟中表達最高，其次是心臟、肌肉、腸、胃、肺臟和腎臟，在肝臟中表達最低。對培養的增殖期黃牛MuSCs進行分化誘導4 d后收樣，qRT-PCR檢測結果顯示（圖2-B），circCEP85L在DM期的表達量極顯著高于GM期（＜0.001）。

A：circCEP85L的組織表達譜；B：circCEP85L在黃牛MuSCs分化前后的表達情況。圖表‘abcd’表示差異的顯著性，首先按照平均值從大到小排列，最大的標為'a'，任何不顯著的差異標為'a'，直到與之有顯著差異的標為'b'（P＜0.05），以此類推；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001, 無*表示差異不顯著（P＜0.05）。下同

2.3 circCEP85L的鑒定及過表達載體的構建

根據測序所得的circCEP85L基因序列，擴增circCEP85L全長序列為657 bp，將circCEP85L全長克隆到pCD5-ciR，獲得其過表達質粒p-circCEP85L。circCEP85L基因序列PCR電泳結果和質粒p-circCEP85L電泳鑒定結果如圖3所示。

M1：Supercoiled DNA ladder marker；Ⅰ：cirCEP85L的PCR擴增產物；M2：DL2000 Plus DNA marker；Ⅱ：pCD5-ciR質粒；Ⅲ：p-circCEP85L質粒

2.4 過表達circCEP85L對黃牛MuSCs增殖的影響

將過表達質粒p-circCEP85L和空白對照質粒pCD5-ciR分別轉染黃牛MuSCs，轉染48 h后通過qRT-PCR驗證circCEP85L的mRNA相對表達量。結果顯示（圖4-A），轉染了p-circCEP85L的細胞中circCEP85L的表達水平顯著升高（＜0.01）。EdU檢測結果顯示（圖4-B、C），過表達circCEP85L極顯著降低EdU陽性細胞比例（＜0.001）；過表達circCEP85L在mRNA水平上和蛋白水平上顯著抑制了增殖標記基因、的表達（圖4-D—F）（＜0.001）。此外，通過流式細胞術檢測試驗進一步評估過表達circCEP85L對黃牛MuSCs周期分布的影響，結果顯示（圖4-G、H），過表達circCEP85L增加G0/G1期細胞比例，顯著減少S期細胞比例（＜0.001）。表明，過表達circCEP85L能夠抑制黃牛MuSCs的增殖。

A：circCEP85L的過表達效率；B、C：EdU法檢測細胞增殖并統計陽性細胞數；D：細胞增殖相關基因mRNA的表達情況檢測；E、F：增殖相關基因蛋白的表達情況檢測；G、H：使用流式細胞術分析評估過表達circCEP85L對細胞周期分布的影響。標尺=400 μm

2.5 過表達circCEP85L對黃牛MuSCs凋亡的影響

檢測過表達circCEP85L對黃牛MuSCs中凋亡相關標記基因表達的影響，結果顯示（圖5-A—C），過表達circCEP85L后使凋亡標記基因（、）的mRNA表達水平顯著降低（＜0.001），同時，凋亡標記基因（）的蛋白表達水平也顯著降低（＜0.01）。此外，通過細胞凋亡試劑盒進一步評價過表達circCEP85L對MuSCs凋亡的影響，流式凋亡結果顯示（圖5-D、E），過表達circCEP85L在黃牛MuSCs中具有顯著抑制細胞凋亡的特性（＜0.05）。表明，過表達circCEP85L能夠抑制黃牛MuSCs細胞的凋亡。

A：細胞凋亡相關基因mRNA的表達情況檢測；B、C：凋亡標記基因BAX蛋白的表達情況檢測；D、E：使用流式細胞術分析評估過表達circCEP85L對細胞凋亡的影響

2.6 過表達circCEP85L對黃牛MuSCs分化的影響

對轉染pCD5-ciR與p-circCEP85L的黃牛MuSCs進行分化誘導，結果發現轉染p-circCEP85L組的肌管數量及大小高于pCD5-ciR組（圖6-A），且免疫熒光和Western Blot實驗結果顯示誘導分化后分化標志基因的蛋白表達水平顯著升高（＜0.001）（圖6-B—D）。以上結果表明，過表達circCEP85L能夠促進黃牛MuSCs的分化。

A：誘導分化4 d后黃牛MuSCs的形態；B：免疫熒光顯示誘導分化后MyH6的表達情況；C、D：Western Blot檢測誘導分化后分化標志基因MyH6蛋白表達情況檢測，標尺=100/400 μm

3 討論

3.1 CircRNA調控骨骼肌的生長發育

MuSCs作為骨骼肌的基本形成單位，它通過成肌分化、相互融合形成肌管以影響骨骼肌的發育過程，這個過程受到肌肉發育調節因子和調控通路多層次的精細調節。CircRNA作為一類新型的非編碼RNA已被大量研究證實在生物過程中發揮重要的作用，同樣也被證實作為調控因子參與骨骼肌的發育過程[23]。與線性RNA不同，circRNA由于其獨特的環狀結構而具有更高的穩定性、抗RNase R和更長的半衰期等特性，同時表現出動態和組織特異性表達的特征，在不同的組織中表現出不同的功能[24-25]。在肌肉發育過程中，雖然已經報道了許多功能性circRNA，但仍有許多未知的circRNA有待發現，其調控機制尚不明確。筆者根據前期的測序數據，篩選出了一個新的circRNA ——circCEP85L，在MuSCs的DM細胞中的表達量顯著高于GM細胞，表明circCEP85L在DM細胞中可能發揮重要的作用。此外，circCEP85L在黃牛不同組織中均有表達，這提示circCEP85L在黃牛骨骼肌發育過程具有潛在的調控作用。

3.2 CircCEP85L調控MuSCs的增殖與凋亡

有研究表明circRNA在細胞增殖及凋亡過程中發揮重要的作用，如circSNX29經過表達后可以抑制牛成肌細胞的增殖[26]；circEch1過表達促進牛成肌細胞的增殖[27]；circLMO7增加了成肌細胞S期的細胞的數量，降低了G0/G1期細胞的比例[28]；circHUWE1和circINSR可以促進牛成肌細胞增殖并抑制細胞凋亡[29-30]；circ-13267通過let-7-19/ERBB4通路調控蛋鴨卵泡顆粒細胞凋亡[31]。為了探究circCEP85L在MuSCs中的作用，筆者使用EdU初步證實了過表達circCEP85L抑制黃牛MuSCs；通過qRT-PCR、Western Blot技術從mRNA、蛋白水平上檢測增殖、凋亡相關基因的表達；流式細胞術分析細胞周期及凋亡情況進一步證實了過表達circCEP85L抑制黃牛MuSCs增殖和凋亡。

3.3 CircCEP85L對MuSCs成肌分化的影響

CircRNA除了調控肌肉細胞增殖和凋亡，它對細胞的分化調控也發揮重要作用。circ-CDR1as可能通過競爭性結合miR-7阻礙下調來促進山羊骨骼肌衛星細胞（SMSCs）分化[9]。小鼠成肌細胞細胞系（C2C12）中，circZfp609通過吸附miR-194-5p以解除對下游靶基因的抑制作用，并通過影響和的表達間接抑制成肌細胞的分化[8]。此外，circFGFR4是形成的環狀RNA，它在牛肌肉中高表達并競爭性結合miR-107調控Wnt3a的表達，間接促進牛成肌細胞的分化[32]。本試驗表明過表達circCEP85L后，黃牛MuSCs成肌分化融合形成明顯的肌管，且肌管數量顯著高于對照組；分化標記基因的蛋白表達水平也上調。這表明過表達circCEP85L對黃牛MuSCs的成肌分化具有顯著促進作用。

3.4 CircCEP85L可能調控的下游機制

CircRNA有多種調控機制，包括：調控其宿主基因的表達；吸附miRNA；調節結合蛋白的活性；翻譯短肽發揮功能；結合基因啟動子影響其轉錄。CEP85L基因是circCEP85L的親本基因，circCEP85L可以通過影響CEP85L基因的轉錄從而對肌肉干細胞進行調控。同時，circCEP85L還可以通過吸附miRNA對下游基因進行調控。另外，circCEP85L也可通過RNA結合蛋白進而影響下游基因的活性。盡管circCEP85L對黃牛肌肉干細胞的作用已明確，但是其作用機制還有待進一步研究。

4 結論

成功分離了黃牛肌肉干細胞，根據之前已有的黃牛circRNA測序結果，篩選得到可能存在關鍵作用的circRNA——circCEP85L，對其在黃牛胎牛以及黃牛肌肉干細胞中的表達特征進行了分析，并且證明了circCEP85L是調控黃牛MuSCs增殖和成肌分化的關鍵分子，為研究circRNA的調控機制奠定了基礎。同時，為肉牛的分子育種新增候選分子靶標。

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CircCEP85L Regulates the Proliferation and Myogenic Differentiation of Bovine MuSCs

1State Key Laborator for Conservation and Untilization of Subtropical Agro-bioresources /College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004;2Qinzhou Center for Animal Disease Control and Prevention, Qinzhou 535099, Guangxi;3Research Institute of Agriculture and Animal Husbandry Industry Development, Guangxi University, Nanning 530004

【Objective】At present, studies have proved that circRNA plays important roles in the development of bovine muscle, but its molecular regulation mechanism remain elusive.Screening circRNAs related to bovine muscle development can lay a foundation for further elucidating the molecular mechanism of bovine muscle development.【Method】In this study, RNA-seq sequencing results of proliferating (GM) and myogenic differentiation (DM) yellow bovine muscle stem cells (MuSCs) analyzed in the previous stage were used to screen for significantly differentially expressed circRNA, circCEP85L. Tissue samples of heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle, intestine and stomach were collected aseptically from fresh yellow fetal calves, and yellow muscle stem cells were isolated and cultured and induced into myogenic differentiation. GM and DM cells cultured in vitro from yellow calves were collected, RNA was extracted and reverse transcribed into cDNA, respectively. Quantitative real time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression of circCEP85L in different tissues and different cell states. Meanwhile, specific primers were designed to amplify the full length of circCEP85L, and the overexpression vector p-circCEP85L was constructed. The plasmid was transfected into MuSCs and overexpressed circCEP85L cell samples were collected. Using overexpression plasmid pCD5-ciR cell samples as control, qRT-PCR, flow cytometry, Western Blot and immunofluorescence were used to detect the effects of overexpression of circCEP85L on proliferation, apoptosis and myogenic differentiation of yellow bovine MuSCs.【Result】The electrophoresis of PCR product proved the existence of circCEP85L. CircCEP85L was expressed in various tissues, and the expression level in DM stage was significantly higher than that in GM stage (＜0.001). To further investigate the effect on circCEP85L scallion MuSCs. The overexpression vector p-circCEP85L was transfected with the control vector pCD5-ciR in vitro cultured yellow bovine MuSCs and the EdU results showed that overexpression of circCEP85L significantly reduced the proportion of EdU positive cells (＜0.001) after continuing the culture for 24 h. Flow cycle analysis showed that overexpression of circCEP85L increased the proportion of cells in G0/G1 phase and significantly decreased the proportion of cells in S phase (＜0.001). Flow cytometry showed that overexpression of circCEP85L significantly inhibited the apoptosis rate of MuSCs (＜0.05). qRT-PCR and western blot were used to detect the expression of proliferation and apoptosis-related genes in MuSCs, respectively. The results showed that overexpression of circCEP85L significantly reduced the mRNA expression levels of proliferation and apoptosis-related genes in bovine MuSCs (＜0.001), and the expression of apoptotic protein BAX was also significantly reduced (＜0.01). In addition, in order to detect the effect of circCEP85L overexpression on myogenic differentiation of cattle MuSCs, the differentiation medium was replaced 24 hours after transfection to induce cell differentiation. Western blot and immunofluorescence results showed that overexpression of circCEP85L significantly promoted the expression level of differentiation marker gene MyH6 (＜0.001), and the number and size of myotubes formed by cell fusion were significantly higher than those of the control group.【Conclusion】The results of this study indicate that circCEP85L affects the growth and development process of skeletal muscle in cattle by inhibiting the proliferation and apoptosis of MuSCs and promoting myogenic differentiation of cells, which is expected to be a key circRNA for subsequent mechanistic studies to regulate the growth and development process of skeletal muscle in cattle.

circCEP85L; muscle stem cells; cell proliferation; myogenic differentiation

2022-11-01；

2023-05-16

國家現代農業產業技術體系廣西創新團隊建設項目（nycytxgxcxtd-09-01）；國家重點研發計劃（2021YFD110010）、廣西自然科學基金重點項目（2021JJD130097）、巴馬縣人才科技計劃項目（202101263）

韋瑤，E-mail：1612985655@qq.com。通信作者韋英明，E-mail：dkywym@163.com。通信作者鄧彥飛，E-mail：yanfei-dun@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.18.014

（責任編輯 林鑒非）