春生田頭菇粗多糖超聲輔助提取及抗氧化性測定

韓曉磊呂慧英梁玨欽范 偉劉 韜黃志群楊國舜熊 智

(1. 西南林業大學生物多樣性保護學院,云南 昆明 650224;2. 湖南省農業科學院農產品加工研究所,湖南 長沙 410125;3. 湖南農業大學食品科學技術學院,湖南 長沙 410128;4. 沅江市農業農村局,湖南 益陽 413100;5. 湖南蘆菇生物科技有限公司,湖南 益陽 413100;6. 湖南博大天能實業股份有限公司,湖南 益陽 413100)

田頭菇[Agrocybepraecox(Pers.) Fayod],又名春生田頭菇或早生田頭菇,其子實體具有良好的口感和風味,富含多種活性成分,營養價值豐富[1]。目前,關于田頭菇屬菌菇研究主要集中在酶活性成分與生態功能以及其對瓜果和綠葉作物的生長調節和品質影響的相互作用等方面[2-3]。多糖(Polysaccharides,PS)是一種存在于動物、微生物及高等植物的天然高分子碳水化合物[4],是一類分子結構復雜且龐大的糖類物質。具有活性結構的多糖有抗氧化、抗癌、降血糖和免疫調節等功能,同時具有天然、無毒、來源豐富等特點[5]。已有研究[6-8]表明,春生田頭菇中含有較豐富的多糖類物質,其在總糖含量中所占比例較高。但目前有關春生田頭菇功能活性成分和功效方面的研究較少,未見該食用菌功能活性物質提取及功效方面的研究。

多糖提取方法目前主要有水浸提法、酶法、超聲波法、微波法等,其中水浸提法操作簡便,但提取效率低、耗能較大,而超聲波或微波提取對多糖提取率具有明顯的提升,同時可以提高其生物學活性,課題組通過前期預試驗發現使用傳統的水提醇沉法進行提取時,雖然操作簡單快捷,但春生田頭菇的粗多糖提取率偏低,不利于粗多糖的進一步分離純化和后期結構解析。研究擬采用超聲輔助熱水提取春生田頭菇多糖,通過單因素試驗和響應面法優化提取工藝條件,得到最佳提取工藝參數,并對春生田頭菇多糖的體外抗氧化活性進行研究,以期為高效利用特色蘆葦食用菌資源和開發多糖功能性食品提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮春生田頭菇采摘于沅江市胭脂湖蘆葦食用菌種植基地(采摘時間為2022年4月5日),采后的樣品放入存有冰塊約為4 ℃的冷藏箱保存,在3 h內運回實驗室后轉入(4±1) ℃的低溫冷庫預冷約12 h,預冷后的菌菇在45～50 ℃條件下,熱風干燥樣品至恒重,貯藏于干燥器中備用。

1.2 試劑

3-乙基-2-亞硝基亞胺-2,3(2H)苯噻唑(ABTS):純度≥98%,上海麥克林生化科技有限公司;

1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):純度≥98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

D(+)-無水葡萄糖:純度≥98%,西隴化工股份有限公司;

L-抗壞血酸(VC):分析純,西隴化工股份有限公司;

蒽酮:分析純,北京沃凱生物科技有限公司;

氫氧化鈉、草酸、三氯乙酸、乙酸乙酯、冰乙酸、濃硫酸、磷酸、硫酸鋅、苯酚、過硫酸鉀、甲醇、無水乙醇、丙酮、對氨基苯磺酸等:分析純,國藥集團化學試劑有限公司;

試驗用水均為去離子水(RO)以及蒸餾水。

1.3 儀器

電子天平:AL-204型,梅特勒托利多科技(中國)有限公司;

小型高速粉碎機:WK-600A型,天津新諾儀器科技有限公司;

旋轉蒸發儀:R-1001VN型,鄭州長城科工貿有限公司;

紫外可見分光光度計:UV-A360型,翱藝儀器(上海)有限公司;

循環水式真空泵:SHZ-Ⅲ型,上海標和儀器有限公司;

數控超聲波儀器:KQ-500DE型,昆山市超聲儀器有限公司;

高速冷凍離心機:HR/T16M型,湖南赫西儀器裝備有限公司;

電熱恒溫鼓風干燥箱:DHG-9053A型,上海精宏實驗儀器設有限公司。

1.4 方法

1.4.1 春生田頭菇粗多糖提取工藝 將烘干至恒重的春生田頭菇樣品,用高速粉碎機粉碎成粉末后過60目篩,準確稱取8.000 0 g于三角瓶內,加入一定量的去離子水。按試驗設計的料液比、超聲提取時間、超聲提取功率放入數控超聲波儀器中進行超聲提取,超聲后在不同溫度條件下封口水浴浸提相應時間,提取結束后,全部提取內容物轉移至離心管,4 500 r/min離心10 min,收集上層清液于燒瓶中濃縮至原體積的1/3,濃縮后的溶液加入4倍體積的95%乙醇進行沉淀過夜后減壓抽濾,沉淀物依次用4倍體積的無水乙醇洗滌,重復處理至溶液無顏色。收集濾液于冷凍干燥機上,設置參數為預凍溫度-35 ℃,預凍12 h,干燥溫度45 ℃,冷凍干燥48 h。干燥后得春生田頭菇粗多糖凍干物,將凍干物加入蒸餾水溶解,定容至100 mL,即得到春生田頭菇粗多糖提取液,備用。

1.4.2 春生田頭菇粗多糖含量測定 采用蒽酮—硫酸法。

(1) 葡萄糖標準溶液配制和標準曲線測定:準確稱量葡萄糖標準品100 mg,加蒸餾水定容到100 mL,配制成質量濃度為1 mg/mL的標準葡萄糖溶液,備用。分別精密吸取葡萄糖標準溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mL于10 mL具塞容量瓶中,分別加水補至2 mL,搖勻。分別向葡萄糖梯度溶液中加入6 mL配制好的蒽酮試劑,搖勻置于冰水中冷卻,再置于沸水浴(95 ℃以上)中加熱12～15 min后取出迅速于冰水浴中冷卻15 min,以第1管為參比,在625 nm波長下迅速測定其他管的吸光度,并記錄。

(2) 繪制葡萄糖標準曲線圖:以標準葡萄糖溶液吸光值為縱坐標、標準葡萄糖含量(μg)為橫坐標,繪制標準曲線,并計算得出線性回歸方程為y=6.394 3x-0.027 8(R2=0.993 9),R2值越接近1表明標準曲線的線性關系越好。

(3) 樣品多糖提取率測定:將春生田頭菇粗多糖提取液濃度調整到測定范圍,準確吸取2 mL待測液于具塞試管中,按照1.4.2(1)中步驟在625 nm處測定其吸光值,并記錄,按照葡萄糖含量的標準曲線,根據式(1)計算粗多糖提取率。

(1)

式中:

R——春生田頭菇粗多糖提取率,%;

C——粗多糖濃度,g/mL;

V——粗多糖溶液體積,mL;

D——稀釋倍數;

m——春生田頭菇干粉質量,g。

1.4.3 春生田頭菇粗多糖提取單因素試驗 以春生田頭菇粗多糖提取率為指標,研究料液比、超聲提取功率和提取時間、熱水浸提溫度和時間對粗多糖提取率的影響。在提過程中,固定超聲提取時間20 min、超聲提取功率200 W、熱水浸提溫度85 ℃、熱水提取時間3 h,考察液料比[1∶20,1∶30,1∶40,1∶50,1∶60 (g/mL)]對春生田頭菇粗多糖得率的影響。固定料液比1∶30 (g/mL)、超聲提取功率200 W、熱水浸提溫度85 ℃、熱水提取時間3 h,考察超聲提取時間(10,15,20,25,30 min)對春生田頭菇粗多糖提取率的影響。固定料液比1∶30 (g/mL)、超聲提取時間20 min、熱水浸提溫度85 ℃、熱水提取時間3 h,考察超聲提取功率(100,150,200,250,300 W)對其提取率的影響。固定料液比1∶30 (g/mL)、超聲提取時間20 min、超聲提取功率200 W、熱水提取時間3 h,考察熱水浸提溫度(75,80,85,90,95 ℃)對其提取率的影響。固定料液比1∶30 (g/mL)、超聲提取時間20 min、超聲提取功率200 W、熱水浸提溫度85 ℃,考察熱水浸提時間(1,2,3,4,5 h)對其提取率的影響。

1.4.4 響應面優化試驗 根據單因素試驗結果,采用Box-Behnken響應面優化法進行響應面試驗,選取料液比、超聲提取功率、熱水浸提時間和溫度進行四因素三水平試驗,根據因素間交互作用優化春生田頭菇粗多糖提取工藝參數。

1.4.5 春生田頭菇粗多糖抗氧化能力測定

(1) 清除DPPH自由基能力:取2.0 mL配制好的不同質量濃度的春生田頭菇粗多糖溶液(0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14 mg/mL)于比色管中,分別加入2.0 mL無水乙醇和2.0 mL 0.02 mg/mL的DPPH溶液,溶液充分混勻后于室溫避光條件下靜置30 min,在分光光度計上于517 nm處測定吸光度,記Ai;以2.0 mL超純水替代0.02 mg/mL DPPH溶液,按上述方法測定吸光度,記Aj;以2.0 mL 維生素C溶液替代粗多糖溶液,按上述方法測定吸光度,記Ac,重復試驗3次。按式(2)計算DPPH自由基清除率。

(2)

式中:

RDPPH——DPPH自由基清除率,%;

Ai——加入DPPH時溶液的吸光度;

Aj——未加入DPPH溶液后的吸光值;

Ac——加入維生素C的吸光值。

(2) ABTS自由基清除能力:以2.45 mmol/L K2S2O4溶液為溶劑,配制7 mmol/L ABTS溶液,于暗室靜置12～16 h。用去離子水將混合液的734 nm處吸光度值調至0.700±0.020。將春生田頭菇粗多糖溶液(0～5.0 mg/mL)與稀釋后的ABTS溶液按照1∶4混合,于734 nm處測其吸光度值,記Ai;以超純水替代7 mmol/L ABTS溶液,按上述方法測定吸光度,記Aj;以維生素C溶液替代粗多糖溶液,按上述方法測定吸光度,記Ac,重復試驗3次。按式(3)計算ABTS自由基清除率。

(3)

式中:

RABTS——ABTS自由基清除率,%;

Ai——加入ABTS溶液的吸光度;

Aj——未加入ABTS溶液的吸光度;

Ac——加入維生素C的吸光值。

1.4.6 數據統計與分析 試驗采用Microsoft Office Excel 2019軟件進行數據統計并作圖,采用IBM SPSS Statistics 22.0統計軟件中的方差分析(ANOVA)法進行顯著性分析(顯著水平設為P<0.05)。所有測試重復3次,采用Design-Expert 8.0.5軟件設計響應面試驗參數,并對試驗數據進行分析。

2 結果分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對粗多糖提取影響 由圖1可知,料液比對春生田頭菇粗多糖提取率的影響呈現出多糖提取率先升后降的趨勢,當料液比達到1∶40 (g/mL)時,粗多糖提取率達到最大,為4.89%,之后逐漸下降,表明較高的料液比增加了粗多糖在水中的溶解度,但超過樣品與提取用水一定比例后粗多糖不升反降。其原因可能是當水的比例過大后,其他水溶性物質增加,使粗多糖與水分子結合量下降,導致粗多糖在水中的溶解量下降,提取率降低[9]。故選擇液料比1∶30,1∶40,1∶50 (g/mL) 3個條件進行響應面優化較為適宜。

圖1 料液比對粗多糖提取影響

2.1.2 超聲提取功率對粗多糖提取影響 由圖2可知,超聲提取功率對春生田頭菇粗多糖含量的影響較明顯,隨著超聲提取功率的增大,粗多糖提取率快速增加,在功率為250 W時達到最大,此時粗多糖提取率為5.18%,隨后超聲功率增大多糖提取率也明顯下降,因為超聲提取功率過高時會破壞多糖內部結構,使多糖進一步減少,導致多糖提取率下降[10]。因此,選取超聲提取功率150,200,250 W 3個條件進行響應面優化較為適宜。

圖2 超聲提取功率對粗多糖提取影響

2.1.3 超聲提取時間對粗多糖提取影響 由圖3可知,超聲提取時間對春生田頭菇粗多糖提取率的影響不明顯,隨著超聲提取時間的增加,粗多糖的提取率緩慢增加,增長不顯著。在超聲提取20 min后,粗多糖含量相對較高,隨著提取時間的延長,多糖得率呈現波動,但整體波動變化不大。因此,選擇超聲時間20 min為最佳提取條件,不再進行響應面優化。

2.1.4 熱水浸提溫度對粗多糖提取影響 由圖4可知,熱水浸提溫度對春生田頭菇粗多糖提取率的影響較為明顯,隨著熱水浸提溫度的不斷上升,粗多糖提取率顯著增加,熱水浸提溫度達到85 ℃時粗多糖提取率最大,為5.11%,隨后提取率開始逐步下降,可能是因為熱水浸提溫度過低時,多糖分子動量降低,分子動能減少無法促進粗多糖在水中的進一步溶解析出,而熱水浸提溫度太高,析出的粗多糖裂解增加,從而降低了粗多糖的提取率[11]。因此,選擇熱水浸提溫度為80,85,90 ℃ 3個條件進行響應面優化較為適宜。

圖4 熱水浸提溫度對粗多糖提取影響

2.1.5 熱水浸提時間對粗多糖提取影響 由圖5可知,熱水浸提時間對春生田頭菇粗多糖含量的影響較明顯,隨著熱水浸提溫度的上升,粗多糖提取率上升,在提取3 h后達到最大,之后再延長提取時間,多糖提取率反而略微降低,主要是因為提取時間過長后,分子內部熱能迅速增加,加快了多糖結構的破壞,導致粗多糖降解[12]。因此,選擇2,3,4 h 3個條件進行響應面優化較為適宜。

圖5 熱水浸提時間對粗多糖提取影響

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面優化試驗設計 根據單因素試驗確定料液比、超聲提取功率、熱水浸提溫度和時間組成四因素三水平進行Box-Behnken中心試驗響應面優化,設計參數見表1,設計方案及結果見表2。

表1 Box-Behnken中心試驗因素水平表

表2 Box-Behnken試驗設計方案及結果

2.2.2 響應面方差分析 采用Design Expert 8.0.5軟件對試驗結果進行響應面二次回歸擬合分析,得到回歸方程:

R=4.930 0+0.002 5A+0.040 8B+0.080 0C+0.126 7D-0.315 0AB+0.075 0AC+0.087 5AD+0.385 0BC-0.172 5BD-0.187 9A2-0.372 9B2-0.156 7C2-0.009 2D2。

(4)

表3 方差分析結果?

2.2.3 交互因子效應分析 AB、AC、BC、BD相關交互作用見圖6～圖9。由圖6、圖8、圖9可知,AB、BC、BD的等高線圖均為橢圓形狀,且響應面陡峭,說明料液比(A)與超聲提取功率(B)、熱水浸提溫度(C)和熱水浸提溫度(D)交互作用明顯,其中BC交互作用關系弱于AB和BD;由圖7可知,AC的等高線圖均接近圓形,且響應面平緩,說明AC交互作用關系不明顯。

圖6 料液比與超聲提取功率交互關系

圖7 料液比與熱水浸提溫度交互關系

圖8 超聲提取功率與熱水浸提溫度交互關系

圖9 超聲提取功率與熱水浸提時間交互關系

2.2.4 回歸模型進行中心組合設計分析 利用響應面分析方法對回歸模型進行中心組合設計分析,超聲輔助提取法提取田頭菇粗多糖工藝軟件得到理論最優條件為:超聲功率162.147 W,熱水浸提溫度82.547 ℃,料液比為1∶47.754 (g/mL),熱水浸提時間4.00 h,模型預測多糖提取率可達到5.11%。結合實際可操作性對模型預測最佳提取工藝參數進行調整:超聲功率150 W,熱水浸提溫度80 ℃,物料比1∶50 (g/mL),提取時間4 h,經3次平行實驗驗證,春生田頭菇粗多糖平均提取率為5.08%,與預測值接近,重復性較好。因此,采用響應面法優化得到的提取條件相對可靠,在該菌菇粗多糖的提取工藝上具有較好的應用價值。

2.3 春生田頭菇粗多糖抗氧化活性

由圖10和圖11可知,隨著粗多糖質量濃度的增加,對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力也逐漸增加,但均顯著低于同質量濃度維生素C的(P<0.05),與文獻[14]的研究結果一致。當春生田頭菇粗多糖質量濃度為0.14 mg/mL時,其對DPPH自由基的清除率為55.05%,經計算IC50為1.03 mg/mL;對ABTS自由基的清除率為58.47%,IC50為0.28 mg/mL。結果表明,春生田頭菇粗多糖在體外有一定的抗氧化活性。

圖10 粗多糖對DPPH自由基清除率影響

圖11 粗多糖對ABTS自由基清除率影響

3 結論

研究采用超聲輔助熱水浸提法提取春生田頭菇粗多糖,并探討其抗氧化能力。結果表明,春生田頭菇粗多糖的最佳工藝條件為:料液比1∶50 (g/mL)、超聲提取時間20 min、提取功率150 W、熱水浸提溫度80 ℃、浸提時間4 h,該條件下春生田頭菇粗多糖提取率高達5.08%;該粗多糖具有一定的體外抗氧化能力。但由于目前提取方法較為多元化,下一步可結合新工藝對其提取,同時對粗多糖進一步分離純化,以期更加全面、準確地了解春生田頭菇多糖的結構和功能活性。