基于dsDNA-CuNCs的熒光ELISA檢測牛奶中的E. coli O157:H7

曹文凱山 珊劉道峰彭 娟邢克宇賴衛華

(1. 南昌大學食品學院,江西 南昌 330047;2. 江西師范大學生命科學學院,江西 南昌 330022;3. 江西省疾病預防控制中心,江西 南昌 330029;4. 江西省食源性疾病診斷溯源重點實驗室,江西 南昌 330029;5. 長沙理工大學食品科學與生物工程學院,湖南 長沙 410114)

E.coliO157:H7是一種常見食源性致病菌,它可以通過被污染的食物來傳染人類,如未煮熟的肉制品、生牛奶等[1]。感染E.coliO157:H7后可能會出現腹痛和腹瀉等癥狀,嚴重時會導致腎衰竭甚至死亡。

目前,用于檢測食源性致病菌的方法(例如,平板培養、菌落計數法、Lamp和PCR等),存在既費力又費時的問題。近年來,研究者已經開發了多種快速、靈敏和可靠的方法來檢測E.coliO157:H7。免疫分析技術如酶聯免疫吸附[9]、化學發光免疫分析[10]和免疫層析等具有快速、靈敏度高和特異強等優勢,在食源性致病菌檢測中發揮著重要作用。其中酶聯免疫吸附技術(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種基于抗原和抗體特異性反應的分析技術,現已被廣泛地應用于E.coliO157:H7的快速檢測。在傳統的ELISA中,通常采用辣根過氧化物酶催化顯色底物3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)作為信號輸出,存在靈敏度相對較低的問題,嚴重妨礙了ELISA在實際檢測中的應用。高信號的熒光與ELISA結合起來,可以解決ELISA靈敏度較低的問題。

銅納米團簇(Copper nanocluster,CuNCs)因其獨特的超小尺寸和較寬的斯托克斯位移,與傳統熒光探針相比,具有更優越的熒光特性,在生物傳感和生物示蹤等領域具有廣闊的應用前景。其中以腺嘌呤—胸腺嘧啶雙鏈DNA(Adenine-thymine double stranded DNA,AT dsDNA)為模板合成的CuNCs,具有合成簡單、熒光強度高和尺寸可調等優勢。在抗壞血酸的作用下Cu2+會在AT dsDNA模板上被還原成Cu0+形成CuNCs,在特定的激發波長下,能夠產生穩定的熒光信號[16]。而焦磷酸鹽(Pyrophosphate,PPi)對Cu2+的強配位作用將抑制Cu2+的還原,從而抑制熒光信號的產生。PPi是公認的堿性磷酸酶的天然底物,當其被堿性磷酸酶水解成磷酸鹽(Phosphate,Pi)后,Cu2+會從PPi-Cu2+-PPi配位復合物中釋放出來,被抗壞血酸在模板DNA上還原成Cu0+[19],形成CuNCs。

研究擬通過堿性磷酸酶水解PPi釋放Cu2+,在抗壞血酸的作用下Cu2+在AT dsDNA模板上被還原成Cu0+,形成CuNCs。以具有較強熒光信號的CuNCs作為熒光信號探針,建立一種新型的熒光ELISA,用于檢測低脂牛奶和脫脂牛奶樣本中的E.coliO157:H7。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

低脂牛奶、脫脂牛奶:市售;

含20,30,40,50,60,70個堿基的AT dsDNA(AT20、AT30、AT40、AT50、AT60和AT70):生工生物工程股份有限公司;

焦磷酸鹽(Pyrophosphate,PPi)、CuSO4·5H2O和抗壞血酸(Ascorbic acid):分析純,阿拉丁生物試劑股份有限公司;

牛血清白蛋白(BSA):純度≥98%,美國Sigma-Aldrich公司;

3-嗎啉丙磺酸(MOPS)、PBS、(3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺)TMB顯色液和堿性磷酸酶:阿拉丁生物試劑股份有限公司;

其他試劑:分析純,市售;

E.coliO157:H7鼠源單抗(Monoclonal antibody,mAb)、E.coliO157:H7兔源多抗(Polyclonal antibody,pAb)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體(HRP-IgG)和堿性磷酸酶標記的山羊抗鼠IgG抗體(ALP-IgG):邁迪胺生物科技有限公司;

黑色96孔酶標板:康寧有限公司;

菌種:大腸桿菌 O157:H7(ATCC 43888)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 18S51)、豬霍亂沙門氏菌(ATCC 10708)、鴨沙門氏菌(ATCC 9270)、腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)、單核增生李斯特菌(ATCC 13932)、蠟樣芽孢桿菌(CICC 21493)、福氏志賀氏菌(CMCC 2457)、大腸桿菌 O157:H7 (SR0981D)、大腸桿菌(ATCC 25922):江西省疾病預防控制中心。

1.2 主要儀器

酶標儀:SpectraMax i3x型,美谷分子儀器(上海)有限公司;

透射電鏡:JEM 2100 F型,捷歐路(北京)科貿有限公司;

恒溫培養箱:GZX-9246MBE型,上海?，攲嶒炘O備有限公司;

分析天平:FA1024型,梅特勒托利多科技(中國)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPi-Cu2+-PPi復合物制備 將50 nmol的Cu2+和90 nmol的PPi加入到130 μL含有80 nmol的AT50的MOPS緩沖溶液(20 mmol/L,MOPS,pH 7.6)中混合均勻,室溫下避光孵育30 min,得到PPi-Cu2+-PPi復合物。

1.3.2 熒光ELISA的操作步驟 用碳酸鹽緩沖液(0.2 mg/mL,pH 9.6)稀釋的pAb(10 μg/mL,100 μL)作為捕獲抗體包被酶標板,在4 ℃條件下過夜包被,用PBST(按0.05 mL/100 mL將吐溫20加入到0.02 mg/mL的1×PBS中)洗板4次后拍干,然后加入230 μL的封閉劑(3 mg/100 mL BSA),在恒溫培養箱中37 ℃條件下封閉2 h,用PBST洗板后備用。

檢測時將100 μL的E.coliO157:H7菌液加入酶標板,并設置陰性對照(1×PBS,100 μL),在37 ℃條件下孵育1 h后用PBST洗板;然后將mAb(10 μg/mL,100 μL)作為檢測抗體加入酶標板,在37 ℃條件下孵育30 min后用PBST洗板;將酶標二抗ALP-IgG(3萬倍稀釋,100 μL)加入酶標板,在37 ℃條件下孵育30 min后用PBST洗板;再加入190 μL的PPi-Cu2+-PPi復合物,37 ℃條件下孵育60 min,最后加入10 μL,10 mmol/L的抗壞血酸用酶標儀讀取在365 nm激發下610 nm處的熒光值。

1.3.3 關鍵參數優化 試驗參數:Cu2+濃度、PPi濃度、DNA模板濃度、DNA模板長度和抗壞血酸濃度,采用單一變量的原則,對各個參數進行優化。除1.3.3(1)外均在1×106CFU/mL的E.coliO157:H7、1 μg的mAb、1 μg的pAb和3萬稀釋的ALP-IgG情況下進行。

(1) Cu2+濃度優化:由于Cu2+是影響PPi-Cu2+-PPi復合物以及產生CuNCs的關鍵因素,因此在緩沖溶液(1×PBS,pH 7.6)中對其濃度進行優化。在20 μL的AT40(1 mmol/L)、20 μL不同濃度的Cu2+(1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0 mmol/L)、20 μL的PPi(5 mmol/L)和10 μL的抗壞血酸(10 mmol/L)以及130 μL的MOPS體系下,37 ℃反應30 min,考察不同濃度Cu2+所形成的PPi-Cu2+-PPi復合物對熒光強度的影響。

(2) PPi濃度的優化:在20 μL的AT40(1 mmol/L),20 μL的Cu2+(2.5 mmol/L)、20 μL不同濃度的PPi(3.5,4.0,4.5,5.0,5.5 mmol/L)和10 μL的抗壞血酸(10 mmol/L)以及130 μL的MOPS體系下,37 ℃反應30 min,通過信噪比F/F0(F:陽性熒光信號值,F0:陰性熒光信號值)來考察不同濃度PPi所形成的PPi-Cu2+-PPi復合物對熒光強度的影響。

(3) DNA模板長度的優化:在20 μL 4 mmol/L不同長度的DNA模板(AT20、AT30、AT40、AT50、AT60)、20 μL 的Cu2+(2.5 mmol/L)、20 μL的PPi(4.5 mmol/L)和10 μL的抗壞血酸(10 mmol/L)以及130 μL的MOPS體系下,37 ℃反應30 min,通過信噪比F/F0考察DNA模板長度對熒光強度的影響。

(4) DNA模板濃度的優化:在20 μL不同濃度的AT50(0.5,1.0,2.0,4.0,8.0 mmol/L)、20 μL的Cu2+(2.5 mmol/L)、20 μL的PPi(4.5 mmol/L)和10 μL的抗壞血酸(10 mmol/L)以及130 μL的MOPS體系下,37 ℃反應30 min,通過信噪比F/F0考察DNA模板濃度對熒光強度的影響。

(5) 抗壞血酸濃度的優化:在20 μL的AT50(4 mmol/L)、20 μL的Cu2+(2.5 mmol/L)、20 μL的PPi(4.5 mmol/L)和10 μL不同濃度的抗壞血酸(6,8,10,12,14 mmol/L)以及130 μL的MOPS體系下,37 ℃反應30 min,通過信噪比F/F0考察抗壞血酸濃度對熒光強度的影響。

1.3.4 熒光ELISA檢測E.coliO157:H7 在1.2.3的最優條件下,將100 μL不同稀釋倍數下的E.coliO157:H7(菌數為1×102,5×102,1×103,5×103,1×104,5×104,1×105,5×105,1×106,5×106,1×107,5×107,1×108,5×108CFU/mL),使用酶標儀測量熒光,激發波長365 nm,發射波長610 nm。

1.3.5 傳統顯色ELISA檢測E.coliO157:H7 ELISA步驟同1.3.2。加入mAb孵育并洗板后,將3 000倍稀釋的HRP-IgG,加入酶標孔孵育30 min并洗板后,加入100 μL的TMB顯色液,反應15 min后加入200 nmol的H2SO4終止液,用酶標儀讀取450 nm處的OD值。

1.3.6 熒光ELISA的特性鑒定

(2) 特異性:通過交叉反應試驗鑒定檢測方法的特異性。利用熒光ELISA法分別檢測E.coliO157:H7與相同濃度的其他菌種:大腸桿菌 O157:H7 (SR0981D)、大腸桿菌(ATCC 25922)、鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 18S51)、豬霍亂沙門氏菌(ATCC 10708)、鴨沙門氏菌(ATCC 9270)、腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)、單核增生李斯特菌(ATCC 13932)、蠟樣芽孢桿菌(CICC 21493)和福氏志賀氏菌(CMCC 2457)的熒光值對比來評估檢測E.coliO157:H7的特異性。

1.3.7 精密度和準確度 在兩種不同的牛奶樣本中添加,低中高3種倍數稀釋的E.coliO157:H7,每個水平的添加樣品利用熒光ELISA法重復檢測3次,通過計算添加E.coliO157:H7的平均回收率和變異系數(CV)來鑒定方法的精密度和準確度。

2 結果與分析

2.1 熒光ELISA檢測E. coli O157:H7的原理

試驗方法的檢測原理如圖1所示。當不存在目標菌E.coliO157:H7時,在ELISA孔中不會形成雙抗夾心結構,IgG-ALP不會結合在ELISA孔中,因此PPi-Cu2+-PPi復合物不會被水解,并阻止抗壞血酸將Cu2+在dsDNA鏈上還原成Cu0+形成CuNCs。當存在目標菌E.coliO157:H7時,IgG-ALP會通過雙抗夾心結構結合到ELISA孔中來水解PPi-Cu2+-PPi復合物,釋放出的Cu2+會被抗壞血酸在dsDNA上還原成Cu0+形成CuNCs,產生熒光信號。試驗通過測定熒光強度的變化來判斷PPi-Cu2+-PPi是否會水解并產生熒光信號,設計了一種熒光ELISA來檢測E.coliO157:H7。

圖1 基于dsDNA-CuNCs的熒光ELISA 檢測E. coli O157:H7原理

2.2 用ALP水解PPi恢復CuNCs用于檢測的可行性分析

為了檢驗該ELISA用于檢測E.coliO157:H7的可行性,即ALP能否催化水解PPi并恢復CuNCs熒光,測定了ALP存在與不存在時的熒光值。如圖2(a)所示,當在PPi-Cu2+-PPi復合體系中存在ALP(2 μL,10 U)時,會產生較強的熒光信號,如圖2(b)所示,形成的CuNCs的粒徑為5 nm。當不存在ALP時,幾乎沒有熒光信號,以上結果表明,PPi的存在會阻礙CuNCs熒光的形成,并且通過ALP來水解PPi恢復CuNCs熒光用于檢測E.coliO157:H7是可行的。

圖2 存在ALP和不存在ALP時的熒光強度和投射電鏡圖

2.3 試驗條件優化

2.3.1 Cu2+濃度優化 根據檢測原理,Cu2+是橋接ELISA以及CuNCs熒光信號形成的關鍵因素。因此,在緩沖溶液中,考察了Cu2+對CuNCs熒光信號的影響。如圖3所示,不存在PPi時,熒光信號會隨著Cu2+濃度的增加而升高,當Cu2+濃度達到3.5 mmol/L時,熒光信號達到最高,當Cu2+濃度達到4 mmol/L時,熒光強度降低,可能是由于高濃度的Cu2+在抗壞血酸的作用下,會生成氧自由基來降解dsDNA模板,導致熒光強度降低。存在PPi時,隨著Cu2+濃度的增加,熒光信號隨之升高的原因是盡管一部分的Cu2+會與PPi配位形成PPi-Cu2+-PPi復合物,但是過剩的Cu2+仍會被抗壞血酸還原,形成CuNCs。結果表明,Cu2+的最佳濃度為2.5 mmol/L。

圖3 Cu2+濃度的優化

2.3.2 PPi濃度的優化 如圖4所示,隨著PPi濃度的增加,F/F0逐漸增加,當PPi濃度達到4.5 mmol/L時,F/F0達到最大值,當PPi濃度>4.5 mmol/L時,F/F0開始降低,可能是由于高濃度的PPi不能完全被ALP所水解,過剩的PPi通過強配位作用結合Cu2+,抑制CuNCs熒光的產生。因此,PPi的最佳濃度為4.5 mmol/L。

圖4 PPi濃度優化

2.3.3 DNA模板長度優化 如圖5(a)所示,隨著dsDNA長度的增加,F/F0逐漸增加,當dsDNA長度達到50 bp時,F/F0達到最大值,之后F/F0不再發生明顯變化。因此,dsDNA的最佳長度為AT50。

圖5 dsDNA長度和濃度的優化

2.3.4 DNA模板濃度優化 如圖5(b)所示,隨著AT50濃度的增加,F/F0逐漸增加,當dsDNA濃度達到4 mmol/L時,F/F0達到最大值,之后F/F0不再發生明顯變化。因此,AT50的最佳濃度為4 mmol/L。

2.3.5 抗壞血酸濃度優化 如圖6所示,隨著抗壞血酸濃度的增加,F/F0逐漸增加,當抗壞血酸濃度達到10 mmol/L時,F/F0達到最大值,之后F/F0開始降低,可能是高濃度的還原劑會抑制CuNCs熒光。因此,抗壞血酸的最佳濃度為10 mmol/L。

圖6 抗壞血酸濃度優化

2.4 檢測方法的性能

2.4.1 靈敏度鑒定 稀釋菌數為1×102,5×102,1×103,5×103,1×104,5×104,1×105,5×105,1×106,5×106,1×107,5×107,1×108,5×108CFU/mL的E.coliO157:H7,經熒光ELISA檢測后,以E.coliO157:H7菌數為橫坐標,檢測所得的熒光強度值為縱坐標,繪制的標準校準曲線如圖7所示,曲線的線性范圍為5×104～1×108CFU/mL,線性回歸方程為y= 2.1×107lg(x)-9×107,R2=0.980 8,最低檢出限為2.4×104CFU/mL。如圖8所示,普通的HRP催化TMB顯色ELISA的線性范圍為5×105～5×107CFU/mL,線性回歸方程為y=0.41 lg(x)-1.16,R2=0.983 4,LOD為3.36×105CFU/mL。相比而言,研究開發的熒光ELISA比傳統ELISA靈敏14倍,且檢測線性范圍更寬。

圖7 E. coli O157:H7定量分析熒光ELISA標準校準曲線

圖8 基于HRP的傳統E. coli O157:H7定量分析ELISA標準曲線

2.4.2 特異性鑒定 利用熒光ELISA法檢測菌數為5×106CFU/mL的E.coliO157:H7和其他菌株。以所測定的熒光值作為評判該方法特異性的標準。如圖9所示,只有E.coliO157:H7存在時,才會恢復CuNCs熒光,產生較高的熒光信號值。由于方法建立所使用的捕獲抗體的特異性較好,因此能夠對單一菌株識別捕獲,使檢測方法顯示出良好的特異性。

圖9 熒光ELISA的特異性

2.4.3 實際樣本分析 為探討該方法檢測食品中E.coliO157:H7的可行性,在兩種牛奶樣品中加入E.coliO157:H7進行分析,采用外標法評價了該方法的可行性。結果見表1。牛奶樣品中,3個加標水平的平均回收率在92.2%～108.5%,相對標準偏差4.9%～10.4%,表明該檢測方法準確性較好,可用于實際樣品檢測。

表1 實際樣本中E. coli O157:H7的加標回收率

3 結論

試驗利用Cu2+與焦磷酸鹽的強配位原理,設計了一種基于堿性磷酸酶水解焦磷酸鹽釋放Cu2+形成銅納米團簇的熒光酶聯免疫吸附技術,用于低脂和脫脂牛奶樣本中E.coliO157:H7的檢測。在最佳條件下,E.coliO157:H7的菌數與熒光信號值在5×104～1×108CFU/mL范圍內呈良好的線性關系,最低檢測限為2.4×104CFU/mL比傳統顯色酶聯免疫吸附技術靈敏14倍,且檢測線性范圍更寬。該方法特異性好、靈敏度高,在低脂和脫脂牛奶樣本中回收率理想(92.2%～108.5%),適用于E.coliO157:H7或其他病原微生物的靈敏檢測。