蠟樣芽孢桿菌BWL-001代謝產(chǎn)物及抗弧菌活性研究*

何佳利,甘雨滿,白 猛,高程海,張文飛,王銳萍

(1.海南師范大學生命科學學院,海南海口 571158;2.海南師范大學,熱帶島嶼生態(tài)學教育部重點實驗室,海南海口 571158;3.廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院,廣西南寧 530200;4.廣西中醫(yī)藥大學,廣西海洋藥物重點實驗室,廣西南寧 530200)

弧菌(Vibrio)是一類革蘭氏陰性細菌,是海洋環(huán)境中最常見的細菌類群。迄今為止,全球范圍內(nèi)已有100多種弧菌,廣泛分布于海灣、近海岸海域河口和海底沉積物中[1,2]。部分弧菌是常見的水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌,如副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、鰻弧菌(V.anguillarum)和歐文氏弧菌(V.owensii)等[3-6]。其中,鰻弧菌是最早發(fā)現(xiàn)的魚類細菌病原,可感染海水魚、蝦等多種水產(chǎn)動物,對海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[7,8]。目前,抗生素是治療水產(chǎn)動物疾病的主要手段,如果大量使用抗生素使耐藥性菌株不斷涌現(xiàn),水產(chǎn)病害就愈加難以控制。因此,亟需尋找綠色環(huán)保的生物殺菌劑來防治水產(chǎn)養(yǎng)殖中的弧菌疾病。

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種普遍存在的革蘭氏陽性細菌[9],屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),與蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)等物種具有許多共同的表型和基因型特性,具有對環(huán)境無污染、生物靶向性強、效果顯著和持久的生物防治優(yōu)點,有開發(fā)成綠色環(huán)保的生物殺菌劑的潛力[10-12]。此外,研究表明蠟樣芽孢桿菌能產(chǎn)生高活性的激素、細菌素、多肽抗生素、殺蟲外毒素以及揮發(fā)性抗菌物質(zhì)等[13,14]。蠟樣芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物結構類型及生物活性多樣,關于其代謝產(chǎn)物的研究備受關注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),熱帶雨林土壤來源的芽孢桿菌代謝產(chǎn)物具有多種生物活性[15]。經(jīng)過前期活性篩選發(fā)現(xiàn),蠟樣芽孢桿菌BWL-001的代謝提取物對副溶血弧菌有微弱活性。為深入研究蠟樣芽孢桿菌BWL-001代謝產(chǎn)物中抗海洋弧菌活性的化學成分,運用多種色譜分離方法,從菌株提取物中分離具有抗海洋弧菌活性的先導化合物,為研發(fā)防治水產(chǎn)養(yǎng)殖中弧菌疾病的綠色環(huán)保的生物殺菌劑提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

土壤樣品于2016年7月采自中國海南島霸王嶺熱帶雨林(19°4′11″N,109°10′37″E),從中分離出蠟樣芽孢桿菌BWL-001,菌種一直存放于海南師范大學熱帶島嶼生態(tài)學教育部重點實驗室。

1.1.2 主要儀器與試劑

ZYJ-S型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司),高效液相色譜儀(日本島津公司),中壓制備色譜儀(瑞士布奇公司),EYELAN-1100V-W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會社),YOKO-ZK暗箱式紫外分析儀(武漢藥科新技術開發(fā)有限公司),Sephadex LH-20凝膠(上海科拉曼試劑有限公司),YMC-Pack ODS-A色譜柱(10 mm×250 mm,5 μm,日本YMC公司),Bruker AV-500 MHz 超導核磁共振儀(瑞士Bruker公司),色譜柱硅膠(青島海洋化工有限公司),核磁所用的氘代試劑購自艾覽(上海)化工科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種發(fā)酵培養(yǎng)

在滅菌后的超凈工作臺內(nèi)用LB培養(yǎng)基(胰蛋白10 g/L,酵母提取粉5 g/L,氯化鈉10 g/L,pH值為7.2-7.4)大規(guī)模發(fā)酵,共發(fā)酵100瓶。每1 000 mL的三角錐形瓶中加入300 mL的培養(yǎng)液,在121 ℃的高溫滅菌鍋中滅菌20 min,待培養(yǎng)基冷卻后接種,室溫120 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)3 d,共發(fā)酵30 L。

1.2.2 提取與分離

大規(guī)模發(fā)酵后,加入等體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液(30 L),反復萃取多次至萃取液顏色變淺。萃取液通過減壓濃縮得到總浸膏(17.8 g),將總浸膏用200-300目的正相硅膠拌樣,進行中壓正相硅膠柱色譜分離,采用石油醚-乙酸乙酯(100∶0-0∶100,V/V)和乙酸乙酯-甲醇(100∶0-0∶100,V/V)體系進行梯度洗脫,收集得到6個小組分(Fr.1-Fr.6)。

Fr.5 (1.7 g)經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱色譜(純甲醇)等梯度洗脫分離,再通過高效液相色譜(水-甲醇15∶5,V/V)梯度洗脫制備得到化合物1(4.3 mg)、2(3.7 mg)、3(4.0 mg)和4(3.5 mg)。Fr.6 (3.4 g)首先經(jīng)過反相硅膠柱色譜(水-甲醇7∶3-2∶8,V/V)梯度洗脫分離,然后經(jīng)過Sephadex LH-20(純甲醇)凝膠柱色譜等梯度洗脫分離,最后經(jīng)過高效液相色譜(水-甲醇9∶11,V/V)等梯度洗脫制備得到化合物5(3.9 mg)。Fr.4 (4.0 g)經(jīng)過Sephadex LH-20 (氯仿-甲醇1∶1,V/V)凝膠柱色譜等梯度洗脫,然后通過高效液相色譜(水-甲醇1∶4,V/V)等梯度分離制備得到化合物6(3.1 mg)、7(4.2 mg)和8(4.5 mg)。Fr.3 (2.6 g)經(jīng)過正相硅膠柱色譜梯度洗脫分離,以乙酸乙酯-甲醇(5∶1-1∶1,V/V)體系梯度洗脫,再經(jīng)高效液相色譜(水-甲醇7∶13,V/V)制備得到化合物9(3.2 mg)和10(5.3 mg)。

1.2.3 抗菌活性測定

采用96孔板微量稀釋法測定所有化合物對歐文氏弧菌(ATCC 25919)、哈維氏弧菌(ATCC 14126)、副溶血弧菌(ATCC 17802)和溶藻弧菌(ATCC 17749)的抗菌活性,測定化合物的最小抑菌濃度(Minimal Inhibit Concentration,MIC)值。上述4種菌為海洋致病弧菌,目前所有弧菌菌株均保存于廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院。抗菌活性測定以氯霉素(Chloramphenicol)為陽性對照,二甲基亞砜(DMSO)為陰性對照,具體實驗方法參考文獻[16]。

2 結果與分析

2.1 化合物結構鑒定

從霸王嶺熱帶雨林土壤來源的蠟狀芽孢桿菌B.cereusBWL-001中分離鑒定出10個化合物,結構如圖1所示。

圖1 化合物1-10的結構

2.2 化合物波譜數(shù)據(jù)

化合物1。淺黃色油狀,ESI-MSm/z:211.1 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δH:4.11 (1H,m,H-6),4.00 (1H,m,H-3),3.56 (2H,m,H-9),2.33 (1H,m,H-7a),1.74-2.11 (5H,m,H-7b,H-8,H-10),1.52 (1H,m,H-11),0.95 (3H,d,J=4.4 Hz,H-12 or H-13),0.85 (3H,d,J=4.4 Hz,H-12 or H-13);13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δC:170.4 (C-2),166.4 (C-5),59.2 (C-6),53.6 (C-3),45.7 (C-9),38.9 (C-10),28.4 (C-7),24.9 (C-11),23.5 (C-8),22.9 (C-12 or C-13),21.4 (C-12 or C-13)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻[17]報道一致,因此鑒定該化合物為3-異丁基吡咯并哌嗪-2,5-二酮。

化合物2。淺黃色油狀,ESI-MSm/z:211.1 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:8.00 (1H,s,NH),4.19 (1H,m,H-6),3.99 (1H,m,H-3),3.37 (2H,m,H-9),2.11 (1H,m,H-7a),1.76-1.91 (5H,m,H-7b,H-8,H-10),1.35 (1H,m,H-11),0.86 (3H,t,J=4.4 Hz,H-12),0.85 (3H,d,J=4.4 Hz,H-13);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:170.3 (C-2),166.5 (C-5),58.5 (C-6),52.6 (C-3),44.8 (C-9),37.8 (C-10),27.5 (C-7),24.1 (C-11),22.8 (C-8),22.5 (C-13),21.9 (C-12)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致,故鑒定該化合物為cyclo-(Pro-lle)。

化合物3。淺黃色油狀,ESI-MSm/z:261.1 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:7.06 (2H,d,J=8.0 Hz,H-2′,6′),6.66 (2H,d,J=8.0 Hz,H-3′,5′),4.25 (1H,m,H-9),4.02 (1H,t,J=7.4 Hz,H-6),3.62 (1H,m,H-5a),3.40 (1H,m,H-5b),324 (1H,m,H-10a),2.94 (1H,dd,J=14.4,9.2 Hz,H-10b),1.99 (1H,m,H-3a),1.69 (2H,m,H-4),1.38 (1H,m,H-3b);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:169.9 (C-1),164.7 (C-7),155.9 (C-4′),130.7 (C-2′,6′),126.9 (C-1′),115.1 (C-3′,5′),58.3 (C-6),55.9 (C-9),44.5 (C-3),34.7 (C-10),27.8 (C-5),21.7 (C-4)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻[19]報道一致,因此鑒定該化合物為maculosin。

化合物4。淺黃色油狀,ESI-MSm/z:245.1 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:7.30 (2H,br t,J=7.2 Hz,H-2′,6′),7.22 (1H,br t,J=7.2 Hz,H-4′),7.19 (2H,d,J=7.2 Hz,H-3′,5′),4.22 (1H,dt,J=6.7,4.3 Hz,H-9),3.62 (1H,ddd,J=12.0,9.4,8.4 Hz,H-3a),3.39 (1H,ddd,J=12.0,8.4,3.0 Hz,H-3b),3.15 (2H,m,H-10),3.06 (1H,dd,J=10.4,6.6 Hz,H-6),2.18 (1H,m,H-5a),1.94 (1H,m,H-4a),1.79 (1H,m,H-5b),1.69 (1H,m,H-4b);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:169.4 (C-1),164.9 (C-7),135.4 (C-1′),130.1 (C-2′,6′),128.9 (C-3′,5′),127.7 (C-4′),59.2 (C-6),57.9 (C-9),45.3 (C-3),40.6 (C-10),29.1 (C-5),21.8 (C-4)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻[20]報道一致,故鑒定該化合物為trans-cyclo-(Pro-Phe)。

化合物5。黃色油狀物,ESI-MSm/z:138.0 [M+H]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:7.75 (1H,dd,J=4.0,8.0 Hz,H-7),7.21 (1H,t,J=8.0 Hz,H-5),6.76 (1H,d,J=4.0 Hz,H-4),6.50 (1H,t,J=8.0 Hz,H-6);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:169.9 (C-1),151.7 (C-3),133.9 (C-5),131.5 (C-7),116.6 (C-6),114.9 (C-4),109.7 (C-2)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻[21]報道一致,因此鑒定該化合物為anthranilic acid。

化合物6。淡黃色固體,ESI-MSm/z:212.1 [M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:7.48 (1H,d,J=5.2 Hz,H-4),7.35 (1H,d,J=4.6 Hz,H-7),7.24 (1H,s,H-2),7.08 (1H,td,J=4.6,0.8 Hz,H-6),6.98 (1H,td,J=5.2,0.8 Hz,H-5),3.74 (2H,s,H-1′),3.60 (3H,s,H-3′);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:172.0 (C-2′),136.1 (C-7a),127.1 (C-3a),124.1 (C-2),121.0 (C-6),118.5 (C-5),118.4 (C-4),111.4 (C-7),106.9 (C-3),51.5 (C-3′),30.6 (C-1′)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻[22]報道一致,故鑒定該化合物為indole-3-meth-ylethanoate。

化合物7。棕色晶體(甲醇),mp.168-172 ℃;ESI-MSm/z:174.1 [M-H]-;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:7.51 (1H,d,J=7.8 Hz,H-4),7.35 (1H,d,J=8.4 Hz,H-7),7.23 (1H,d,J=2.4 Hz,H-2),7.08 (1H,td,J=7.8,0.6 Hz,H-6),6.98 (1H,td,J=7.2,1.2 Hz,H-5),3.64 (2H,s,H-1′);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:173.3 (C-2′),136.1 (C-7a),127.2 (C-3a),123.9 (C-2),121.0 (C-6),118.5 (C-5),118.4 (C-4),111.4 (C-7),107.7 (C-3),31.1 (C-1′)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻[23]報道一致,故鑒定該化合物為indole-3-acetic acid。

化合物8。黃色油狀,ESI-MSm/z:201.1 [M-H]-;1H-NMR (600 MHz,CDCl3)δH:9.02 (1H,brs,1-NH),7.59 (1H,d,J=8.0 Hz,H-4),7.35 (1H,d,J=8.0 Hz,H-7),7.20 (1H,dd,J=8.0,8.0 Hz,H-6),7.11 (1H,dd,J=8.0,8.0 Hz,H-5),6.93 (1H,d,J=2.2 Hz,H-2),6.08 (1H,brs,12-NH),3.55 (2H,dt,J=6.5 Hz,H-11),2.94 (2H,t,J=6.5 Hz,H-10),1.88 (3H,s,H-14);13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δC:170.9 (C-13),136.6 (C-8),127.4 (C-9),122.4 (C-6),121.9 (C-2),119.3 (C-5),118.6 (C-4),112.5 (C-3),111.5 (C-7),40.1 (C-11),25.2 (C-10),23.2 (C-14)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻[24]報道一致,因此鑒定該化合物為nb-acetyltryptamine。

化合物9。白色固體,ESI-MSm/z:125.1 [M-H]-;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:11.00 (1H,s,2-NH),10.58 (1H,s,4-NH),7.25 (1H,s,H-5),1.72 (3H,s,H-7);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:165.1 (C-1),151.3 (C-3),137.6 (C-5),107.5 (C-6),11.8 (C-7)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻[25]報道一致,故鑒定該化合物為thymine。

化合物10。白色固體,ESI-MSm/z:82.1 [M+Na]+;1H-NMR (600 MHz,DMSO-d6)δH:6.86 (2H,brs,1-NH),1.77 (3H,s,H-2);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC:173.5 (C-1),22.6 (C-2)。上述核磁波譜數(shù)據(jù)與文獻[26]報道一致,故鑒定該化合物為acetamide。

2.3 抗菌活性測定結果

抗海洋弧菌活性測試結果表明,化合物6-8對副溶血弧菌有弱的抑制活性,其MIC值均為12.5 μg/mL,其他化合物的MIC值均大于25 μg/mL,陽性對照氯霉素的MIC值為0.78 μg/mL。

3 結論

本研究對海南霸王嶺熱帶雨林土壤來源的蠟樣芽孢桿菌BWL-001代謝產(chǎn)物進行系統(tǒng)研究,從該菌株LB培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中共分離鑒定出10個化合物,包括4個二酮哌嗪類化合物(1-4)、3個吲哚生物堿衍生物(6-8)以及3個其他類化合物(5、9和10),所有化合物均首次從該菌株中分離得到,化合物6-8對副溶血弧菌有弱的抑制活性。此外,據(jù)文獻報道,化合物1和4對鰻弧菌有微弱抑制活性[18];化合物2和3未見相關抗弧菌活性數(shù)據(jù)的報道;化合物6具有生長促進活性,對小麥胚芽生長有促進作用[22];化合物8對革蘭氏陽性細菌,如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)等有弱的抑制活性[27],推測該化合物結構中乙酰基為主要活性基團。本研究僅從蠟樣芽孢桿菌BWL-001代謝產(chǎn)物中分離出10個單體化合物,仍有很多微量成分未被分離鑒定出來,后續(xù)可以對該菌株代謝產(chǎn)物中的微量成分進行分離,以期獲得更多結構新穎的化合物。本研究豐富了海南霸王嶺熱帶雨林土壤來源的蠟樣芽孢桿菌中活性代謝產(chǎn)物的研究,為充分挖掘蠟樣芽孢桿菌中抗海洋弧菌的活性物質(zhì)提供了科學依據(jù)。