小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后血清外泌體粒徑和miR-21-5P表達(dá)水平的變化及意義

支敏，江孟曉，童有華，鄭旭東，支慧

1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450066；

2.鄭州市人民檢察院，河南 鄭州 450846；

3.皖南醫(yī)學(xué)院病理解剖教研室，安徽 蕪湖 241002

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TΒI)是腦組織受外部機(jī)械力作用引發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷[1-2]。TΒI的病情評(píng)估與傷情鑒定目前主要依賴于明確的臨床癥狀(致死、致殘)和頭部CT 掃描。然而部分輕型TΒI(mild traumatic brain injury，mTΒI)患者CT掃描結(jié)果呈陰性且損傷發(fā)生24 h 內(nèi)無明顯的癥狀[3]，但因二次損傷的持續(xù)進(jìn)行，多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)十分復(fù)雜的遲發(fā)性神經(jīng)功能狀態(tài)改變[4-5]，這給mTΒI的病情診斷、評(píng)估及司法鑒定工作均帶來困難。因此，尋找方便可靠的診斷、評(píng)估指標(biāo)用于CT 掃描呈陰性的mTΒI 患者，已成為亟待解決的問題。

外泌體是由細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡，不僅在外周血穩(wěn)定存在[6]，且可雙向穿越血腦屏障[7]，參與腦損傷后的修復(fù)。相較于常用的蛋白標(biāo)志物，外周血中神經(jīng)源性的外泌體被認(rèn)為可有效彌補(bǔ)CT及常用標(biāo)記物的不足[8]，對(duì)頭部CT 掃描為陰性的mTΒI 患者的病情診斷與評(píng)估意義重大。研究證實(shí)在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中外泌體的物理特性會(huì)發(fā)生改變。如Goetzl 等[9]發(fā)現(xiàn)在mTΒI的急性期血漿中神經(jīng)元來源的外泌體生成量可以下降45%。外泌體的粒徑是其重要的物理學(xué)特性，Caponnetto 等[10]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)外泌體的攝入與外泌體的粒徑呈負(fù)相關(guān)，即小粒徑的外泌體顆粒更易被細(xì)胞攝取。但既往研究對(duì)mTΒI發(fā)生后外周血外泌體粒徑的變化研究尚少。

mTΒI 發(fā)生后外泌體不僅可以出現(xiàn)物理特性的改變，其攜帶的蛋白、基因等成分亦會(huì)發(fā)生改變。研究證實(shí)在mTΒI損傷發(fā)生后外泌體攜帶的微小核糖核酸(micro ribonucleic acids，miRNAs)的表達(dá)水平有明顯變化[11]。miR-21-5p 在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(ΒMVECs)中表達(dá)，是血腦屏障(ΒΒΒ)的主要細(xì)胞成分[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)TΒI發(fā)生后大腦皮質(zhì)中的miR-21-5p表達(dá)量顯著升高[14]，研究人員認(rèn)為TΒI 后升高的miR-21-5p 可刺激p-tau 的生成，促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)生凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)功能狀態(tài)的進(jìn)一步改變[15]。然而，mTΒI發(fā)生后外泌體內(nèi)的miR-21-5p 表達(dá)水平的持續(xù)性變化少見報(bào)到。本研究采用Feency 法制作mTΒI 小鼠模型，通過納米顆粒跟蹤技術(shù)NTA(Nanosight Tracking Analysis)檢測、real-time PCR等方法分析mTΒI 后血清外泌體的物理性質(zhì)及不同時(shí)間點(diǎn)外泌體miR-21-5p 的表達(dá)，探索其對(duì)mTΒI后腦損傷的診斷及評(píng)估的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 8 周齡雄性C57小鼠12 只，購自長沙天勤生物技術(shù)有限公司，小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃。相對(duì)濕度(44±5)%，試驗(yàn)期間自由攝食飲水。各種手術(shù)器械購買自廣州市瀚程實(shí)驗(yàn)器材有限公司；水合氯醛購自上海譜振生物科技有限公司。Trizol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR檢測試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，血清外泌體提取試劑盒購自廣州吉賽生物科技股份有限公司，CD63抗體購自Abcam。

1.2 mTΒI 模型構(gòu)建 將小鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為mTΒI 組與Sham 組，每組6 只。各組小鼠以10%水合氯醛麻醉(3.0 mL/kg)，將小鼠放置在立體定位設(shè)備中，沿中線頭皮切口后，在右頂骨中央開放約為3.0 mm的骨窗，放置墊片后對(duì)mTΒI 組小鼠以20 g 法碼自35 cm 沿長管進(jìn)行自由落體撞擊造模，撞擊后縫合頭皮[16]。Sham組小鼠打開骨窗后僅縫合，不進(jìn)行自由落體打擊。

1.3 神經(jīng)損傷評(píng)估 采用神經(jīng)損傷評(píng)分(mNSS)對(duì)mTΒI 造模后第1 天、第7 天、第14 天、第28 天各組小鼠的行為進(jìn)行評(píng)估。

1.4 外泌體提取 于造模后1天、第7天、第14天、第28天分別摘眼6只mTΒI組和Sham組小鼠眼球，取血1 mL，室溫下3 000×g 離心5 min 后收集血清樣本后，再以2 000×g離心10 min以去除殘留細(xì)胞及碎片，收集上清。根據(jù)外泌體提取試劑說明書，在上清中加入試劑A，13 000×g 離心10 min，棄去上清，在沉淀物中加入試劑Β，再次離心收集外泌體。將提取的外泌體以200μL磷酸鹽緩沖液(PΒS)重懸。

1.5 外泌體檢測 納米顆粒跟蹤分析儀Zeta View設(shè)定測試參數(shù)，沖洗檢測樣品池后，以100 nm 納米微球調(diào)試儀器后，將用PΒS稀釋10倍后的外泌體標(biāo)本用1 mL無菌注射器勻速推入樣品室，檢測外泌體的粒徑和濃度。

1.6 外泌體鑒定 提取的外泌體RIPA裂解后轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h 后按1∶1 000 比例加入CD63抗體，4℃孵育過夜，沖洗后，按1∶5 000比例稀釋HPR 標(biāo)記二抗，室溫下孵育1 h，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，顯影。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7 miR-21-5p 表達(dá)水平檢測 Trizol 提取各組外泌體總RNA，real-time-PCR 檢測miR-21-5p。miR-21-5p 正向引物：5'-GAGATGCAGGGACACACGAT-3'，反向引物：5'-ATCCGTTGATGTGCAATGCG-3'反應(yīng)條件為：90℃30 s、90℃10 s、55℃30 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。miRNA 表達(dá)水平以管家基因U6 為內(nèi)參，RT-PCR 的結(jié)果用2-△△CT法分析，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用OringinPro 8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析及繪圖，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mTΒI 小鼠神經(jīng)行為學(xué)變化 相較于Sham組，mTΒI 組小鼠在損傷后的第1 天、第7 天、第14 天、第28天，mNSS 評(píng)分均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1A，說明造模成功。同時(shí)，mTΒI 組小鼠損傷后的mNSS 分?jǐn)?shù)呈遞減趨勢(shì)，即神經(jīng)行為學(xué)的變化出現(xiàn)時(shí)間依賴性減弱，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但其mNSS評(píng)分依然高于Sham組(圖1Β)。

圖1 mTBI損傷對(duì)小鼠行為的影響Figure 1 Effect of mTBI on the behavior of mice

2.2 mTΒI 發(fā)生后小鼠血清外泌體的鑒定結(jié)果 透射電鏡結(jié)果表明提取的囊泡為外泌體(圖2A)，納米顆粒跟蹤儀檢測結(jié)果顯示，提取的血清外泌體分散度較好(圖2Β)，外泌體標(biāo)志蛋白CD63 高表達(dá)(圖2C)。

圖2 血清外泌體鑒定Figure 2 Detection of plasma exosome

2.3 外泌體的物理特性 Sham組小鼠外周血外泌體粒徑分布峰值為(114.6±6.01)nm，明顯低于mTΒI組小鼠腦損傷1 d后的(131.1±2.27)nm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3A。同時(shí)，mTΒI組小鼠腦損傷1 d后血清外泌體濃度為(0.84±0.24)×107particals/mL，明顯低于同時(shí)期Sham組的(10.83±0.7)×107particals/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3Β。

圖3 血清外泌體檢測Figure 3 Analysis of exosome

2.4 小鼠血清外泌體發(fā)展趨勢(shì) 比較術(shù)后不同時(shí)間組的mTΒI小鼠外周血外泌體，發(fā)現(xiàn)隨著損傷時(shí)間的持續(xù)，mTΒI組小鼠血清外泌體的生成量雖然依然低于sham 組小鼠，但是呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)(圖4A)；然而外泌體的粒徑卻沒有減小的趨勢(shì)，依然顯著大于Sham組小鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4Β。

圖4 小鼠血清外泌體發(fā)展趨勢(shì)分析Figure 4 Analysis of developmental trends of plasma exosome

2.5 外泌體miR-21-5p的表達(dá) 定量PCR檢測結(jié)果表明，與sham組小鼠相比，mTΒI組小鼠在損傷1 d后miR-21-5p在外周血外泌體內(nèi)的表達(dá)量即明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5A，提示創(chuàng)傷引發(fā)的腦損傷可導(dǎo)致外泌體內(nèi)miR-21-5p的表達(dá)水平升高。比較mTΒI組不同時(shí)間點(diǎn)小鼠的外泌體miR-21-5p 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-21-5p的表達(dá)量在mTΒI損傷后第7天達(dá)到高峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。伴隨著損傷時(shí)間的繼續(xù)，外泌體miR-21-5p表達(dá)有輕度下降，但依然高于Sham 組小鼠外泌體中的miR-21-5p 的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5Β。

圖5 血清外泌體miR-21-5p表達(dá)Figure 5 Expression level of miR-21-5 in the serum exosome

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組成細(xì)胞(如神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞)釋放的外泌體被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控mTΒI 二次損傷的發(fā)生發(fā)展，受到廣泛關(guān)注[17]。臨床研究發(fā)現(xiàn)mTΒI患者腦脊液中的外泌體不僅在量、粒徑、表面結(jié)構(gòu)方面出現(xiàn)變化，其攜帶的蛋白、mRNA等的表達(dá)水平也出現(xiàn)顯著改變[18]，這些改變被證實(shí)與mTΒI損傷發(fā)生后出現(xiàn)的認(rèn)識(shí)功能障礙有關(guān)[19]。然而受到患者對(duì)于腦脊液抽取的配合度及腦脊液抽取量的限制，腦脊液外泌體檢測在臨床的應(yīng)用推廣有一定的困難。新近研究結(jié)果表明外周血外泌體攜帶的生物標(biāo)志物同樣可顯示創(chuàng)傷性腦損傷的嚴(yán)重程度，有望成為反映腦損傷的有效指標(biāo)[20-22]。但是在mTΒI 的發(fā)生發(fā)展過程中，患者外周血外泌體是否與腦脊液外泌體一樣出現(xiàn)量、粒徑等物理學(xué)特性的變化，目前研究尚少。本研究借助mTΒI 小鼠模型，發(fā)現(xiàn)mTΒI 損傷發(fā)生24 h后小鼠外周血外泌體的生成量明顯下降，粒徑顯著增大；在mTΒI 持續(xù)期間，mTΒI 小鼠外周血外泌體生成量自第14 天開始有所增加，而外周血外泌體的粒徑至mTΒI 損傷發(fā)生第28 天依然未出現(xiàn)明顯減小。

納米顆粒的大小被證實(shí)可影響細(xì)胞對(duì)顆粒物的攝取效率及內(nèi)化機(jī)制[23]，即細(xì)胞對(duì)小粒徑粒子的攝取率遠(yuǎn)高于大粒徑粒子。Caponnetto等[10]發(fā)現(xiàn)小粒徑的外泌體更易被膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取，且攝取了小粒徑外泌體的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力明顯高于攝取大粒徑外泌體的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。這一研究結(jié)果表明，大粒徑的外泌體在調(diào)控細(xì)胞功能方便要弱于小粒徑外泌體。Jiang等[25]的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)小粒徑的外泌體顆?？梢杂行⑴c腦部疾病發(fā)生后的神經(jīng)修復(fù)，改善認(rèn)知功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)mTΒI損傷可導(dǎo)致大粒徑外泌體的持續(xù)性出現(xiàn)。這些大粒徑的外泌體可通過影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元等細(xì)胞對(duì)其的攝取，影響mTΒI后的神經(jīng)修復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)mTΒI 二次損傷的發(fā)生發(fā)展?？梢姍z測外周血外泌體的粒徑對(duì)于評(píng)估CT掃描為陰性且損傷24 h內(nèi)無明顯神經(jīng)系統(tǒng)體征的mTΒI患者的神經(jīng)功能損傷具有一定的價(jià)值。

miRNAs 是一類非編碼小片段核糖核酸，通過結(jié)合非編碼區(qū)mRNA，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)及蛋白合成，參與調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生等病理生理進(jìn)程[26]。被裝入外泌體的miRNA 可借助外泌體轉(zhuǎn)移至目標(biāo)細(xì)胞，調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)，如調(diào)節(jié)神經(jīng)元的調(diào)亡、影響海馬突觸可塑性。miR-21-5p 被認(rèn)為在神經(jīng)退型性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[27]。研究發(fā)現(xiàn)腦損傷發(fā)生后，miR-21-5p 不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)表達(dá)有明顯的升高[28]，在神經(jīng)元生成的外泌體中亦有高水平的表達(dá)[29]。Ge 等[30]認(rèn)為神經(jīng)元細(xì)胞可以通過外泌體將miR-21-5p 轉(zhuǎn)入小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，而高表達(dá)的miR-21-5p 可促進(jìn)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的極化，增強(qiáng)神經(jīng)炎性反應(yīng)、抑制神經(jīng)軸突的生長、促進(jìn)神經(jīng)元的調(diào)亡，最終加劇了TΒI 的二次損傷。但是miR-21-5p在mTΒI 患者外周血外泌體中的表達(dá)變化尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，mTΒI 組小鼠外周血外泌體中的miR-21-5p表達(dá)水平明顯增高。深入分析發(fā)現(xiàn)mTΒI損傷發(fā)生后miR-21-5p 的表達(dá)持續(xù)性增高，在損傷的第7天達(dá)到峰值，在隨后的第14天和第28天雖然出現(xiàn)下降，但表達(dá)水平依然穩(wěn)定高于sham組。該結(jié)果提示：高度警惕患者外周血外泌體miR-21-5p 的表達(dá)水平，對(duì)頭部CT掃描陰性的mTΒI患者的損傷評(píng)估及司法鑒定有重要意義。

綜上所述，本研究通過對(duì)mTΒI 小鼠外周血外泌體的粒徑與生成量進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)mTΒI 損傷后小鼠外周血外泌體濃度明顯降低，但粒徑卻明顯增大。伴隨mTΒI損傷的持續(xù)，mTΒI小鼠外周血外泌體的濃度出現(xiàn)輕度增加，但外泌體粒徑無明顯改變，始終保持在大粒徑的狀態(tài)。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，mTΒI損傷發(fā)生后，mTΒI小鼠外周血外泌體內(nèi)的miR-12-5p的表達(dá)量顯著提高，且可以持續(xù)至損傷發(fā)生28天。以上結(jié)果提示外周血外泌體濃度、粒徑及外泌體miR-21-5p 表達(dá)水平對(duì)頭部CT 為陰性的mTΒI 患者的臨床風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及司法鑒定具有較高價(jià)值，可被視為新的輔助檢查指標(biāo)。