染發劑對蠶豆根尖細胞的遺傳毒性研究

＊張樂 胡瀅 宋家璇 左晨陽 劉羽

（延安大學石油工程與環境工程學院 陜西 716000）

染發劑是常見的能改變頭發顏色的日用化妝品，染發劑是否具有致突、致癌和致突變作用，已成為人們普遍關注的問題[1]。目前，市面上的染發劑大多是氧化型染發劑，其主要成分是對苯二胺、間苯二胺等小分子苯胺染料顯色劑H2O2等，雙氧水和對苯二胺均在3類致癌物清單中，易在使用者中引發過敏、皮膚損害及眼損害[2-3]等問題。

微核是真核生物細胞染色體一種異常結構，微核的形成能用來反映環境誘變因子對染色體造成的損傷情況，是常用的遺傳毒理學指標之一[4]。蠶豆的染色體分布均勻、有絲分裂清晰易察，蠶豆根尖微核實驗常被作為研究遺傳毒性的有效實驗，它成本低、周期短、操作簡易、可靠性和靈敏性較高，對于致突變性的檢測十分有效[5]。本實驗通過對染發劑中的對苯二胺和雙氧水的蠶豆根尖微核實驗，以探討其對植物遺傳毒性的影響，并對實際染發劑產品進行安全性評價，為減少環境污染、保護人群健康提供一定的理論依據和數據支撐。

1.材料與方法

(1)材料、試劑及儀器

實驗材料：青皮蠶豆。

實驗試劑：對苯二胺、偏重亞硫酸鈉、鹽酸、活性炭、堿性品紅、無水乙醇、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、冰醋酸、四種市售染發劑。

實驗儀器：恒溫培養箱；紫外分光光度計；奧林巴斯顯微鏡；電熱鼓風干燥箱；臺式高速離心機；水浴鍋；震蕩器。

(2)實驗方法

實驗采用青皮蠶豆為原料，對苯二胺實驗是使用質量濃度為3mg/L～1700mg/L的對苯二胺來對蠶豆根尖進行染毒處理；雙氧水實驗是使用質量分數為0.05%～12.5%的雙氧水來對蠶豆根尖進行染毒處理；蒸餾水作為對照組進行的蠶豆根尖染毒處理。

①蠶豆根尖的浸種、催根及染毒

浸種、催根過程：青皮蠶豆種子在25℃環境下濕潤的脫脂棉中浸種、催芽，直到蠶豆根尖長到2.00～3.00cm為止。分別配置好不同濃度的對苯二胺和雙氧水溶液置于三角瓶中，選取3～6粒蠶豆幼苗浸染5h。四種染發劑按照配方進行均勻混合，對四組真發進行染色處理，頭發長度約為30cm，質量20g，染發操作后用水沖洗，清洗后置入三角瓶中加水至250mL，取3～6粒根尖生長狀況大致相同的蠶豆幼苗置于其中。

②根尖細胞的恢復培養及固定

染毒后的種子清洗后重新置于濕潤的脫脂棉中恢復培養24h左右，從根尖頂端切取1cm長的幼根，加卡諾氏固定液固定24h。

③孚爾根染色、制片和鏡檢

將固定好的幼根分別用蒸餾水浸洗，HCl溶液水浴，使蠶豆根尖軟化后再次清洗，利用席夫試劑染色，再用SO2洗滌液浸洗根尖，清洗后4℃保存。取2mm左右的根尖搗碎制片，找到細胞分散均勻、清晰的部位，400倍觀察，在不同部位數出根尖有絲分裂數、微核數[6]。

④脂質過氧化（MDA）的檢測

蠶豆根尖細胞的脂質過氧化丙二醛的測定采用分光光度法進行[6]。

(3)分析方法

每個實驗組至少觀察3個制片，每個制片觀察1000個細胞，觀察微核形成及有絲分裂情況，統計微核數目，計算微核率（MCN‰）、微核指數和有絲分裂指數（MI%）。MCN為觀測到的含微核細胞數占觀察到的細胞總數（1000個）的比例；微核指數為試驗樣本的微核率與對照樣本的微核率，本實驗對照組為蒸餾水；有絲分裂指數（MI）為100個細胞中含有的有絲分裂數目；MDA為蠶豆根尖細胞膜脂質過氧化最終產物丙二醛的含量。

計算方法如下：

MCN‰=（某測試樣片的MCN數÷某測試樣品觀察到的細胞總數）×1000‰

MI%=（某測試樣片的有絲分裂發生數÷某測試樣片觀察到的細胞總數）×100%

MDA的含量（μmol/g）=C×V×10-3/W

C（μmol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450

實驗結果用EXCEL計算平均值和標準偏差，繪制曲線圖，采用SPSS17.0軟件對數據進行單因素方差分析。

2.結果與討論

(1)四種市售染發劑蠶豆根尖細胞毒性實驗

選擇市售不同價位的四種染發劑對真發進行染色處理，選取處理后的頭發放入到培養蠶豆根尖細胞的水溶液中，考察對蠶豆根尖細胞的影響。

從表1中可以看出四種染發劑處理后的頭發蠶豆根尖細胞微核指數分別為3.12、2.83、1.13和1.39，微核形態如圖1所示，同時有絲分裂指數明顯下降。細胞內活性氧含量迅速增加，導致脂質過氧化物水平迅速提高，對生物體的正常生理功能造成影響。染發劑的脂質過氧化物含量也比對照組明顯提高，說明因為染發劑中存在大量化學物質，這些化學物質會產生毒性作用，細胞機體正常形成受到影響。實驗中選用的四種染發劑存在價格梯度為A＞C＞D＞B，而毒性效果由強到弱為A＞B＞D＞C，可見染發劑植物毒性與其售價關系不大，許多研究也表明染發劑會誘發頭皮毛囊退化或其他皮膚問題。

圖1 細胞微核形態

表1 4種染發劑誘導下蠶豆根尖細胞的MI、MCN及MDA的變化

(2)雙氧水處理分析

雙氧水是染發劑中的主要成分，觀察不同質量分數的雙氧水對蠶豆根尖細胞毒性的影響。由圖2可知，空白對照的MCN在（6.07±1.74）‰，雙氧水質量分數在0～3%的范圍內的蠶豆MCN呈現明顯的升高趨勢，雙氧水質量分數為3%時，MCN為（16.83±2.4）‰，達到峰值，當雙氧水質量分數大于3%之后，MCN明顯下跌后趨于平緩。雙氧水質量分數小于3%時蠶豆根尖經過染毒后顏色赤紅，并隨著濃度的增加而加深，但是整個根尖仍存在韌性和柔軟性，恢復培養后有白色嫩芽長出，雙氧水質量分數在3%之后的根尖明顯發黑變硬，恢復培養后根尖生長扭曲，且短小，出現部分壞種。雙氧水質量分數大于12.5%以后根尖完全變黑變硬。MCN在雙氧水質量分數為5%～12.5%范圍內和空白對照組沒有顯著性差異，是因為過高濃度的雙氧水對蠶豆根尖起到的嚴重抑制和損害作用已經完全大于植物本身的生長的能力，因此MCN因為生長抑制而變小。

圖2 雙氧水對蠶豆根尖MCN和MDA的影響

圖中MDA隨著雙氧水質量分數變化的曲線，也表現出3%為峰值的前漲后跌，峰值為（3.87±0.37）μmol/g。實驗中蠶豆生長狀態相對應，數值變化趨勢也可以看出MCN與MDA存在著一定的相關性。應用SPSS的雙尾分析可知皮爾遜相關系數為0.868**.在0.01級別（雙尾），相關性顯著。

(3)對苯二胺數據分析

對苯二胺是染發劑中最常添加的物質之一，本實驗觀察不同質量濃度的對苯二胺對蠶豆根尖細胞毒性的影響。

由圖3可知，蠶豆根尖的MCN值隨著對苯二胺質量濃度的增大先增大再減小，150mg/L時MCN達到最大值17.74±2.71‰，對苯二胺質量濃度小于46mg/L時，蠶豆經過染毒之后根尖發灰，但是恢復培養后生長良好，當對苯二胺質量濃度大于75mg/L時，濃度增大根尖顏色逐漸變黑變硬，恢復培養后生長扭曲，當質量濃度達到1700mg/L時有一半的根尖細胞死亡。數據顯示對苯二胺質量濃度在1200mg/L～1700mg/L時MCN值與空白和低濃度的差異顯著性不大，其原因與雙氧水染毒過程相同，均為蠶豆根尖產生的嚴重生長抑制使微核率明顯減少，而非毒性降低所致。

圖3 對苯二胺對蠶豆根尖MCN和MDA的影響

MDA數據的變化趨勢與MCN相似，最大值出現在對苯二胺質量濃度為150mg/L時，此時MDA濃度為（3.68±0.42）μmol/g，MDA與MCN二者之間進行雙尾分析后發現兩者同樣有0.01級別的顯著的相關性。研究表明當環境中存在誘變劑時，逆境會對植物造成明顯損傷，而植物也會同時形成對逆境的適應性，并產生抵抗力[7]。

3.結論

（1）市售四種染發劑蠶豆根尖細胞實驗表明，染發劑實驗結果與空白對照的差異存在顯著性，說明染發劑具有一定的植物毒性。

（2）在對苯二胺質量濃度和雙氧水質量分數分別為150mg/L和3%時，MCN達到最高,對應值為（16.83±2.4）‰和（17.74±2.71）‰，MDA也達到峰值，分別為（3.68±0.42）μmol/g和（3.87±0.37）μmol/g，并且和空白對照組呈現顯著性差異，MDA與MCN存在顯著相關性。

（3）隨著污染物濃度的增大，MDA與MCN均因為毒性物質嚴重的生物抑制而導致數值下降，可結合蠶豆根尖細胞生長狀況及硬化、死亡率最終判斷毒性大小。