基于X型結構的DNA熒光傳感器檢測黃曲霉毒素B1

喬夢想,白 天,呂澤平,衛 敏*

1.河南工業大學 糧油食品學院,河南 鄭州 450001

2.河南省食品和鹽業檢驗技術研究院,河南 鄭州 450008

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉和寄生曲霉產生的有害代謝產物[1],主要包括黃曲霉毒素B1(AFB1)、B2、G1、G2以及兩種代謝產物M1、M2[2],其中AFB1毒性最強,具有致畸、致癌和致突變作用等[3],已被國際癌癥機構歸為Ⅰ類致癌物[4-5]。AFB1通過廣泛地污染糧食如玉米、小麥、花生等[6-7]從而威脅到人類的健康。AFB1對熱穩定,一旦污染了農產品,經過常規熱處理和巴氏殺菌等食品加工過程無法完全去除[8]。我國規定玉米、花生等食品中AFB1的含量不得超過2 μg/kg[9]。因此,建立一種靈敏、快速、特異性高的分析技術用于AFB1的檢測對于食品安全和人類健康至關重要。

目前,檢測AFB1的傳統方法包括高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS)以及酶聯免疫吸附方法(ELISA)等[10-12]。基于色譜的檢測方法雖然穩定性好,準確性和靈敏度也較高,但因儀器昂貴、樣品前處理較為復雜以及對試驗人員的操作水平要求高等缺點無法滿足食品安全快速檢測的要求。基于免疫分析的方法雖操作簡單,但是由于抗體制備較為復雜、成本高,且在運輸和儲存過程中不易保存的缺點限制了其實際應用[13]。適配體是一種人工合成的單鏈寡核苷酸,是通過對一些小分子的配體進行指數富集(SELEX)的系統進化獲得的,對其靶標具有特異性識別能力[14-15]。與抗體相比,因其具有合成成本低、易于修飾等優點已成為抗體的理想替代物[16]。近年來已有許多基于AFB1適配體的檢測方法,包括比色法、電化學法、表面增強拉曼散射法和熒光法等[17-20]。DNA納米技術是一種能夠將DNA分子進行組裝和制造的技術,通過精確設計DNA序列,可以制造出各種形態和尺寸的納米結構[21]。因此,基于DNA納米結構與熒光材料的結合,使適配體在熒光生物傳感器研究領域中有廣闊的應用前景。

隨著傳感技術的不斷發展,越來越多的傳感策略被應用于傳感器的構建中,提升其穩定性、靈敏度等性能,實現對目標物質的檢測。目前,已有基于不同DNA納米結構的生物傳感器被開發出來用于真菌毒素的檢測,如四面體和八面體納米結構[22-23]。然而,一些DNA納米結構在傳感器實際構建過程較為復雜,不利于實現快速檢測。X型DNA納米骨架僅需要2條DNA單鏈完成構建,暴露出4條末端可以同時與4條適配體進行互補配對,具有良好的剛性和穩定性,但目前未用于真菌毒素的檢測研究。在生物傳感器的構建過程中通常涉及分離步驟,由于DNA屬于比重較小的物質,在分離過程中不易操作,利用磁珠的磁分離特性進行分離操作簡單,可起到降低背景信號、增強靈敏度的作用。

為了提高對AFB1的檢測效率,作者設計了可同時接入4條AFB1適配體的X型DNA納米骨架結構,利用高親和力和高特異性的適配體對AFB1進行識別,采用FAM熒光基團作為熒光信號,利用快速磁分離技術,構建了基于X型結構的DNA熒光傳感器用于AFB1的檢測研究。該熒光適配體傳感器為利用DNA納米結構檢測真菌毒素提供了有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所使用的核酸序列均來自生工生物工程(上海)股份有限公司,AFB1適配體(FAM-Apt)序列為5′-FAM-TGC ACG TGT TGT CTC TCT GTG TCT CGT GC-3′,DNA1的序列為5′-GCA CGA GAC ACA GAG AGA TTT TTT TTT TTT TTC TAC CCT CAA CCT CAA CTC CAT TTG CAC GAG ACA CAG AGA GAT TTT TTT TTT TTT T-Bio-3′,DNA2的序列為5′-GCA CGA GAC ACA GAG AGA TTT TTT TTT TTT TTT GGA GTT GAG GTT GAG GGT AGT TTG CAC GAG ACA CAG AGA GA-3′;鏈霉親和素包被的磁珠(SA-MBs,粒徑300 nm、10 mg/mL)：蘇州海貍生物醫學工程有限公司;紅茶、玉米：市售;玉米粉質控樣(TOIXN-JTZK-019)：河南省食品和鹽業檢驗技術研究院。鹽酸、氯化鈉、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)：天津市科密歐化學試劑有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA)：洛陽市化學試劑廠;AFB1、赭曲霉毒素A(OTA)、嘔吐毒素(DON)：Sigma-Aldrich公司;T-2毒素、DNA Marker A、瓊脂糖、TEB緩沖液：生工生物工程(上海)股份有限公司;綠如藍核酸染料：北京天恩澤基因科技有限公司;6×DNA上樣緩沖液：北京索萊寶科技有限公司;玉米赤酶烯酮(ZEN)：國家糧食和物資儲備局科學研究院;伏馬菌素B1(FB1)、AFB2：Acros公司;所用化學試劑均為分析純,所用水均為滅菌超純水。

1.2 儀器

水浴恒溫振蕩器：上海躍進醫療器械有限公司;EL06053220熒光光度計：美國瓦里安公司;Tanon-2500凝膠成像儀、HE-120電泳儀：上海天能科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 X型DNA熒光傳感器的制備及AFB1的檢測

分別取10 μL 0.25 μmol/L DNA1和10 μL 0.25 μmol/L DNA2加入離心管混合均勻,在37 ℃條件下孵育1 h,加入1.50 μL 10 mg/mL用SA包被的MBs再次孵育1 h即得到DNA1/DNA2-MBs結構復合物。將10 μL、1 μmol/L FAM-Apt與10 μL緩沖溶液加入離心管中孵育40 min作為對照組。同時,將10 μL 1 μmol/L FAM-Apt與10 μL 不同濃度的AFB1加入不同離心管中孵育40 min。當AFB1不存在時,FAM-Apt通過堿基互補配對可以分別連接到DNA1/DNA2-MBs結構中游離的單鏈部分,形成完整的X型DNA納米結構。該結構可同時接入4條FAM-Apt鏈。當AFB1存在時,AFB1先與其適配體結合,形成AFB1/FAM-Apt復合物,游離在上清液中。通過測定上清液中熒光信號強度的變化,實現對AFB1的快速測定。使用熒光分光光度計在室溫下進行熒光掃描時,設置發射波長為510～600 nm,記錄在490 nm激發波長下的熒光光譜。

1.3.2 試驗參數條件優化及性能評價

根據1.3.1制備X型DNA熒光傳感器檢測AFB1時,分別選擇用SA包被的不同體積(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μL)的10 mg/mL MBs再次孵育1 h得到DNA1/DNA2-MBs結構復合物,選擇MBs最佳體積進行后續試驗。

按照1.3.1得到DNA1/DNA2-MBs結構復合物,將10 μL 1 μmol/L FAM-Apt與10 μL 50 ng/mL AFB1加入離心管中,選擇對AFB1的不同孵育時間(20、30、40、50、60 min)進行優化。

固定X骨架濃度為0.25 μmol/L,將FAM-Apt與X骨架按濃度比(3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1)分別與10 μL 50 ng/mL AFB1加入離心管中孵育最佳時間,選擇最佳濃度比進行后續試驗。

將10 μL 1 μmol/L FAM-Apt分別與10 μL 500 ng/mL干擾毒素、10 μL 50 ng/mL AFB1加入離心管中孵育最佳時間,磁分離后取上清液進行檢測,對傳感器特異性進行評價。

1.3.3 實際樣品處理

玉米粉樣品的處理：將玉米樣品研磨成粉,取0.50 g分別加入0.50 mL不同濃度的AFB1標準液并混合均勻,然后在室溫條件下干燥。將干燥后的樣品與5 mL的甲醇-水(體積比7∶3)萃取溶劑充分混合,放置于振蕩器中振蕩30 min后12 000 r/min離心10 min,用0.45 μm有機濾膜過濾獲得上清液。使用Tris-HCl緩沖液(pH 7.40)將濾液稀釋。分別制備AFB1質量濃度為0、0.10、1、10 ng/mL的加標玉米粉樣品。

紅茶樣品的處理：取0.50 mL紅茶分別加入0.50 mL不同濃度的AFB1標準液,混合均勻,用0.45 μm水系濾膜過濾獲得上清液。使用Tris-HCl緩沖液(pH 7.40)將濾液稀釋。分別制備AFB1質量濃度為0、0.10、1、10 ng/mL 的加標紅茶樣品。

1.4 數據處理

使用OriginPro 2021軟件、Adobe Illustrator 2022軟件處理試驗數據。

2 結果與分析

2.1 X型DNA熒光適配體傳感器的電泳表征

由圖1可知,泳道1—3都是單鏈DNA,每條DNA的遷移速度與其所含的堿基個數相對應,堿基數目越多,遷移越慢。泳道4為DNA1和DNA2的自組裝雙鏈,由于DNA雙鏈的形成導致分子質量增加,相比于單鏈DNA其遷移速度變慢。由于雙鏈堿基能嵌入更多的染料,因此該條帶比單鏈DNA的更亮。泳道5的遷移速度最慢,說明FAM-Apt、DNA1和DNA2通過堿基互補配對成功形成了X型DNA納米結構。當體系中形成復雜的DNA多鏈結構之后,條帶的遷移位置可能會發生與DNA Marker遷移率不完全一致的情況[24-26]。

注：M條帶代表DNA分子質量標準Marker A(25～500 bp),泳道1—5的條帶分別為FAM-Apt、DNA1、DNA2、DNA1/DNA2、X型DNA納米結構;單鏈DNA濃度為4 μmol/L。圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis

2.2 X型DNA熒光傳感器檢測AFB1的可行性分析

由圖2可知,當AFB1不存在時,FAM的熒光強度最大值較低,為172.28,說明FAM-Apt成功接入DNA1/DNA2-MBs形成X型結構。當50 ng/mL AFB1存在時,FAM的熒光強度明顯升高至279.72,說明AFB1與其適配體成功結合,形成AFB1/FAM-Apt復合物,游離在上清液中,從而獲得了較強的熒光信號。結果表明,所制備的X型DNA傳感器能夠實現對AFB1的檢測。

圖2 X型DNA傳感器的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of X-shaped DNA sensors under different conditions

2.3 X型DNA熒光傳感器的試驗條件優化

由圖3(a)和圖3(b)可知,隨著MBs體積的逐漸增加,相對熒光強度(ΔF)也逐漸增加,在MBs體積為1.5 μL時達到最高;隨著MBs體積的繼續增加,過量的MBs影響了傳感器的檢測能力,造成ΔF下降,因此選擇MBs最佳體積為1.50 μL。

注：(a)(c)(e)分別為不同MBs的體積、孵育時間、FAM-Apt與X型骨架濃度比對X型DNA傳感器熒光強度影響的光譜圖;(b)(d)(f)分別是它們對ΔF的影響。圖3 試驗條件的優化Fig.3 Optimization of experimental conditions

由圖3(c)和圖3(d)可知,在反應的初始階段,ΔF隨著時間的增加而增加,當AFB1的孵育時間為40 min時,ΔF達到最大,孵育時間繼續增加,ΔF無明顯變化。說明當孵育時間為40 min時,AFB1的適配體與AFB1之間的特異性結合作用達到飽和,因此選擇AFB1的最佳孵育時間為40 min。

由圖3(e)和圖3(f)可知,將X型骨架濃度固定為0.25 μmol/L,當FAM-Apt的濃度為0.75～1 μmol/L時,ΔF隨著FAM-Apt濃度的增加而增加,并在1 μmol/L時ΔF達到最大,FAM-Apt濃度繼續增加,ΔF變化不明顯。說明當FAM-Apt與X型骨架濃度比為4∶1時,FAM-Apt與X型骨架達到飽和狀態,因此選擇FAM-Apt與X型骨架最佳濃度比為4∶1。

2.4 X型DNA熒光傳感器對AFB1的檢測研究

在最佳檢測條件下,研究了AFB1濃度與傳感器ΔF之間的關系,并建立了標準曲線。圖4(a)為X型DNA傳感器檢測AFB1的光譜圖。在AFB1質量濃度為0.05～500 ng/mL時,傳感器的熒光強度隨著AFB1質量濃度的增加而增加。對AFB1質量濃度取對數后,lg(ρAFB1)與傳感器的ΔF在0.05～100 ng/mL的線性范圍內,有良好的線性相關性(圖4(b)),線性方程為ΔF=56.53+30.62lg(ρAFB1),R2=0.99,根據國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)的推薦方法計算得到檢出限(LOD)為9 pg/mL。為了驗證所開發的傳感器的分析性能,將X型DNA傳感器與其他已報道的傳感器進行了比較(表1)。可以看出,本試驗設計的傳感器具有靈敏度高、LOD低的優點。

表1 傳感器與其他檢測AFB1的方法比較Table 1 Comparison of sensors with other methods for detecting AFB1

注：(a)圖中由a到j,AFB1的質量濃度依次為 0、0.05、0.10、0.50、1、5、10、50、100、500 ng/mL;(b)內插圖為ΔF與lg (ρAFB1)的線性關系曲線(AFB1的質量濃度為0.05、0.10、0.50、1、5、10、50、100 ng/mL)。圖4 傳感器檢測AFB1的標準曲線及對應的熒光光譜Fig.4 Standard curve and corresponding fluorescence spectrum of AFB1 detection by fluorescent sensor

2.5 X型DNA熒光傳感器的檢測性能研究

利用不同的干擾毒素(FB1、ZEN、T-2、DON、AFB2、OTA)對X型DNA傳感器的特異性進行了評估,在傳感器制備過程中加入干擾毒素的條件與目標物AFB1(質量濃度50 ng/mL)完全相同,其質量濃度為AFB1質量濃度的10倍,結果如圖5(a)所示。可以看出,單一的其他干擾毒素對傳感器的ΔF影響較小,當其他干擾毒素與AFB1共存時,ΔF與空白相比明顯上升,且與AFB1單獨存在時的ΔF無明顯差異。說明該傳感器具有良好的特異性。

注：(a)中混合毒素為FB1、ZEN、T-2、DON、AFB2、OTA及AFB1的混合溶液;(b)(c)中AFB1質量濃度為50 ng/mL。圖5 傳感器的性能研究Fig.5 Detection performance study of sensors

在相同檢測條件下,測定了6個獨立傳感器的熒光響應值(圖5(b)),RSD為3.60%,說明X型DNA熒光傳感器具有良好的重現性。在相同檢測條件下,按照1.3.1的方法制備傳感器,并在4 ℃下儲存。儲存7 d后,傳感器的熒光強度保持在95%以上,儲存14 d后,熒光強度仍保持在90%以上(圖5(c)),說明制備的X型DNA熒光傳感器具有良好的穩定性。

2.6 實際樣品檢測

通過在實際樣品中添加標準AFB1進行回收率試驗[34-35]評價該傳感器的準確性。對紅茶和玉米粉樣品進行了加標檢測,AFB1的添加量分別為0、0.10、1、10 ng/mL。由表2可知,紅茶和玉米粉樣品中AFB1的平均回收率為92.60%～107.30%和92.10%～104.40%,RSD均低于15%,表明所制備的傳感器具有較高的準確性。同時,采用HPLC測定玉米粉質控樣品中AFB1,測定結果為0.14 ng/mL,采用本文熒光傳感器測定結果為0.15 ng/mL,進一步驗證了傳感器的準確性。采用t檢驗進行分析,測定玉米粉中AFB1,計算得到t為0.52<4.303(理論值),說明在95%的置信水平下本方法與HPLC無顯著性差異。由此可知,所制備的X型DNA傳感器在食品安全檢測領域具有較好的實際應用潛力。

表2 實際樣品的檢測結果 (n=3)Table 2 Detection results of real samples (n=3)

3 結論

制備了一種基于X型DNA納米結構的熒光傳感器檢測AFB1,所設計的X型DNA納米結構可同時接入4條FAM-Apt,當AFB1存在時將優先與FAM-Apt結合,游離于上清液中,采用磁分離的方法,可以實現對AFB1的高效檢測。最優試驗條件下,在AFB1質量濃度為0.05～100 ng/mL時,線性方程為ΔF=56.53+30.62lg(ρAFB1)(R2=0.99),LOD為9 pg/mL。特異性研究結果表明該傳感器選擇性良好。對紅茶和玉米粉進行了加標測試,平均回收率為92.60%～107.30%和92.10%～104.40%,RSD均低于15%,表明該傳感器對實際樣品的檢測具有較高的準確性。此外,該傳感器有望與紙基相結合,構建高通量紙基傳感器實現對AFB1快速檢測,使其能更好地應用于現場檢測。