ESBLs 及TET（X4）基因大腸埃希菌肺炎臨床特征比較

徐存來，曹卓，蔣奕薇，王欣，王馨怡

大腸埃希菌是臨床上人類常見肺炎的致病菌之一，也是攜帶超廣譜內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和四環(huán)素類黃素依賴性單加氧酶TET（X）等抗藥基因細菌中最常見的一種[1]。2019 年，有研究人員從動物樣本中分離了來自大腸埃希菌屬的TET（X）新型變異體，其編碼的蛋白與TET（X）具有93.8%的同源性，故稱TET（X4）[2]，該研究表明其位于接合轉(zhuǎn)移型的質(zhì)粒上。四環(huán)素類耐藥性可在細菌間轉(zhuǎn)移和介導，包括米諾環(huán)素和臨床使用的替加環(huán)素。其對我國肺炎患者健康造成嚴重威脅，將對替加環(huán)素的使用及臨床多重感染的治療提出嚴峻挑戰(zhàn)。所以，本研究圍繞它進行流行病學研究和臨床特點研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為前瞻性分析，納入2020 年1 月至2022 年12 月在麗水市人民醫(yī)院住院且肺泡灌洗液經(jīng)細菌培養(yǎng)和mNGS 法測出含有ESBLs 或TET（X4）耐藥基因的大腸埃希菌的肺炎患者。排除標準：（1）3 份肺泡灌洗液經(jīng)細菌培養(yǎng)均未培養(yǎng)和鑒定出大腸埃希菌；（2）另在入組過程中mNGS 法初篩發(fā)現(xiàn)3 例ESBLs（+）TET（X4）（+）大腸埃希菌肺炎患者，因樣本量太少不具有可比性，故本研究予以排除。A 組為ESBLs（+）TET（X4）（－）大腸埃希菌肺炎患者mNGS 法初篩150 例，排除15 例，入組135例。B 組為ESBLs（－）TET（X4）（+）大腸埃希菌肺炎患者入組初篩100 例，排除18 例，入組82 例。收集患者一般資料、基礎(chǔ)疾病及用藥情況，并在患者出院后隨訪30 d。本研究經(jīng)麗水市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 在本院支氣管鏡室使用奧林巴斯290 電子纖維支氣管鏡經(jīng)過虛擬導航系統(tǒng)指引下在肺炎病變區(qū)域進行4 次肺泡盥洗術(shù)，第一次留取肺泡灌洗液送mNGS，另再次盥洗3 次肺泡灌洗液送普通細菌培養(yǎng)。樣本至少需要采集5 ml，在接受檢測前都保存在液氮中。

1.2.2 mNGS 法檢測 采用杭州杰毅公司基于Illumina測序平臺和建庫技術(shù)，采用Q-mNGS定量宏基因組檢測對核酸進行高通量測序，利用生物信息學進行比對。具體序列：TET（X4）-F：5’-AATGGAAACCGGCTAATGGC-3’；TET（X4）-R：5’-TGTCGCTAACCCTACAAAAGATG-3’。ESBLs（+）-F：5’-ATAGGTCACCAGAACCAGCG-3’；ESBLs（+）-R：5’-G TTGGTGACGTGGCTCAAAG-3’。大腸埃希菌在種水平上檢出的序列數(shù)是其他所有同類病原體的十倍判定為陽性。1.2.3 菌種鑒定及藥敏試驗 菌種鑒定采用IVDMALDIBIOTYPER 2.3 飛行質(zhì)譜儀，藥物敏感性試驗：使用VITEK2-TechnologyAST-GN13 藥物敏感性卡，若3 次送檢有至少1 次肺泡灌洗液細菌培養(yǎng)或菌種鑒定大腸埃希菌則判定為有效。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料采用檢驗。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 A 組與B 組臨床特征及預后比較 B 組從事農(nóng)林畜牧業(yè)、長期使用塑料制品、四環(huán)素及30 d死亡率均高于A 組（均P ＜0.05），見表1。

表1 A 組與B 組臨床特征及預后比較例（%）

2.2 A 組與B 組耐藥性比較 B 組對四環(huán)素、米諾環(huán)素、替加環(huán)素的耐藥率比A 組高（均P ＜0.05），但對頭孢（頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡啶、頭孢唑林）和青霉素（阿莫西林克拉維酸鉀、氨曲南、氨芐西林、哌拉西林、哌拉西林他唑巴坦）的耐藥率較A 組低（均P ＜0.05），見表2。

表2 A 組與B 組耐藥性比較例（%）

3 討論

一項針對16 個省63 個畜牧場的4 000 份樣品調(diào)查中，TET（X4）陽性大腸桿菌的流行率為1.0%[3]，這表明TET（X4）耐藥基因已在我國養(yǎng)殖場傳播。TET（X4）替加環(huán)素耐藥基因在我國健康人群中的檢出率為4/5 845（0.07%）[3]，這說明我國社區(qū)獲得性肺炎的患者也存在替加環(huán)素耐藥的潛在風險。除此以外，新加坡的研究表明在臨床大腸埃希菌肺炎患者中TET（X4）檢出率為11/109（10.1%）[4]。替加環(huán)素在國內(nèi)外從未被批準在養(yǎng)殖場使用，其高昂的價格和相對稀缺的供應(yīng)也使得農(nóng)牧民私自使用不經(jīng)濟而且不現(xiàn)實。但既往研究卻從養(yǎng)殖場中檢測到TET（X4）大腸埃希菌[3]，這可能是由于四環(huán)素、土霉素和金霉素，因其低廉的價格和已被臨床淘汰的現(xiàn)實，在農(nóng)牧業(yè)中得到了長期廣泛使用所施加的抗生素選擇壓力所致[4]。

本研究結(jié)果顯示長期（1 個月內(nèi)）使用塑料制品進食或飲水（塑料水杯、塑料袋及塑料餐具）會增加大腸埃希菌肺炎患者攜帶TET（X4）耐藥基因的風險。一項針對河流的抗生素抗性基因檢測研究表明，四環(huán)素抗性基因TET（X4）在聚丙烯和聚乙烯塑料上可能有更多的潛在宿主[5]。盡管經(jīng)過處理，自來水中仍能檢測到四環(huán)素抗性基因TET（X4），這表明四環(huán)素抗性基因TET（X4）在自來水中持續(xù)存在[6]。聚丙烯、聚乙烯塑料制品清洗不充分或老化后產(chǎn)生裂紋，導致微生物聚集，形成生物膜，可能是四環(huán)素抗性基因TET（X4）蓄積的潛在環(huán)境，也可能是耐藥菌的生存環(huán)境，但還有待進一步研究確認。

本研究結(jié)果顯示B組從事農(nóng)林畜牧業(yè)率同樣高于A 組。四環(huán)素類是治療奶牛最常用的畜牧用消炎藥[7]，且有研究表明牛奶中可以測出四環(huán)素類殘留，而四環(huán)素抗性基因TET（X4）能在土壤中持續(xù)數(shù)月，也可以在牛場的新鮮糞便中檢測到[8]。因此，四環(huán)素抗性基因TET（X4）可能在農(nóng)牧環(huán)境或者新鮮未徹底加工消毒食物中蓄積，可能通過食物鏈和生活行為接觸進入大腸埃希菌患者體內(nèi)，從而導致人體抗藥性的出現(xiàn)。這也說明從事家林畜牧業(yè)、長期使用塑料制品對四環(huán)素類耐藥高有關(guān)，推測四環(huán)素非醫(yī)療行業(yè)有關(guān)，值得宏觀控制。

在耐藥性方面，B 組比A 組對四環(huán)素（四環(huán)素、米諾環(huán)素、替加環(huán)素）藥物的耐藥率要高。但對頭孢（頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡啶、頭孢唑林）和青霉素（阿莫西林克拉維酸鉀、氨曲南、氨芐西林、哌拉西林、哌拉西林他唑巴坦）耐藥率較A 組低（均P ＜0.05），這與文獻[9-10]報道相符。A 組對頭孢菌素類和青霉素類耐藥性高可能與抗生素濫用有關(guān)，這提示醫(yī)療機構(gòu)及藥店應(yīng)進一步嚴格控制頭孢菌素類和青霉素類藥物濫用予非細菌感染或者非敏感細菌感染，醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)注意醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生和耐藥菌感染患者接觸隔離，從而避免耐藥性傳播。B 組30d 內(nèi)死亡率高于A組，這可能與TET（X4）介導的替加環(huán)素治療失敗有關(guān)，但目前還有待前瞻性多中心大規(guī)模研究進行確認。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明徐存來：實驗操作、論文撰寫；曹卓、蔣奕薇、王欣、王馨怡：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學分析