牛支原體病病原特性及疫苗研究進(jìn)展

郭亞男，劉紅燕，，李 勇，何生虎

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，銀川 750002；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；3.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生命科技學(xué)院，銀川 750021）

牛支原體（Mycoplasma bovis）是引起牛呼吸、生殖、乳腺炎和關(guān)節(jié)炎等疾病的病原體，是造成經(jīng)濟(jì)損失較大的疾病［1］。鮮見有效疫苗及藥物用于該病的防治，在引種前有必要對(duì)牛支原體進(jìn)行檢測(cè)以減少經(jīng)濟(jì)損失。許多國(guó)家大部分病例與M.bovis有關(guān)，部分國(guó)家已對(duì)牛乳房炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎和生殖障礙的病例進(jìn)行常規(guī)檢查［2］。對(duì)牛支原體病的特性、流行狀況、造成的經(jīng)濟(jì)損失、病程研究、病理組織學(xué)變化、疫苗研究及膜蛋白研究進(jìn)展等方面進(jìn)行了綜述，以供參考借鑒。

1 牛支原體特性

1.1 牛支原體的結(jié)構(gòu)特性

牛支原體是柔膜體綱支原體目支原體科支原體屬，是感染牛的一種重要的致病性病原體［3］。該病原體是可以在無(wú)活細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的最小原核微生物，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)細(xì)胞壁，無(wú)細(xì)胞核，僅有核糖體，可通過0.22 μm 濾膜［4］。其基因序列大小約1 080 bp，具有較低的G+C 含量，為27.8%～32.9%［5］。牛支原體曾一度被認(rèn)為是小反芻動(dòng)物支原體（無(wú)乳支原體）關(guān)系最近的亞種［6］，然而，2 種支原體引起疾病的宿主是不同動(dòng)物，并且2 種病原體DNA 序列僅有40%的重合，因此在1976 年才被命名為牛支原體。但是在臨床診斷過程中，由于牛支原體和無(wú)乳支原體的16S rRNA 相似性達(dá)99.8%，而且它們的生化特性也非常的相似［7］，因此在診斷時(shí)，通過16S rRNA 和生化特性難以進(jìn)行區(qū)分。

1.2 牛支原體的適應(yīng)性

盡管多數(shù)支原體在環(huán)境中是脆弱的，但是牛支原體在環(huán)境中的抵抗力較強(qiáng)，在避光處可以存活數(shù)周，在4 ℃的牛奶中可存活2 個(gè)月，牛支原體的活力隨溫度的升高而降低，在4～37 ℃的液體環(huán)境中，牛支原體的生長(zhǎng)和活力不受影響，在65 ℃環(huán)境中僅存活2 min，70 ℃環(huán)境中存活1 min［8-12］。因此與被感染動(dòng)物的傳染性相比，從環(huán)境中感染牛支原體病原的可能性較低。牛支原體污染的冷凍精子可以保持多年的感染性，也是容易被忽視的方面［13］。

1.3 牛支原體的致病性

牛支原體的毒力因子和致病性機(jī)制在很大程度上仍然未知，但是已知牛支原體膜表面蛋白（Vsp）家族高頻率改變表達(dá)的能力在M.bovis致病性中發(fā)揮重要作用［14］。牛支原體基因組中有多個(gè)能表達(dá)具有黏附功能的膜蛋白，至少有13 個(gè)基因編碼可以表達(dá)可變表面脂蛋白［15］，這些基因可通過多種機(jī)制，包括Vsp 基因座內(nèi)的DNA 轉(zhuǎn)座和染色體內(nèi)重組，改變其表面組分的抗原特性，起到增強(qiáng)定殖、附著和逃避宿主免疫防御系統(tǒng)的作用，并且該類膜蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)黏膜免疫［16］。

2 牛支原體病的流行狀況

牛支原體的宿主主要是肉牛和奶牛，但是也能從水牛和其他反芻動(dòng)物，甚至是人類體內(nèi)分離到病原物。男性通過與患病動(dòng)物接觸或通過嚴(yán)重污染的環(huán)境感染牛支原體，可以引起男性生殖道感染，出現(xiàn)睪丸炎、睪丸精囊炎和精液質(zhì)量下降，最后通過精液排毒［17］。1961 年美國(guó)學(xué)者Kressel 等［18］從患乳腺炎的牛乳中分離得到，1976 年報(bào)道該病原與牛呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)。牛支原體不是普遍存在于任何地方，而是廣泛存在于受牛支原體侵襲過或正遭受感染地區(qū)的牛群中［19］。牛支原體通常是通過臨床健康的犢牛和青年牛排出，然后傳染給其他的牛只，并且一旦在多個(gè)年齡段的牛群中傳播，該病原就難以根除，最終導(dǎo)致一些飼養(yǎng)環(huán)境較差和飼養(yǎng)技術(shù)較低的牛發(fā)生呼吸道癥狀，致使牛場(chǎng)發(fā)病率和死亡率增加。被感染的牛只作為主要傳染源，可以通過呼吸道傳播病原長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月甚至幾年［20］。

據(jù)國(guó)外報(bào)道，育肥牛中患牛支原體肺炎的占20%，犢牛的發(fā)病率更低［21］。隨著牛支原體從歐洲傳入愛爾蘭南部和北部地區(qū)，牛支原體引起的肺炎占肺炎疾病總數(shù)的13%～23%［22，23］。在法國(guó)，牛支原體引起的犢牛肺炎占肺炎總數(shù)的30%［24］。在英國(guó)，對(duì)患有肺炎的牛只進(jìn)行血清學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，牛支原體陽(yáng)性率為20%～25%［25］。中國(guó)在1983 年首次報(bào)道從乳房炎牛乳中分離到牛支原體［26］。自2008 年以來(lái)，中國(guó)部分地區(qū)由于從外地引進(jìn)肉牛，暴發(fā)了牛支原體引起的以壞死性肺炎為主要特征的傳染性牛支原體肺炎疫情［27］，后相繼在湖北、貴州、寧夏、內(nèi)蒙古、廣西、重慶等省、市（自治區(qū)）引進(jìn)的犢牛中發(fā)現(xiàn)該病原，犢牛發(fā)病率為50%～100%，病死率高達(dá)10%～50%，給中國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［28-31］。

牛支原體病原體隨動(dòng)物的流動(dòng)傳播到世界許多國(guó)家，其中包括以色列（1964 年）、西班牙（1974年）、澳大利亞（1970 年）、法國(guó)（1974 年）、英國(guó)（1975年）、捷克斯洛伐克（1975 年）、德國(guó)（1977 年），丹麥（1981 年）、瑞士（1983 年）、摩洛哥（1988 年）、朝鮮（1989 年）、巴西（1989 年）、北愛爾蘭（1993 年）、愛爾蘭共和國(guó)（1994 年）、智利（2000 年）、中國(guó)（2008 年）等［32］。已經(jīng)證實(shí)牛支原體除導(dǎo)致牛肺炎、乳腺炎外，還可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、中耳炎、生殖道炎癥、流產(chǎn)與不孕等多種疾病［33-35］。但是，其引起的疾病往往會(huì)被人們所忽視，因?yàn)樵趯?duì)患有肺炎的犢牛進(jìn)行病原學(xué)分離鑒定時(shí)，多殺性巴氏桿菌、嗜血桿菌、溶血曼海姆氏菌和鏈球菌往往首先被分離出來(lái)，而不是牛支原體。牛支原體引起犢牛肺炎癥狀是一個(gè)復(fù)雜的過程，相關(guān)研究者較少［36］，并且，牛群出現(xiàn)肺炎、關(guān)節(jié)炎和乳房炎癥狀并不總是與牛支原體有關(guān)。牛支原體是引發(fā)牛只患肺炎的主要原因和誘發(fā)因素，其感染后可影響宿主防御其他病原體，往往導(dǎo)致病毒性和細(xì)菌性等多種病原體并發(fā)。在死于肺炎的犢牛中，1/3 以上的肺部感染由牛支原體引發(fā)，其余多為牛支原體和其他細(xì)菌性、病毒性病原共同導(dǎo)致。

3 牛支原體病造成的經(jīng)濟(jì)損失

該病在世界范圍內(nèi)廣泛存在。英國(guó)每年約有190.0 萬(wàn)頭牛發(fā)生呼吸道疾病，病牛飼養(yǎng)管理費(fèi)用達(dá)5 400.0 萬(wàn)英鎊［37］，15.7 萬(wàn)頭犢牛死于肺炎和其他相關(guān)疾病，造成9 900.0 萬(wàn)英鎊損失；歐洲國(guó)家病牛總量達(dá)9 000.0 萬(wàn)頭，造成5.76 億歐元損失，其中，至少1/4～1/3 是由牛支原體引起的［38］；美國(guó)牛因感染牛支原體導(dǎo)致體重和胴體重量下降，每年經(jīng)濟(jì)損失在320.0 萬(wàn)美元左右，估計(jì)每年因乳房炎引起的損失達(dá)到1.8 億美元，牛群感染率達(dá)到70%左右［39］。隨著牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，歐洲、亞洲、美洲等地的養(yǎng)牛規(guī)模不斷擴(kuò)大，牛支原體造成的損失無(wú)法估量，而且因?yàn)闆]有疫苗和有效的治療藥物，其根本無(wú)法從牛場(chǎng)清除，造成的水平傳播和垂直傳播情況更為嚴(yán)重。

4 牛支原體病的病程研究

4.1 牛支原體病的發(fā)病過程

牛肺炎主要由牛支原體和巴氏桿菌感染引起，對(duì)感染牛群進(jìn)行分離鑒定發(fā)現(xiàn)，近50%的犢牛可在感染后5 d 開始排毒，第4 周有90%的犢牛開始排毒［40］。10～15 d，因牛支原體感染引起的嚴(yán)重漿液纖維素性肺炎致犢牛死亡率最高，高達(dá)10%。幸存的病牛表現(xiàn)為體重增加緩慢、體溫升高、精神沉郁、食欲不振、發(fā)育遲緩、深度呼吸、呼吸困難、口鼻分泌漿液性分泌物，持續(xù)性咳嗽等臨床癥狀［30-33］。

英國(guó)牛支原體發(fā)病主要從11 月開始，次年1 月達(dá)到發(fā)病高峰，此時(shí)的死亡率最高。部分牛因牛支原體肺炎發(fā)病后未得到有效治療，癥狀持續(xù)至第2年春季，成為第2 年傳染源導(dǎo)致牛支原體繼續(xù)流行［30］。牛支原體引起的關(guān)節(jié)炎是繼乳房炎或呼吸道疾病之后出現(xiàn)的更為嚴(yán)重的疾病。未治療的患乳房炎或肺炎的牛只，牛支原體繼續(xù)侵害機(jī)體，最終引起牛關(guān)節(jié)炎癥狀。患關(guān)節(jié)炎的牛只主要表現(xiàn)為跛行、體溫輕度升高，采食困難而最終衰竭死亡［40］；牛支原體病也可因長(zhǎng)途運(yùn)輸造成的應(yīng)激反應(yīng)而激發(fā)。

中國(guó)牛支原體病的發(fā)生主要從4 月開始，6 月達(dá)到高峰。臨床上，牛支原體感染引起的疾病主要為奶牛乳房炎、犢牛關(guān)節(jié)炎和肺炎。患病牛出現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、咳嗽、結(jié)膜潮紅、關(guān)節(jié)腫大、采食量下降、機(jī)體消瘦、胸部聽診有濕啰音等癥狀。牛支原體入侵牛場(chǎng)2 周即可在牛群中流行，運(yùn)輸刺激、飼養(yǎng)環(huán)境改變以及氣候變化等因素都是誘導(dǎo)牛發(fā)生牛支原體病的因素，中國(guó)牛支原體病的暴發(fā)多與運(yùn)輸有關(guān)，多數(shù)牛在引進(jìn)后7 d 左右開始發(fā)病，部分牛第2 天開始發(fā)病，少數(shù)牛在10 d 左右發(fā)病［33］。

4.2 牛支原體病的病理組織學(xué)變化

對(duì)肺部感染牛支原體的病牛進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)病變部位主要集中在胸腔。病理組織學(xué)可觀察到病牛肺部壞死，間質(zhì)增寬，出現(xiàn)大理石樣病變，肺組織表面分布大小不一的結(jié)節(jié)狀突起病灶，病灶質(zhì)地發(fā)硬無(wú)彈性，淤血、出血，有大小不等的灰白色干酪樣或化膿性壞死灶，支氣管周圍淋巴組織增生導(dǎo)致器官腔減小。肺部病變情況根據(jù)動(dòng)物體質(zhì)的不同而不同，與病程也有一定關(guān)系，往往可以見到肺尖葉、心葉及部分膈葉有化膿灶：肺部甚至出現(xiàn)化膿性壞死或干酪狀病變。胸腔內(nèi)積有渾濁、混有纖維素塊的黃色液體，同時(shí)胸膜也出現(xiàn)增厚現(xiàn)象；胸膜與肺產(chǎn)生黏連；心包積液液體澄清、呈黃色，許多器官出現(xiàn)腫大、出血，尤其是支氣管和淋巴結(jié)。出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀的病牛其關(guān)節(jié)部位往往有積水，積水呈黃色半透明膿血樣的渾濁液體。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)該類牛的肺組織結(jié)構(gòu)消失，部分肺泡腔實(shí)變、塌陷，局灶性肺出血，肺泡腔內(nèi)可見巨噬細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡隔增厚、出血，肺泡內(nèi)有少量脫落的上皮細(xì)胞；肺泡壁斷裂，肺泡腔可見紅色的炎性滲出液，有纖維結(jié)締組織增生［33］。

5 牛支原體疫苗研究

牛支原體病對(duì)中國(guó)乃至世界養(yǎng)牛業(yè)都造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)于該傳染病，預(yù)防措施是關(guān)鍵。除美國(guó)外，幾乎無(wú)商品化疫苗用于預(yù)防牛支原體的感染，且所用牛支原體疫苗大多是全細(xì)胞疫苗，包括滅活疫苗和部分致弱的活疫苗，基本都只能提供暫時(shí)或部分保護(hù)，且具有較嚴(yán)重的副作用［41］。1977年美國(guó)生產(chǎn)的牛支原體疫苗，對(duì)牛支原體引起的牛乳腺炎有一定療效，但對(duì)于牛支原體引起的肺炎、關(guān)節(jié)炎等毫無(wú)作用；而據(jù)1981 年、1987 年牛支原體疫苗保護(hù)性試驗(yàn)，表明該類疫苗對(duì)牛支原體肺炎有一定效果，但疫苗穩(wěn)定性較差，有的疫苗反而會(huì)增加動(dòng)物感染牛支原體的風(fēng)險(xiǎn)［42］。1987 年Barile 等［43］用倉(cāng)鼠對(duì)牛支原體菌苗和福爾馬林滅活苗做了動(dòng)物安全性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2 種疫苗均可治療牛支原體肺炎，但是二者的交互作用無(wú)法辨別。美國(guó)雖然開發(fā)了2 種商品化疫苗，但是2011 年對(duì)2 種疫苗的保護(hù)效果做了測(cè)試，27 d 牛犢免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，一種疫苗可以明顯減少犢牛肺炎的發(fā)病率，但卻不能減少牛支原體性肺炎的發(fā)病率；另外一種疫苗免疫效果不顯著［43-46］。因此，常規(guī)牛支原體疫苗在預(yù)防和治療牛支原體感染上存在著較大缺陷，諸多臨床試驗(yàn)表明常規(guī)疫苗在面對(duì)牛支原體變異方面表現(xiàn)出很大的不足，因此開發(fā)更加科學(xué)、安全、有效且穩(wěn)定的疫苗具有重要意義。

6 牛支原體膜蛋白研究

6.1 P48 蛋白

P48 蛋白是牛支原體的一個(gè)保守蛋白，其變異小，具有種的特異性，是牛支原體主要的免疫原性所在的膜蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)P48 蛋白可能是牛支原體感染后引起免疫調(diào)節(jié)的一個(gè)主要蛋白，與牛支原體的致病機(jī)理有密切關(guān)系［47］。因此，P48 蛋白可以作為一種特異性診斷牛支原體的靶標(biāo)抗原，也是一種致病相關(guān)蛋白。2011 年，中國(guó)完成了牛支原體湖北株的基因組測(cè)序工作并預(yù)測(cè)了許多可能與致病性相關(guān)的基因，其中包括P48 蛋白編碼基因，為開發(fā)有效的牛支原體疫苗提供了支撐。

6.2 P18 蛋白

P18 蛋白具有纖溶酶原結(jié)合活性，可以認(rèn)為該蛋白與其他纖溶酶原結(jié)合蛋白都是一種與M.bovis致病相關(guān)的黏附相關(guān)因子。通過western blot 檢測(cè)，表明該蛋白參與了M.bovis對(duì)牛免疫系統(tǒng)刺激引起的免疫反應(yīng)，即與M.bovis陽(yáng)性血清反應(yīng)時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)的免疫原性，由此認(rèn)為P18 是牛支原體病原侵入機(jī)體致病的蛋白之一，可以利用P18 蛋白作為牛支原體的檢測(cè)抗原進(jìn)行檢測(cè)試劑的開發(fā)［48］。

6.3 24Ku 蛋白

通過雙向電泳對(duì)蛋白進(jìn)行分離時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)24 ku蛋白。在對(duì)這個(gè)24 ku 蛋白的研究過程中發(fā)現(xiàn)，該蛋白通過免疫小鼠獲得多克隆血清，該血清能大幅降低M.bovis對(duì)上皮細(xì)胞的黏附。從而證明了這個(gè)24 ku 蛋白是一種牛支原體的黏附蛋白［49］。

6.4 pMB 67 蛋白

pMB 67 蛋白大約67 ku，具有牛支原體在感染過程中的特異性抗原表位。pMB 67 蛋白不是膜蛋白家族成員，其結(jié)構(gòu)和抗原表位與膜蛋白家族不同，然而，該蛋白與膜蛋白一樣，是一種抗原變異相關(guān)的蛋白［50］。

7 小結(jié)

中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，牛、羊養(yǎng)殖歷史悠久。隨著牛養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，規(guī)模化養(yǎng)殖企業(yè)越來(lái)越多，牛支原體引發(fā)的疾病也屢見不止，導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失難以估量。因此，研發(fā)快速、準(zhǔn)確、靈敏的牛支原體檢測(cè)方法和高效的疫苗，對(duì)該疾病的預(yù)防、診斷、治療和防控具有重要意義。對(duì)牛支原體造成的疾病，引起的主要臨床癥狀、病理變化以及對(duì)該病原體的分離鑒定等方面的研究已經(jīng)較為成熟，但是其主要致病機(jī)制以及主要致病膜蛋白的研究不夠透徹，需要進(jìn)一步對(duì)牛支原體病進(jìn)行深入的研究，以推動(dòng)中國(guó)牛養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。