腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、CD8、PD-L1 和CTLA-4在乳腺癌新輔助治療效果中的預(yù)測價(jià)值

蔡仕彬，江姜樂，劉鵬鵬，周毅，鄭琎，陳述政

腫瘤微環(huán)境（TME）和鄰近免疫系統(tǒng)的相互作用決定了乳腺癌的發(fā)展轉(zhuǎn)移，其可以起到促進(jìn)或抑制腫瘤生長、侵襲的作用。既往報(bào)道腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）水平可以預(yù)測三陰性乳腺癌新輔助化療的反應(yīng)性[1]。然而TILs 可能僅提供有關(guān)免疫激活狀態(tài)的粗略信息，探索能夠進(jìn)一步改善風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的其他潛在生物標(biāo)志物具有重要意義。CD8+T淋巴細(xì)胞是TILs的主要組成部分，程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）和細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）是關(guān)鍵性的免疫抑制分子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。本研究旨在評估CD8、PD-L1、CTLA-4 聯(lián)合TILs 在人類表皮生長因子受體2（HER2）陽性或三陰性乳腺癌（TNBC）新輔助治療療效反應(yīng)的預(yù)測價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2015 年1 月至2020 年12 月在麗水市中心醫(yī)院行新輔助治療和手術(shù)治療的HER2 陽性或TNBC 乳腺癌患者43 例，均為女性，穿刺病理確診為浸潤性導(dǎo)管癌。排除Ⅳ期乳腺癌、炎性乳腺癌和妊娠相關(guān)性乳腺癌。所有患者均接受表柔比星聯(lián)合環(huán)磷酰胺4 周期序貫多西他賽4 周期（EC-T）或多西他賽聯(lián)合卡鉑6 周期（TCb）方案新輔助化療，HER2 陽性患者接受曲妥珠單抗（H）或曲妥珠單抗聯(lián)合帕妥珠單抗（H+P）新輔助靶向治療。根據(jù)Miller&Payne（MP）分級評估系統(tǒng)評估乳房原發(fā)灶的新輔助治療療效，乳房病理完全緩解（bpCR）的定義是乳房腫瘤未見浸潤性癌成分，即MP 分級為5 級。NAC 治療后，所有患者均接受外科手術(shù)。收集患者治療記錄，包括臨床病理信息、治療和隨訪結(jié)果。本研究經(jīng)麗水市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CD8、PD-L1 及CTLA-4 表達(dá)檢測應(yīng)用免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測CD8、PD-L1、CTLA-4在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)。常規(guī)石蠟包埋組織，4m 切片，經(jīng)脫蠟、水合、抗原修復(fù)、連續(xù)封閉后，將切片與一抗單克隆抗體一起4 ℃孵育過夜?？笴D8 單克隆抗體購自安必平（MRQ-39，IHC-RO24），抗PD-L1 單克隆購自Abcam（ab205921，28-8），抗CTLA-4 單克隆抗體購自Santa Cruz Bio（sc-376016，F(xiàn)-8）。第2 天經(jīng)常規(guī)沖洗后與二抗抗體（Dako，K5007）37 ℃孵育30 min，DAB 顯色。最后，用蘇木精復(fù)染，脫水并封片保存。

1.2.2 TILs、CD8、PD-L1 及CTLA-4 表達(dá)的結(jié)果判讀 根據(jù)國際腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）工作組推薦評估方法[2]，以半定量連續(xù)變量評分的方式在蘇木精-伊紅染色玻片上報(bào)告TILs 占據(jù)基質(zhì)區(qū)域面積的百分比。在200 倍鏡下計(jì)數(shù)腫瘤內(nèi)CD8+免疫細(xì)胞的數(shù)量，不包括腫瘤邊界的免疫細(xì)胞。應(yīng)用ROC 曲線法計(jì)算TILs 和CD8+表達(dá)的截?cái)嘀怠Ｄ[瘤細(xì)胞膜染色或免疫細(xì)胞有顆粒狀細(xì)胞質(zhì)或膜染色被視為PDL1 陽性。PD-L1（CPS）定義為PD-L1 陽性腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的數(shù)量總和相對于所有重要腫瘤細(xì)胞數(shù)量的比值。CTLA-4 膜染色細(xì)胞被視為CTLA-4 陽性。CTLA-4 定義為CTLA-4陽性腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞占全部腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的百分比；所有病理及免疫組化均由兩名資深病理科醫(yī)師評估。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用檢驗(yàn)或校正檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 43 例乳腺癌患者的臨床病理特征 43 例乳腺癌患者年齡25～67歲，中位年齡51.9歲，其中HER2陽性乳腺癌占72.1%，TNBC 占27.9%。經(jīng)6 ～8 個(gè)療程新輔助治療，44.2%的患者達(dá)到bpCR，見表1。TILs 的截?cái)嘀禐?7%，TILs≥57%確定為TILs 高表達(dá)，TILs ＜57%確定為TILs 低表達(dá)。CD8 表達(dá)的截?cái)嘀禐?63，CD8≥163 確定為CD8 高表達(dá)，CD8＜163 確定為CD8 低表達(dá)。PD-L1（CPS）≥1 確定為高表達(dá)，PD-L1（CPS）=0 確定為低表達(dá)。CTLA-4≥1%確定為高表達(dá)，CTLA-4=0 確定為低表達(dá)。TILs、CD8、PD-L1、CTLA-4表達(dá)高低結(jié)果見圖1。2.2 不同免疫標(biāo)志物與乳房bpCR的關(guān)系 CD8 高表達(dá)組與低表達(dá)組、PD-L1 高表達(dá)組與低表達(dá)組bpCR 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），TILs 和CTLA-4 高表達(dá)組與低表達(dá)組bpCR 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05），見表2。

圖1 不同免疫標(biāo)志物的表達(dá)情況

表1 43 例接受新輔助治療的乳腺癌患者臨床病理特征

表2 不同免疫標(biāo)志物在pCR 與non-pCR 中的表達(dá)差異 例（%）

CD8 高表達(dá)T 細(xì)胞在HER2 陽性乳腺癌中占61.3%（19/31），而在TNBC 中占75.0%（9/12）。PDL1高表達(dá)在HER2 陽性乳腺癌中占25.6%（8/31），在TNBC 中占75.0%（9/12）。在HER2 陽性乳腺癌中，5例CD8 高表達(dá)且PD-L1 高表達(dá)的乳腺癌患者經(jīng)新輔助治療后MP分級均為5 級，全部獲得乳房病理完全緩解。而在TNBC 中，僅50.0%（4/8）CD8 高表達(dá)且PD-L1 高表達(dá)患者的新輔助治療療效評估為MP 分級5 級，見圖2。

圖2 不同免疫標(biāo)志物表達(dá)強(qiáng)度與乳房病理緩解MP 分級的相關(guān)性

3 討論

腫瘤學(xué)家Schreiber 于2002 年提出了腫瘤免疫編輯學(xué)說[3]。癌細(xì)胞可以重塑免疫細(xì)胞的生物學(xué)特性，逃脫免疫監(jiān)視，使得腫瘤細(xì)胞逃逸并發(fā)生轉(zhuǎn)移。在乳腺腫瘤微環(huán)境中，各種免疫細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞）浸潤到腫瘤基質(zhì)中。高水平的TILs 和CD8+TILs可以預(yù)測乳腺癌新輔助化療反應(yīng)，尤其在HER2 陽性和TNBC中，與較好的臨床預(yù)后相關(guān)[1，4-6]；相反，在激素受體陽性、HER2 陰性乳腺癌中TILs 是不良的生存預(yù)后因素[1]。Kaewkangsadan 等[7]應(yīng)用免疫組化評估33 例局部晚期乳腺癌新輔助化療前后腫瘤免疫細(xì)胞和免疫分子的表達(dá)水平，研究發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)和間質(zhì)TILs、CD4+、CD8+高表達(dá)均與bpCR 相關(guān)。TNBC 新輔助化療后殘留腫瘤組織中較高的TILs與無復(fù)發(fā)生存和總生存改善顯著相關(guān)[8]。本研究中，TILs 高表達(dá)組bpCR 率亦高于低表達(dá)組，但是由于本研究病例數(shù)較少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。CD8 高表達(dá)患者新輔助治療的bpCR率高于CD8 低表達(dá)組，這表明CD8+TILs亞群可以作為乳腺癌新輔助治療療效的潛在預(yù)測指標(biāo)，尤其是在HER2 陽性乳腺癌中，CD8+TILs 與NAC 后的病理反應(yīng)級別存在相關(guān)性。

乳腺癌中PD-L1 的表達(dá)水平與腫瘤大小、腫瘤高分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER 陰性、PR 陰性、HER2 陽性等不良預(yù)后相關(guān)的臨床病理因素普遍相關(guān)，然而其與預(yù)后的關(guān)系卻在不同的研究中有所差異[9-10]。Wimberly 等[11]提出PD-L1 表達(dá)和TILs 能共同預(yù)測新輔助化療的治療反應(yīng)。Abdelrahman 等[9]研究了50 例接受新輔助化療的早期（T1、T2）TNBC 患者腫瘤免疫微環(huán)境與臨床病理反應(yīng)的相關(guān)性，結(jié)果顯示pCR 與高表達(dá)TILs、缺失Foxp3+和PD-L1 相關(guān)（均P＜0.05）。另有研究發(fā)現(xiàn)新輔助化療后未達(dá)到bpCR的TNBC 患者殘留腫瘤組織中PD-L1 表達(dá)升高[10]。在本研究中，PD-L1 高表達(dá)組和低表達(dá)組經(jīng)新輔助化療后bpCR 率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。在HER2 陽性乳腺癌中，CD8 高表達(dá)且PD-L1 高表達(dá)的乳腺癌患者經(jīng)新輔助治療后更易獲得bpCR，而在TNBC 中CD8 高表達(dá)或PD-L1 高表達(dá)與新輔助治療療效無明顯相關(guān)性。

綜上所述，乳腺癌患者的免疫狀態(tài)可以預(yù)測新輔助治療療效，CD8 高表達(dá)且PD-L1 高表達(dá)的乳腺癌患者經(jīng)新輔助治療后更易獲得bpCR。因此，對乳腺癌患者免疫微環(huán)境進(jìn)行更深入的研究將有助于改善乳腺癌生存。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明蔡仕彬：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫；江姜樂、劉鵬鵬、周毅、鄭琎：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；陳述政：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持