渥堆發酵過程中藏茶化學成分的變化

鄧俊琳 何揚航 陳 建 劉 剛 夏 陳

(1. 四川省農業科學院農產品加工研究所,四川 成都 610066;2. 四川師范大學生命科學學院,四川 成都 610066)

藏茶是典型的黑茶產品,富含多酚、多糖、微量元素、茶堿、茶褐素等活性成分[1],具有抗氧化、降血脂和降血糖等功效[2-3]。

黑茶的品質形成主要在渥堆發酵過程中,該過程中在自身濕熱作用、微生物的酶促作用以及微生物呼吸代謝產生的熱量等的協同作用下,茶葉發生了復雜的生物化學變化,最終形成了黑茶特有的品質特征[4-5]。四川藏茶使用的黑毛茶原料是小葉或者中葉綠茶,生產工藝在傳統黑茶發酵工藝的基礎上大幅改進,這些改進使藏茶在風味、品質等方面與其他黑茶有較大差異性,但渥堆發酵始終是藏茶生產的核心工序。目前關于藏茶的研究大多集中在成品茶中活性成分鑒定與功能的研究,對渥堆發酵過程中活性成分的變化還鮮有報道。研究擬對渥堆過程中藏茶水提物中可溶性固形物、可溶性糖、總多酚、總黃酮含量及水提物體外抗氧化活性進行測定,并研究水提物中茶堿、咖啡堿、沒食子酸和8種兒茶素類單體、茶黃素、茶紅素和茶褐素含量變化,以期闡明藏茶渥堆過程中主要化學成分的變化規律,以及探討其對藏茶品質形成的可能影響,將有助于改進藏茶渥堆發酵工藝并控制藏茶品質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藏茶:特級金花藏茶(302型黑毛茶特制),雅安市雅州恒泰茶業有限責任公司。

1.2 試劑與儀器

福林酚試劑、沒食子酸、蘆丁:分析純,上海研生生化試劑有限公司;

Trolox:上海陶術生物科技有限公司;

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)標準品:純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司;

沒食子酸(GA)、沒食子兒茶素(GC)、兒茶素(C)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、兒茶素沒食子酸酯(CG)標準品:純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;

咖啡堿(Caffeine)標準品:純度≥98%,成都普菲德生物技術有限公司;

多功能酶標儀:3000FA型,上海閃譜生物科技有限公司;

高效液相色譜儀:1290型,美國Agilent公司;

優普系列超純水機:UPC-1-10T型,成都超純科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶葉取樣 2020年4至8月,在金花藏茶發酵過程中選取7個關鍵節點采樣:初制黑毛茶(MC),渥堆發酵第1次翻堆7 d(S1),第2次翻堆14 d(S2),第3次翻堆23 d(S3),第4次翻堆31 d(S4),第5次翻堆45 d(S5),干燥后的金花藏茶成品(S6)。每次在茶堆翻堆補水前取樣,取茶堆上層、中層以及底層的由外到內30～50 cm處茶葉,每層3個點各取200 g混勻成為一個樣品,所有樣品封裝于無菌袋用冰盒帶回實驗室,凍藏于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 藏茶水提物制備 樣品經60 ℃烘干、粉碎過80目篩,稱取一定量粉末80 ℃水提2 h,過濾定容,待測。

1.3.3 藏茶水提物成分檢測

(1) 可溶性糖含量:按照GB/T 8305—2013方法測定水浸出物含量,采用蒽酮—硫酸法測定可溶性糖含量[6],待測液加入6 mL硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮0.1 g,加硫酸100 mL溶解,搖勻),立即搖勻,放置15 min,立即置冰浴中冷卻15 min,于625 nm處測定吸光值,以葡萄糖含量(mg/g)為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,y=0.038 1x+0.066 1,R2=0.997 8,線性范圍0.81～52.125 mg/g。

(2) 總多酚含量:采用福林酚法[7],20 μL待測液中加入20 μL福林酚試劑,混勻靜置5 min,加入80 μL 10% Na2CO3溶液,室溫避光反應60 min,于765 nm處測吸光值。以沒食子酸溶液的質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線。沒食子酸線性回歸方程為y=0.006 6x+0.057 5,R2=0.999 9,線性范圍3.906～500 μg/mL。

(3) 總黃酮含量:采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[8],20 μL待測液中加入10 μL 25 mg/100 mL NaNO2反應6 min,再加入10 μL 10% AlCl3反應5 min,加入30 μL 1 mol/L NaOH,再加入100 μL蒸餾水,于510 nm處測吸光值,以蘆丁溶液的質量濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線,蘆丁線性回歸方程為y=0.000 8x+0.043 4,R2=0.999,線性范圍0.057～0.387 μg/mL。

(4) DPPH自由基清除測定:參照文獻[9]將水提物稀釋成不同濃度梯度,加入等體積0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液,室溫靜置30 min后于517 nm測吸光值,按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中:

C——自由基清除率,%;

A0——空白對照組OD值;

A1——樣品組OD值。

(5) ABTS自由基清除測定:取不同濃度梯度的待測液,加入適量ABTS溶液(K2S2O8溶液和ABTS溶液混合配制,混合液中K2S2O8濃度為2.45 mmol/L,ABTS濃度為7 mmol/L,混合液室溫下避光放置16 h,再用pH 7.0的PBS緩沖液稀釋至734 nm處吸光值為0.7±0.02備用),避光反應6 min于734 nm處測定吸光值,按式(1)計算ABTS自由基清除率。

1.3.4 兒茶素單體、茶堿和咖啡堿測定 采用超高效液相色譜法[10]。茶堿、咖啡堿、沒食子酸與8個兒茶素單體的標準品20 mg,分別用甲醇溶解并定容至5 mL作為標準品母液,以二倍稀釋法制備不同濃度梯度標準品溶液,以質量濃度(μg/mL)為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線,得線性方程如表1所示。

表1 茶堿、咖啡堿、兒茶素等的測定標準曲線

1.3.5 茶色素含量測定 根據Wang等[11]的方法,修改如下:取3 g茶葉于125 mL錐形瓶中,加入125 mL沸水,搖勻,沸水浴10 min(水浴期間搖瓶一次),取出搖勻,趁熱過濾(殘渣不水洗),濾液冷卻至室溫。取50 mL濾液于250 mL分液漏斗,加入50 mL乙酸乙酯,震蕩5 min,靜置分層,收集乙酸乙酯層置于100 mL具塞錐形瓶。取4 mL乙酸乙酯萃取液,加入95%乙醇定容至25 mL,得溶液A;25 mL乙酸乙酯萃取液于100 mL漏斗,加入25 mL 2.5% Na2CO3溶液,迅速振蕩30 s靜置分層,取4 mL乙酸乙酯層加入95%乙醇定容至25 mL,得溶液C;取2 mL水層萃取液,加入2 mL飽和草酸溶液,再加入6 mL超純水,用95%乙醇定容至25 mL,得溶液D;取第一步冷卻濾液25 mL于100 mL分液漏斗,加入25 mL正丁醇,振蕩3 min,靜置分層,取2 mL水層液加入2 mL飽和草酸溶液,加入6 mL超純水,95%乙醇定容至25 mL,得溶液B。用1 cm比色皿,分光光度計380 nm處,以95%乙醇為空白對照,測定A、B、C、D溶液的吸光度。分別按式(2)～式(4)計算茶黃素、茶褐素和茶紅素含量。

(2)

(3)

(4)

式中:

CTFs、CTBs、CTRs——茶黃素、茶褐素、茶紅素含量,%;

M——茶葉干物率,%;

EA、EB、EC、ED——溶液A、B、C、D在380 nm處的吸光值。

1.4 數據分析

使用SPSS 26.0軟件進行方差分析、Student-Newman-Keuls (SNK) 法進行多重比較,P<0.05表示差異性顯著,P<0.01表示差異性極顯著。采用Origin 2021軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中藏茶主要可溶性物質的變化

茶葉水浸出物包括了酚類、茶多糖、氨基酸等水溶性物質,其相對含量對發酵茶品質具有決定性作用。由圖1(a)可知,發酵過程中,可溶性固形物含量波動變化較大。黑毛茶的可溶性固形物含量最高達到39.4%,隨著發酵時間推移,可溶性固形物含量逐漸降低,到S4階段達到最低,為14.7%。在S5～S6階段,可溶性固形物含量有所增加,最終的成品的可溶性固形物為23.4%,與黑毛茶比較下降了40.5%。發酵前的黑毛茶樣品MC總糖含量為10.09%,在S1階段無明顯下降。S6階段藏茶總糖含量為5.64%,與S5階段相比較,該階段下降幅度最大。發酵結束后,藏茶可溶性總糖含量下降了44.1%。如圖1(b)所示,隨著發酵時間的增加,藏茶中總多酚和總黃酮含量逐漸下降。黑毛茶樣品總多酚含量為77.82 mg/g,藏茶成品的總酚含量為22.91 mg/g;黑毛茶樣品黃酮含量為70.80 mg/g,發酵結束后為21.80 mg/g。藏茶制作工藝包括九制三渥堆,在發酵過程中茶中可溶性固形物、可溶性糖、總多酚、總黃酮含量整體呈下降趨勢,可能是由于發酵過程中,茶葉中多糖等大分子物質被微生物分解,而小分子化合物又在酶催化、高溫高濕等環境下進行美拉德等反應,經過聚合、偶聯等復雜的反應,生成發酵茶重要的活性物質茶褐素等[12-13],也正因為這些復雜的變化,黑茶與綠茶在化學成分、口感、風味以及功效方面有巨大差異[14]。

同一指標字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

2.2 發酵過程中藏茶體外抗氧化活性的變化

由圖2可知,隨著發酵時間的增加,藏茶水提物清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力均持續下降,與圖1(b)中總多酚和總黃酮的變化趨勢一致。此外,藏茶發酵前DPPH自由基清除能力為83.09%,發酵結束后為42%;藏茶黑毛茶的ABTS自由基清除能力為93.08%,發酵結束后為59.58%。隨著發酵時間的增加,體外抗氧化活性也隨之下降,可能是受到發酵過程中多酚類化合物減少的影響。植物多酚作為植物體內復雜的次生代謝物,廣泛分布于植物界中,其結構含有大量的酚羥基,因其具有酚類游離基中間體的共振非定域作用和沒有適合分子氧進攻的位置,不會引起新的游離基或者因連鎖反應而被迅速氧化因此具有抗氧化作用[15]。有研究[16]表明,植物的抗氧化活性與其所含多酚、黃酮類物質緊密相關。

同一指標字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

2.3 發酵過程中藏茶咖啡堿、茶堿、兒茶素等物質含量的變化

由表2可知,藏茶發酵過程中咖啡堿和CG含量呈波動狀態,且變化較小;茶堿、GA、C含量先上升再略有下降,最后回升;EC與GCG含量先上升后下降;GC、EGC、EGCG、ECG含量呈持續下降的趨勢,且在黑毛茶中的含量遠高于成品黑茶。在藏茶成品中,兒茶素單體含量從高到低依次為EGC、EGCG、C、GC、GCG、ECG、CG、EC。根據環上的羥基是否與沒食子酸形成酯鍵,可將兒茶素類分為醋型兒茶素類CG、ECG、GCG、EGCG,和非醋型兒茶素類C、EC、GC、EGC[17],其中以EGCG含量最高(占兒茶素80%)、抗氧化作用最強,EGCG屬非酶抗氧化劑,其抗氧化活性是維生素E的20倍、過氧化歧化酶的6倍[18]。王增盛等[4]認為,在黑茶發酵過程中,酯型兒茶素水解為非酯型兒茶素,更多的是沒食子兒茶素(GC)類的氧化、聚合而使茶多酚含量降低。試驗中,除了GC含量下降明顯外,還有EGC、EGCG、ECG含量均呈持續下降的狀態,且在黑毛茶中的含量遠高于成品黑茶。茶多酚含量下降的原因一般可以歸納為兩個方面:① 非酶促氧化反應,包括化合和酯化反應,即茶多酚與蛋白質結合生成水不溶性物質[19],以及茶多酚與有機酸反應生成脂類物質[20];② 茶多酚的酶促反應,酶源包括茶葉本身殘留的內源酶[21],以及渥堆過程中微生物繁殖而產生的具有相當活力的多酚氧化酶同工酶[22],茶多酚在酶的作用下,向醌、茶黃素、茶紅素、茶褐素的方向轉化,形成黑茶湯色紅褐的特點[23]。

表2 發酵過程中藏茶茶堿、咖啡堿、兒茶素等含量的變化?

2.4 發酵過程中藏茶茶色素的變化

用酶聯免疫法測定藏茶發酵過程中的茶紅素、茶黃素、茶褐素含量,結果如表2所示。茶黃素、茶紅素、茶褐素被認為是形成黑茶滋味及茶湯色澤的重要物質,其中茶褐素還被認為是黑茶中重要的功能物質,具有降血脂、清除自由基等功效[24-25]。由圖3可知,茶紅素隨著發酵程度增加,含量先升高后下降,S4階段含量最低;茶黃素在整個發酵階段中含量變化很小,僅在成品茶中含量顯著降低;茶褐素隨著發酵程度增加,其含量逐漸升高。蕭力爭[26]也得到了類似結果。發酵過程中,酯型兒茶素在濕熱條件下水解形成簡單兒茶素和沒食子酸等,多酚氧化酶又將以兒茶素為代表的多酚類物質氧化為鄰醌,鄰醌類進一步氧化聚合形成茶黃素、茶紅素,茶黃素、茶紅素與其他物質通過氧化、聚合、耦合作用形成茶褐素[27-28]。

同一指標字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

3 結論

隨著發酵程度增加,藏茶水提物中可溶性糖、總多酚、總黃酮含量逐漸降低,抗氧化活性逐漸減弱,咖啡堿和茶堿含量變化較小,沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯含量下降顯著,茶褐素含量顯著升高。在成品藏茶中,兒茶素單體含量從高到低依次為表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素、沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素。

黑茶制作流程復雜,尤其因地域、氣候等的不同,演變出多種發酵工藝及具有地域特色的黑茶。該試驗對藏茶渥堆發酵過程中部分重要成分進行了研究,后續將進行更加全面的藏茶發酵及其活性成分的研究。